糖化温度、pH、时间、原料对酚酸和 氨基酸溶解的影响 - 副本.doc

糖化温度、pH值、时间、原料对酚酸和氨基酸溶解的影响
华润雪花啤酒（河北）有限公司 石秀云 [摘译]
【摘要】本文旨在研究小麦啤酒最佳的糖化条件。糖化工艺参数，如温度、pH值、时间应提供淀粉酶和蛋白酶最佳的酶解条件，使阿魏酸、对香豆酸、氨基酸最大程度溶解。这些酚酸是挥发性芳香酚类物质4-乙烯基苯酚（4VP）和4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前体物质。高级醇和酯类物质，如苯乙醇、乙酸异戊酯，决定着小麦啤酒的风味和口感。最佳的糖化条件还应降低含苯乙烯基类物质的溶解度。苯乙烯类物质普遍存在于谷物中，小麦啤酒酿造过程中在加热和酶促作用下转化为有害物质苯乙酸。试验参数，特别是糖化pH,对试验目的的实现起着决定性作用。此外，还研究了不同麦芽和原料对酚酸和氨基酸溶解的影响。
【关键词】氨基酸、苯丙烯酸、阿魏酸、糖化条件、对香豆酸、小麦啤酒香气

引言
酚酸广泛存在于各种香草和麦芽制品中。其中阿魏酸、对香豆酸是4-乙烯基苯酚（4VP）和4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前体物质，是重要的酚酸物质，对啤酒风味起重要作用。这些酚酸在酶促或加热作用下生成相应的多酚（见图1）。阿魏酸，最常见的羟基肉桂酸，多通过酯键与多糖交联存在于植物细胞壁中。这种结构能被各种酶酶解成相应的物质：被阿魏酸酯酶酶解成阿拉伯糖和阿魏酸；被β-(1-4)木聚糖内切酶酶解成低聚木糖；被β-D- 木糖酶酶解成木糖和低聚木糖；被α—L-阿拉伯呋喃糖酶酶解成相应的阿拉伯呋喃糖。因而，阿魏酸对植物细胞壁的稳定性与弹性有着显著作用。此外，阿魏酸也是一种抗氧化剂，能清除自由基。糖化过程中，粮食内的苯丙烯酸同阿魏酸、对香豆酸一起溶解出来，在加热或酶解下脱羧降解成苯乙烯，而苯乙烯对小麦啤酒风味无显著作用。
高纯苯乙烯是种可挥发性芳香液体，合成聚苯乙烯的单体。而聚苯乙烯用于制作各种绝缘体及一次性泡沫饭盒。国际癌症研究机构已将苯乙烯归为很可能致癌物质（B组），暂定每日允许摄入量为0.4ug/kg(体重)。按照暂定每日允许摄入量摄入苯乙烯，可能危害人体健康。目前检测出各种小麦啤酒麦汁中的苯丙烯酸含量在75ug/l和375ug/l之间，低于阿魏酸和对香豆酸含量,而小麦啤酒中苯乙烯浓度高于24ug/l。
与酚酸相似，在羧肽酶、二肽酶、氨基肽酶酶解下，氨基酸溶解出。发酵过程中，在酶的作用下，氨基酸被酵母代谢合成为酯类和高级醇类的前体物质。氨基酸，特别是苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸对小麦啤酒水果味和麦芽味起决定性作用。酵母通过Ehrlich 途径合成发酵液中的高级醇和酯类物质（见图2），如苯乙醇、异丁醇、正丙醇、甲硫醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯酯、乙酸己酯. 表1给出了部分氨基酸及其相应的高级醇和酯类物质。4VG、4VP和前面提到的芳香物质决定着小麦啤酒的风味和口感。
表1：部分氨基酸及其相应的高级醇和酯
氨基酸
高级醇
酯
亮氨酸
异戊醇
乙酸异戊酯
异亮氨酸
戊醇
乙酸戊酯
苯丙氨酸
苯乙醇
乙酸苯乙酯
蛋氨酸
甲硫醇
乙酸甲硫酯
除考虑麦芽水分、发芽温度、时间、干燥温度对糖化过程的影响，本文旨在寻找最佳的糖化条件，提供最适的酶解条件，使阿魏酸、对香豆酸、氨基酸最大程度溶解，同时减少苯丙烯酸的产生。此次研究中，主要考虑糖化温度、pH、时间及麦芽色度。
试验材料与方法
l 试验材料
所有分析物和试剂都是分析级或色谱级，其中，苯丙烯酸、对香豆酸、甲醇、冰乙醇由Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany)提供。
l 酚酸含量测定方法
如Schwarz等发现，使用安捷伦高效液相色谱（Agilent 1100 HPLC-DAD ）检测苯丙烯酸、阿魏酸、对香豆酸。使用 AppliChrom OTU Li-poMare C18 (250 mm * 4.6 mm *5 pm )(AppliChrom.Oranienburg)检测各类酚酸。 通过不同的紫外检测波段最终区分苯丙烯酸（280nm），对香豆酸、阿魏酸(312nm)。
l 氨基酸含量测定方法
使用EZ （Phenomenex,Aschaffenburg.German）和GC-FID(Hewlett-Packard 5890)分析样品中游离氨基酸。
l 糖化温度影响的分析方法
采用以下试验来研究糖化温度对酚酸和氨基酸浸出的影响：分别磨碎40g比尔森啤酒麦芽和裸小麦芽，加入300ml热水糖化。依据Vanbeneden 等人的研究，在 25℃到80℃之间，进行恒温糖化，pH值设定为5.4。样品分别处理30,60,120及180分钟，然后立即使用100ml冰水冷却，5ml冰醇酸调酸灭酶。调整溶液到500g后，离心5分钟（10，000rpm），上清液冷藏于-18℃待分析。
l 糖化pH影响的分析方法
添加300ml水后，使用1N氢氧化钠溶液或1N盐酸溶液将料液pH分别调至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8，于45℃下分别糖化60分钟。
l 糖化时间影响的分析方法
45℃，pH5.4条件下，样品分别糖化10,20,30,45,60,75,90,105,120,180,240和 300分钟。
l 不同麦芽和原料影响的分析方法
分析不同色度（1.8-300EBC）着色麦芽和各种粮食（大麦、小麦、黑麦）对酚酸、氨基酸溶解的影响。麦芽由Weyermann (德国,班贝克)提供。45℃，pH5.4条件下，样品分别糖化60分钟。
l 统计分析
所有试验至少重复两次。每一组试验麦汁在同一水平下进行分析，结果用±偏差表示。
结果与讨论
l 糖化温度的影响
为研究糖化温度对麦汁（小麦麦芽：哈雷麦芽=50%：50%）酚酸（苯丙烯酸、阿魏酸、对香豆酸）和氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸）溶解的影响， 样品在25℃-80℃间进行恒温试验。
从图3可以看出糖化温度对阿魏酸溶解的影响。整体来看，45℃时阿魏酸溶解量最大，这与目前的研究结论一致（40℃、43℃、45℃）。考虑糖化时间（30分钟、60分钟），50℃时阿魏酸溶解量最大。25-60℃间，糖化时间越长，阿魏酸溶解量越大。65℃以上，糖化时间对阿魏酸溶解没有显著影响，因为这个温度范围内，大多数阿魏酸降解酶已失活。Vanbeneden和McMurrough等人也有类似的发现。
从图4可以看出糖化温度对苯丙烯酸相似的影响趋势。45℃和50℃时，苯丙烯酸溶解量最大。从试验数据来看，60℃以内，糖化时间越长，物质浸出越多；65℃以上，糖化时间对物质的浸出没有显著作用。
图5中没有显示对香豆酸最佳的溶解温度。在30-35℃、45-50℃均出现对香豆酸溶解峰值。与苯丙烯酸、阿魏酸相比，随着糖化时间的延长，对香豆酸溶解量并没有增加。糖化时间超过120分钟，延长糖化时间可以降低对香豆酸的溶解。65℃以上，随着温度的上升，对香豆酸溶解量明显降低。
图6显示，糖化温度50℃时，氨基酸浓度出现峰值。检测的氨基酸中，亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸峰值较高（c≥200mg/l）。而蛋氨酸峰值最低（芳香物质甲硫醇和甲硫代丙醛的代谢前体，这两种物质风味阈值非常低）。
l 糖化pH的影响
在45℃下，糖化60分钟，研究不同pH（4.2-6.8）对酚酸和氨基酸溶解的影响。从图7可以看出pH对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解的影响。对阿魏酸来说，最适pH为5.4-6.6。Vanbeneden等人研究发现最佳pH 为5.8，也有研究表明相关酶的最适pH在一定范围内。对对香豆酸来说，出现两个最适pH范围： 4.4-4.6、5.8-6.0。对苯丙烯酸来说，呈现下降趋势，醪液越接近中性，苯丙烯酸的溶解量越大。
从图8可以看出，pH值5.2-5.4时，氨基酸含量出现峰值。这与目前研究的最适pH5.2是一致的。从图6也可以得到相似的结论。
l 糖化时间的影响
图9,10显示不同糖化时间对酚酸和氨基酸溶解的影响，研究从10分钟持续到300分钟，使用小麦芽和大麦芽。图表9显示糖化时间对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解量的影响。对阿魏酸来说，糖化时间与阿魏酸溶解量呈献性关系（R2=0.98），10分钟时，阿魏酸含量0.7 mg/l,300分钟时，阿魏酸含量为7.8 mg/l。与阿魏酸相似，整个糖化过程中，苯丙烯酸含量呈线性增长趋势。但240分钟后，溶解量维持在相近水平（0.4 mg/l）。105分钟到120分钟，对香豆酸出现峰值（0.9 mg/l），然后不断降低直至糖化结束。从图5也可看出，120分钟后，对香豆酸溶解量快速降低。
从图10 可以看出，随着糖化时间的延长，氨基酸溶解量不断增加。120分钟后，氨基酸已基本溶解。这与糖化温度、pH影响的研究结论是一致的。
l 着色麦芽和不同原料的影响
不同原料（小麦、大麦、黑麦）和着色麦芽（1.8-430EBC）中酚酸和氨基酸含量是不同的。45℃下分别糖化60分钟，来研究不同原料及麦芽对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解的影响（图11）。所有样品中，黑麦麦芽样品中阿魏酸和对香豆酸溶解度最高，但苯丙烯酸的溶解量与其他样品相近。从大麦绿麦芽到比尔森麦芽，所有酚酸含量呈上升趋势。与小麦麦芽和比尔森麦芽相比，大麦制成的麦芽样品酚酸含量偏高。与浅色小麦麦芽相比，深色小麦麦芽样品中酚酸含量偏低。整体来讲，色度2-74EBC，麦芽色度与酚酸含量没有明显的关联性。此外，色度超过91 EBC样品中，没有检测到酚酸物质，这与Inns 等人的研究是一致的，他们也没有发现麦芽干燥温度与酚酸明显的关联性。图12显示不同原料及麦芽对氨基酸的影响趋势。从大麦到绿麦芽再到比尔森麦芽，氨基酸溶解量趋势与酚酸相似。与酚酸相比，黑麦麦芽样品中各类氨基酸溶解量与深色小麦麦芽样品相似。因而，麦芽色度与氨基酸含量没有明显的关联性，如特种麦芽Caraamber色度高，氨基酸溶解量也高。其它特种麦芽中也有少量氨基酸溶解。与pH、时间、温度影响试验相同，在此试验过程中，丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸被大量检出。
结论
通过试验研究糖化pH、时间、温度对酚酸及氨基酸溶解的影响，寻找增加芳香前体物质如阿魏酸、对香豆酸溶解量，同时降低苯丙烯酸含量的最适糖化条件。同阿魏酸、对香豆酸一样，苯丙烯酸在45-50℃糖化温度下也可溶解。延长糖化时间可以促使这三种物质溶解。因此，相关参数的确定是相当困难的。
试验证实，随着pH值的增加，苯丙烯酸的溶解度不断增加。将麦汁调酸至pH值5.2-5.4，可使苯丙烯酸的溶解度降低。在这个pH值范围内，游离氨基酸溶解量增加，这些氨基酸是构成芳香物质高级醇和酯类的前体物质，但阿魏酸和对香豆酸的溶解度有微量降低（见表2）。目前研究表明，前体物质的数量与芳香物质的量没有必然联系，酵母菌株、发酵温度、进一步生产过程都显著影响小麦啤酒风味。如在酯类形成过程中，含氮物质浓度，可发酵糖，脂类物质也有重要作用。且芳香物质对酒体风味的影响取决于其嗅觉阈值。
表2: 酚酸和氨基酸溶解最适糖化条件

时间，min
温度，℃
pH值
阿魏酸
300
45
5.4-6.6
对香豆酸
105-200
30-35
45-50
4.2-4.8
5.8-6.0
苯丙烯酸
240-300
45-50
6.8
氨基酸
>120
50
5.2-5.4

摘译自：Release of Phenolic Acids and Amino acids During Mashing Dependent on Temperature ,pH ,Time and Raw Materials.Journal of the ASBC The Science of Beer(2012), 70(4),219-332