选修实验：细菌培养技术.doc

实验三：学习细菌培养的基本技术
实验原理：①要根据微生物的营养需要，采用相应的配方配制培养基。
②培养基除满足微生物所需各种营养外，还要适宜的pH值。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基应用广泛，适于多种细菌的培养。
④配置好的培养基必须经过灭菌，一般采用高压蒸汽灭菌。在整个细菌接种培养过程中，一般要求无菌操作。
棉塞能防止杂菌污染,保证通气良好
方法步骤：
一、培养基的配制
称量 è 溶化 è 调pH值 è 培养基的分装 è 加棉塞 è 包扎
加水加热 边滴边搅拌 趁热分装 棉塞长度2/3在内 外加牛皮纸
随时用测pH值 培养基高度为1/5 挂上标签
二、灭菌 高压蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。
灭菌原理:依据高压升温使菌体细胞蛋白质凝固变性失去生命力,将0.11MPa、121oC,维持30min彻底灭菌
操作：加水、装料 è 加热、排气 è 升压、保压 è 降压、排气
加开水适当,试管 打开排气阀,加热至沸腾 压力至0.11MPa,T为121oC 压力降至0,
口向上,不能太挤 排气5～10min,关闭 控制热源，保压30min T<100oC开阀
三、搁置斜面
当T接近50oC，将试管摆在一根木棒上。培养基形成的斜面不超过试管总长度的一半。
四、接种 微生物接种的各项操作要求必须在无菌条件下进行。
①设备的准备和消毒： 设备：无菌操作箱(无条件可直接在在酒精灯上)，接种环
双手 75％酒精消毒 熏蒸法或紫外灯灭菌 灼烧法消毒
②采菌：点燃酒精灯è用左手并排拿起有菌种的试管和培养试管è靠近酒精灯火焰,旋松棉塞è右手拿接种环,在火焰上烧红灭菌è取下棉塞，并灼烧试管口一周è接种环伸入试管，挑去少量菌体，立即抽出
③接种：迅速将接种环插入培养试管中è在斜面上由管底向管口连续轻划几道蛇形曲线
（画线要求：线要划密一些,不要划破培养基,不要使接种环接触到管壁或管口,不重复划）
è及时抽出接种环è将试管口在火焰上灼烧，塞上棉塞è熄灭酒精灯,菌种加热倒掉
五、保温培养 接种后，试管放在保温箱中，25oC下培养5～7天(37oC下培养24h)

练习：
一、选择题
1、下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ）
A、防止杂菌污染 B、消灭杂菌 C、培养基和发酵设备都必须灭菌 D、灭菌必须在接种前
2、制作细菌培养基时，pH值应调为（ ）
A、4.5～6 B、7.4～7.6 C、7.8～8 D、2～4
3、下面的资料表明在各种培养基中细菌的生长（S、C、M为简单培养基，U、V、X、Y、Z代表加入培养基的不同物质），问哪一些物质细菌不能合成（ ）
培养基
S、C、M
S、C、M+V+Z
S、C、M+U+Y
S、C、M+Z+X
S、C、M+V+Y
S、C、M+U+X
S、C、M+Y+Z
生长状况
－
－
＋
－
＋
－
＋
A、U B、V C、Y D、Z
4、细菌培养基常在121o C压力锅中灭菌，如果只是在100oC的温度下降细菌培养基灭菌，以下哪一种生物仍会存活（ ）
A、大肠杆菌 B、一种青霉 C、枯草芽孢杆菌 D、沙门氏菌
5、下列操作与灭菌无关的是（ ）
A、接种前用火焰灼烧接种环 B、接种前用酒精擦拭双手
C、培养基在50oC时搁置斜面 D、接种在酒精灯的火焰旁完成
6、培养基分装完毕以后，在管口上加一棉塞，下图中哪种加棉塞的操作是正确的（ ）
7、在用高压蒸汽锅灭菌时，其灭菌的正常压力为（ ）
A、49KPa B、98KPa C、9800KPa D、9.8KPa
8、高温灭菌的原理是（ ）
A、每种微生物生长的最适温度是一定的
B、微生物对于高温环境部适应
C、高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
D、高温降低了环境中氧的浓度
9、在培养基的配制过程中，下列哪项操作是不正确的（ ）
A、趁热降培养基分装到洁净的试管中，培养基高度为试管长度的1/5
B、在溶化过程的最后要补加蒸馏水至100mL
C、在调pH值时要随时用pH试纸测pH
D、试管加塞后，每10支用绳扎捆，在试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名，就可以进行灭菌
10、在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是（ ）
①用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上成水平状态②右手拧送棉塞，但不取下
③在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞，将它们取下，同时左腕转动，烧灼管口一周。
④将接种环伸入管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。
⑤右手拿接种环，在火焰上灼烧灭菌。
⑥在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到培养基的底部，由里向外轻轻画蛇形细线。
⑦抽出接种环，再用火焰烧灼管口，并在火焰上方将棉塞塞上。
A、①②③④⑤⑥⑦ B、①②⑤③④⑥⑦ C、①③②④⑤⑥⑦ D、②③①④⑤⑥⑦
11、下列有关碳源的叙述不正确的是（ ）
A、 碳源主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物
B、某些碳源可以作为微生物的主要能源物质
C、蛋白质一定不能做碳源
D、不同种类的微生物的碳源可能不同
12、细菌数目上升的最快时期和活菌数目的高峰期分别是（ ）
A、对数期、稳定期 B、稳定期、稳定期 C、对数期、对数期 D、稳定期、对数期
13、菌种鉴定的重要依据是（ ）
A、细菌的大小、性状颜色 B、菌落的大小、形状、颜色 C、有无鞭毛 D、培养基的不同
二、简答题
1、为使培养基呈固体状态，需要配置好的各营养液成分的液体里加入 ，溶化冷却即可。调节培养基的pH值，用浓度为1mol/L的 或 溶液进行调节。
2、搁置斜面时培养基温度不能 ，否则培养基会变成 。应趁热将试管放置成斜面形，使管内培养基形成斜面的长度不超过试管总长的 。
3、微生物接种时各项操作必须在 条件下进行。因此必须在 中操作。接种环要在
上用灼烧法灭菌，双手用 ％的酒精消毒。接种时将灭菌的接种环挑去一点 ，迅速插入培养基试管里，在斜面上由 向 连续划几道 线，然后将试管口在火焰上灼烧，塞上 。接种后的试管要放入 箱中在 下培养，即可见斜面上出现 。
4、关于水污染对生物的影响的实验如右图所示，将放置一天的洗碗水、河水、自来水各5mL，分别注入1～3号试管中。再各滴加几滴0.01%亚甲基蓝溶液。把上述试管在温暖环境中放置40min后，1号试管内水样由蓝色变为无色，2号试管内水样变为浅蓝色，3号试管内水样的颜色无变化。请回答：
（1）在1号、2号试管内水样中大量繁殖的生物是 。
（2）上述生物的数量与水样中的 含量成正比。
（3）1号、2号试管内水样变色的原因是
。
5、以下是一个证明食物腐败是由细菌引起的实验，阅读材料和图示，回答相关的问题。
①把碎肉或大豆加水煮烂，用两次纱布滤取肉（豆）汤备用。
②在3只三角烧瓶里各注入50mL肉（豆）汤。第1个瓶不同瓶塞，第2个瓶用药棉塞紧，第3个瓶用紧有S形弯玻管的药棉塞塞住（如下图）。
③把3只烧瓶放入盛水的锅子里隔水加热，使锅子里的水沸腾5min。取出3只三角烧瓶，冷却后放在温暖的阴暗处（日平均温度在20oC以上）
④以后，逐天观察肉（豆）汤的变化。结果，一天后，不加塞烧瓶里的肉汤已浑浊，液面有一层薄膜，这是细菌的群体，叫做菌落。瓶内可以有臭味，说明肉汤已腐败。加药棉瓶塞烧瓶的肉汤几天后也开始腐败。加药棉塞和S型玻管的烧瓶维持时间最长，但肉汤也将终将腐败。
（1）本实验采用的是什么实验法？

（2）不加塞的瓶内肉汤为什么会腐败？

（3）加药棉瓶塞烧瓶内的肉汤几天为什么也开始腐败？

（4）实验操作的第③步是起 作用。

答案：
一、选择题
1、B 2、B 3、C 4、C 5、C 6、A 7、D
8、B 9、B 10、C 11、C 12、A 13、B
二、简答题
1、琼脂 NaOH HCl
2、太低 固定 1/2
3、无菌 无菌箱 酒精灯 75 菌落 管底 管口 曲
棉塞 恒温 25 5－7 菌落
4、（1）好氧细菌 （2）有机物 （3）好氧细菌氧化分解亚甲基蓝染料
5、（1）对比实验法
（2）不加瓶塞的烧瓶直接接触空气，腐败细菌进入机会最多。肉汤有多种养分，在适宜的温度下，细菌迅速繁殖，使汤液中有有机物腐败分解
（3）加有棉塞的烧瓶，细菌进入机会较少，但也很难防止细菌侵入，同时由于消毒不彻底，留在瓶内的细菌芽孢可能发芽繁殖
（4）灭菌