Annexin V-FITC-PI Apoptosis Detection Kit细胞凋亡.pdf

使用说明书Vazyme biotech co.,销售/sales:技术支持/technical support:Vazyme Biotech Co.,LtdApoptosis Detection KitAnnexin V-FITC产品概要 产品组成 贮藏与保质期 实验方案 样品染色 样品分析 参考实例：流式细胞仪检测TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡操作注意事项 常见问题与解决方案 01/02在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为3536 kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的细胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行绿色荧光（FITC或EGFP）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（Annexin V+/PI-）；右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞，为（Annexin V+/PI+）。本试剂盒所有组分均在4-8C 保存，长期不用可将Annexin V-FITC放-20C保存。1/产品概要3/贮藏与保质期2/产品组成组 分 A211-01(50 rxn)A211-02(100 rxn)Annexin V-FITCPI Staining Solution1 Binding Buffer250 l250 l25 ml250 l 2250 l 225 ml 2Catalog目 录03/044/实验方案5/参考实例：流式细胞仪检测TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡4.1 样品染色4.2 样品分析A.流式细胞仪分析：激发波长为488 nm；FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。用CellQuest等软件进行分析：绘制双色散点图(two-color dot plot)，FL1为横坐标，FL3为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中细胞可以分成三个亚群：活细胞仅有很低强度的背景荧光；早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光；晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。1.悬浮细胞：300 g,4C离心5 min收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g,4C离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。2.用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300 g,4C离心5 min。收集15105细胞。3.加入100 l 1 Binding Buffer重悬细胞。4.加入5 l Annexin V-FITC和5 l PI Staining Solution,轻轻混匀。5.避光、室温反应10 min。6.加入400 l 1 Binding Buffer,混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。注意：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。用凋亡诱导剂TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)诱导Jurkat T淋巴瘤细胞凋亡，诱导剂的浓度为0、0.5、1.5、4.5、13.5 ng/ml，分别诱导3h后，参照第4节操作方法，用流式细胞仪检测结果见下图。(A)0 ng/ml.(B)0.5 ng/ml.(C)1.5 ng/ml.(D)4.5 ng/ml.(E)13.5 ng/ml TRAIL.(F)竞争封闭实验，采用13.5 ng/ml TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡3小时后，加入10 g未标记的Annexin V封闭10分钟，再用Annexin V-FITC/PI染色。未标记的Annexin V可以竞争Annexin V-FITC，证明了染色的特异性。6/操作注意事项1.由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。2.对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应尽量不用EDTA，EDTA影响Annexin V与PS的结合。3.实验中如需要固定细胞，比如在检测凋亡的同时检测细胞周期，只能选用Annexin V-FITC，不能选用Annexin V-EGFP，因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育，并用Binding Buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加并会产生细胞碎片，可以和Annexin V结合，对结果产生干扰。4.如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。5.试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。6.Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。B.荧光显微镜分析：滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。注：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。05/067/常见问题与解决方案Q.Annexin V-FITC染色不上或者阳性率偏低。A.首先要确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。Annexin V-FITC染色不上，实验操作中最常见的原因是贴壁细胞消化不当引起的。Annexin V跟PS的结合需要Ca2+离子，Binding Buffer中含有2.5 mM的Ca2+，EDTA的消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶。细胞离心用冷PBS洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀。Binding Buffer的瓶盖要紧闭，空气中的CO2进入后形成CaCO3会产生沉淀，减少游离的Ca2+，导致实验的失败，污染其他的缓冲液如吸取PBS后不更换Tip头也会导致游离的Ca2+的减少。一些细胞其细胞膜上PS的密度较低，染色效果很差，此时建议更换细胞株或者采用TUNEL法检测凋亡。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。Q.假阳性。A.实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验；另一可能是细胞操作不当引起，尤其是贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致破坏细胞膜，使得假阳性偏高。此外，一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上；诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。