大鼠颅骨缺损模型在骨组织工程中的应用.pdf

中国美容医学 2009 年 5 月第 18 卷第 5 期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.May.2009.Vol.18.No.5综述目前，颅、颌面骨缺损的修复对于整形外科和口腔颌面外科的治疗仍是挑战 1。用于修复骨缺损的骨移植材料若想应用于临床，必须要具备可充分提高体内骨愈合能力的组织学证据，而通过不同方法将不同的骨移植材料进行动物实验不失为一种行之有效的检测方法。但如果在实验动物模型的选择上缺乏一致性，则很难客观地比较各种移植物之间的修复效果，只有采用标准动物模型才能有效地对其效果进行评估 2。颅骨因缺少肌肉组织，血液供应及骨再生能力均较差 3，所以可用于进行骨缺损部位骨移植材料修复效果的分析。此外，大部分哺乳动物的颅、颌面骨都是膜性化骨，胚胎起源相似，因此大鼠颅骨缺损模型已成为骨组织工程体内实验的理想选择对象。1 大鼠颅骨缺损模型1.1大鼠种系和年龄：实验选用的大鼠按是否具有免疫能力可分为具有正常免疫能力的大鼠（如：W i s t a r、S D 大鼠等）和缺乏免疫能力的裸大鼠两种。在开展异种移植实验时，裸大鼠拥有独特的优势。但裸大鼠的骨再生能力较低，这是因为在骨创伤的修复过程中机体可由于出现免疫抑制而造成某种调节正常骨愈合的关键性细胞和分子信号的缺乏，进而导致成骨减少 4-5。骨修复能力随年龄的增长而逐渐降低，但幼年的成骨能力又太强，所以在建立大鼠颅骨缺损动物模型时应选用成年大鼠 2,3,6。A a l a m i 等 7 在 6 天和 6 0 天龄大鼠的颅骨上分别制备了直径 3 m m、4 m m 和 5 m m 的骨缺损，结果显示：6 天龄比 6 0 天龄大鼠具有更强的骨修复能力，成年大鼠的颅骨缺损修复面积不到5%，而幼鼠修复了大部分的骨缺损。由此可见，用于颅骨缺损模型的大鼠年龄应选择至少在 8 周龄（即 5 6 天龄）以上。1.2大鼠颅骨的标准骨缺损和大鼠的动物实验周期：标准骨缺损（c r i t i c a ls i z ed e f e c t,C S D）是指在特定动物种系的特定骨创伤部位，无法实现自发性修复的临界骨缺损范围 3,8。最初，T a k a g i 等 6 制备了直径 8 m m 的大鼠颅骨缺损，经 1 2 周的观察后未发现缺损区出现骨组织再生，因此认为直径 8 m m 为大鼠颅骨的 C S D。S c h m i t z等 3 在关于颅、颌面标准骨缺损动物模型的综述中也进一步指出了大鼠颅骨的 C S D 是直径 8 m m。但因直径 8 m m 的骨缺损需在大鼠的顶骨中央区制备，所以易损伤矢状窦，导致术中的出血概率增加及术后的血液供应破坏，同时矢状缝附近的结缔组织中存在骨祖细胞，此部位的骨组织损伤后可参与骨重建，这些因素均能对骨缺损修复的评价效果产生重要影响。此外，1 只大鼠只能制备 1 个颅骨缺损动物模型，而且无法完成同一动物的体内对照实验，这就相应增加了实验动物的数量、实验的成本及劳动量。1 9 9 8 年，B o s c h 等 2 经过对大鼠颅骨缺损进行 1 2 个月的观察研究后指出：直径 5 m m可作为大鼠颅骨的 C S D。B l a n q u a e r t 等 8 也在对直径 5 m m 的大鼠颅骨缺损实验中发现，骨缺损区在 3 5 天后只有纤维组织生成，骨缺损边缘仅可见少量的新骨形成。对于直径小于 5 m m 的大鼠颅骨缺损动物模型的研究也早有相关报道。F r e e m a n 等 9 和 T u r n b u l l 等 1 0 的实验中制备了直径 2 m m 的大鼠颅骨缺损，经 1 2 周的实验观察均未见新骨形成。M u l l i k e n 等 1 1 和 G l o w a c k i 等 1 2 制备了直径 4 m m 的大鼠颅骨缺损动物模型，6 个月后也都未出现明显的骨愈合迹象。但上述的实验研究在制备大鼠颅骨缺损的过程中都进行了实验区的骨膜去除，这可能是造成出现即使直径 2 m m 的大鼠颅骨缺损也无法自行愈合的原因。由此可见，在颅骨缺损的动物实验过程中应注意骨膜层的缝合保护。随后，直径 6、7、8.5 m m的大鼠颅骨缺损的相关实验 1 2-1 6 也陆续出现。但不管怎样，对大鼠颅骨而言，制备双侧颅骨缺损的范围不应大于直径 6 m m，直径在 7 m m 以上的骨缺损则只能选择在顶骨中央区进行。这就表明，将直径小于或大于 5 m m 作为大鼠颅骨的 C S D，或者没有必要，或者存在上述诸多的不足之处，因此将直径 5 m m 作为大鼠颅骨的 C S D 是最为理想的。大鼠颅骨 C S D 的实验周期应为 8 周，这是因为颅骨自身修复的最佳时期是在前 4 周，到第 8 周时修复过程已基本停止 1 7。A a l a m i 等 7 的研究指出：8 周的实验周期完全可以满足成年大鼠颅骨 C S D 的修复重建。1.3大鼠颅骨缺损修复的原理：W a n g 等 1 8 在用醋酸纤维素膜覆盖直径 8 m m 的大鼠颅骨缺损边缘后发现：硬脑膜在骨缺损的修复过程中起主要作用，而缺损区边缘骨的修复效果不明显。但 M a r d a s 等 1 9 却在实验中得出了截然相反的结论，他们用聚四氟乙烯膜（e-p o l y t e t r a f i u o r o e t h y l e n e,e-P T F E）覆盖直径 5 m m 的大鼠颅骨缺损的大脑侧和皮下组织侧，结果成功地实现了缺损部位的骨重建，由此认为在骨修复过程中应以缺损区基金项目：北京市科技计划（H 0 6 0 9 2 0 0 5 1 2 3 0）通讯作者：曹谊林，主任医师，教授，博士研究生导师；主要研究方向：组织工程；E-m a i l:y i l i n c a o y a h o o.c o m 综述 大鼠颅骨缺损模型在骨组织工程中的应用The application of model of bone defect on the skull of rat in bone tissue engineering尹宏宇1综述，崔磊2,3曹谊林1,2,3审校（1.中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心北京1 0 0 0 4 1；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海2 0 0 0 1 1；3.上海组织工程研究与开发中心上海2 0 0 2 3 4）727中国美容医学 2009 年 5 月第 18 卷第 5 期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.May.2009.Vol.18.No.5边缘骨的修复作用为主。出现上述差异的原因可能是 e-P T F E为可渗透性膜，其多孔性可作为细胞迁移的支架和生长因子扩散的通道，而无法做到醋酸纤维素膜的完全阻断作用，也就不能阻止硬脑膜中的生长因子和间充质干细胞参与颅骨缺损的修复，因此并不能证明颅骨缺损重建是以边缘骨的修复作用为主。由于诱导成骨的间充质干细胞主要来源于硬脑膜，而在缺损区边缘骨中则相对缺乏，所以尽管边缘骨具有骨传导作用，但骨修复能力很有限。然而边缘骨中的正常骨细胞可分泌骨生长因子，诱导硬脑膜中的间充质干细胞向颅骨缺损部位迁移和分化，促进成骨。由此可见，颅骨缺损的修复最终是以硬脑膜的骨诱导作用为主 1 8,2 0，而以缺损区边缘骨的骨传导作用为辅，因此保持硬脑膜的完整性是非常重要的。2 骨组织工程目前，骨移植材料主要分为 3类：自体骨、异体骨和组织工程化骨。目前，自体骨仍是临床上骨缺损修复应用最广泛的骨移植材料。但自体骨移植还存在以下问题：来源有限；不能随意切取塑形；造成供骨区较大创伤及术后并发症；术后无法预测骨吸收量 1 1。因此，为了解决自体骨移植所带来的这些问题，各种骨替代材料相继被研制开发出来，例如，同种异体骨、异种骨和人工骨等，但也都不可避免的存在着不同程度的植骨成活率较低、易导致免疫排斥反应或出现传染性疾病等缺陷，难以满足临床需要。随着骨组织工程学的发展，彻底改变了骨缺损的传统治疗模式，利用组织工程技术构建的组织工程化骨，在克服上述诸多骨移植材料不足之处的基础上，为最终实现无创伤性修复和真正意义上的功能重建开辟了新的途径，在非完全必要性的自体骨移植情况下具有明显的优势 2 1，势必将成为一种非常理想的骨移植材料。骨组织工程研究的核心内容主要包括种子细胞、支架材料和生长因子，这也是构建组织工程化骨的重要组成部分。2.1种子细胞：近来，理想种子细胞的来源问题成为骨组织工程研究的热点。胚胎干细胞（e m b r y o n i cs t e mc e l l,E C）虽然可作为获取种子细胞的途径之一，但由于很难获得完全纯化的特定细胞系，在体内易形成畸胎瘤，而且伦理学问题尚有待解决，真正用于骨组织工程还不太现实，还需进一步的深入研究。成体干细胞中，骨髓基质干细胞（b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s,B M S C s）因其具有多向分化潜能 2 2,2 3 和强大的增殖扩增能力，以及取材简单等生物学特性，成为目前骨组织工程中最主要的种子细胞来源 2 2,2 4,2 5。S i k a v i t s a s 等 2 0 用成骨诱导的鼠 B M S C s 复合钛网支架成功的实现了直径 8 m m 的大鼠颅骨缺损的修复。K a i g l e r 等 1 6 将人 B M S C s 单独或联合人真皮微血 管 内 皮 细 胞 复 合 聚 乳 酸/乙 醇 酸 共 聚 物（p o l y-l a c t i d e-c o-g l y c o l i d e,P L G A）修复了直径 8.5 m m 的裸大鼠颅骨缺损，而且实验中联合组的骨形成量明显更多。此外，成体干细胞中的脂肪干细胞（a d i p o s ed e r i v e ds t e mc e l l s,A D S C s）也具有体外成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等分化的多向分化潜能 2 6，而且来源更为广泛，组织含量丰富，培养条件简单，扩增能力较强，是骨组织工程中具有较大发展潜能的种子细胞来源。但直接获取 B M S C s 或 A D S C s 可产生疼痛，并有引起并发症及感染的危险，故从血液中获取干细胞可能将是一种更理想的方法。为此，C h i m 等 1 3 用 F i c o l l 密度梯度离心法从人外周静脉血中获取单个核细胞，经成骨诱导后复合聚羧基乙酸内酯修复了直径 6m m 的裸大鼠颅骨缺损。2.2支架材料：用于骨组织工程的支架材料种类众多，如：羟基磷灰石，珊瑚，-磷酸三钙，脱钙骨（d e m i n e r a l i z e db o n em a t r i x,D B M）等。D B M 是经酸处理去除大部分的矿化成分，但保留了生长因子等蛋白质 1 9 的骨组织，来源充足 2 7，且具有良好的组织相容性、骨传导和骨诱导特性 1 0，是一种良好的支架材料，同时也是进行骨组织工程实验研究重要的支架材料。D B M的加工过程和供体差异均可导致其骨诱导活性发生改变，影响因素主要包括颗粒大小、取骨时间和供体年龄等。为了提高D B M 的活性，常将其与各种天然和人工惰性材料（硫酸钙、甘油、纤维酸、透明质酸和牛明胶等）载体组合形成复合材料，以便于临床操作和移植复合物的固位稳定，并可防止冲洗或出血时 D B M 的冲脱。但加入载体后必然会引起 D B M 颗粒含量的减少，而且载体与 D B M 生物活性分子的粘结还可阻止促进骨愈合的细胞和相关细胞因子之间的相互作用，影响诸如骨形态发生蛋白（b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s,B M P）、血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子等促进骨形成的生长因子的释放 5,1 7,1 9，最终导致 D B M 的活性降低。为此，M h a w i 等 1 7 应用一种新的 D B M 材料（A c c e l lD B M 1 0 0），该材料是直接将 D B M 作为D B M颗粒的载体，使 A c c e l lD B M 1 0 0的 D B M成分含量达到1 0 0，结果成功修复了直径 5 m m 的裸大鼠颅骨缺损，证明A c c e l lD B M 1 0 0 可实现骨缺损的重建。同样，Q i u 等 1 9 也应用了一种新的人脱细胞真皮基质（a c e l l u l a rh u m a nd e r m a lm a t r i x,A M）载体，利用 D B M/A M 在直径 5 m m 的裸大鼠颅骨缺损实验中获得了理想的成骨效果。2.3生长因子：自 U r i s t 2 8 从牛骨中提取出 B M P 并诱导实现了裸小鼠的皮下异位成骨以来，至今 B M P 在骨形成过程中的重要作用已得到普遍公认。B M P 共有两种应用：液体注射法和材料负载法。液体注射法在体内的扩散稀释速度过快，在尚未表达诱导能力之前 B M P 即可被渗出的组织液冲淡。而材料负载法则有助于将 B M P 固定在受植区，使 B M P 能高浓度、长时间的缓慢释放，以保持 B M P 的成骨活性。胶原就是一种优良的负载材料，但因处理困难和具有免疫原性而限制了其在临床中的实际应用。L u t o l f 等 2 9 构建了一种聚乙二醇水凝胶，负载重组人B M P-2（r e c o m b i n a n th u m a nb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n-2,r h B M P-2）后用于修复直径 8 m m 的大鼠颅骨缺损，实验结果表明此复合物具有与胶原海绵负载 r h B M P-2 相同的成骨效果。C o w a n 等 3 0 将负载不同浓度的 r h B M P-2 的 P L G A 移植于直径 5 m m 的大鼠颅骨缺损部位，结果显示：缺损区的骨修复对 r h B M P-2 呈现剂量依赖性，但这种依赖性只影响骨修复的面积，与体积无关。728中国美容医学 2009 年 5 月第 18 卷第 5 期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.May.2009.Vol.18.No.5综述3 结语大鼠颅骨缺损是骨组织工程理想的实验动物模型，而在进行异种移植的组织工程化骨实验时，裸大鼠为首选的实验对象；双侧直径 5 m m 的骨缺损是最佳的大鼠颅骨 C S D；B M S C s 或A D S C s 复合 D B M 将是构建组织工程化骨的一种理想方案。参考文献1Toriumi DM,Robertson K.Bone inductive biomaterials in facialplasticandreconstructivesurgeryJ.FacialPlastSurg,1993,9(1):29-36.2Bosch C,Melsen B,Vargervik K.Importance of the critical-size bonedefect in testing bone-regenerating materials J.J Craniofac Surg,1998,9(4):310-316.3Schmitz JP,Hollinger JO.The critical size defect as an experimentalmodelforcraniomandibulofacialnonunions J.ClinOrthopRelatRes,1986,(205):299-308.4Winn SR,Schmitt JM,Buck D,et al.Tissue-engineered bonebiomimetictoregenerate calvarial critical-sized defectsin athymic ratsJ.JBiomedMaterRes,1999,45(4):414-421.5Acarturk TO,Hollinger JO.Commercially available demineralizedbone matrix compositions to 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修回日期2009-02-09编辑/张惠娟729