组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构.pdf

I n t J Op h t h a l mo l，Vo 1 1 0，No 2，Fe b 2 0 1 0 www UO c a Te l：0 2 9-8 2 2 4 5 1 7 2 8 3 0 8 5 6 2 8 E ma i l：I J O 2 0 0 01 6 3 c o m 组织工程人角膜 内皮 的体 外重建及 其形态结构 樊廷俊，赵 君，王 晶 ，丛 日山 ，杨秀霞，史伟云，王宜强 实验论著 基金项目：中国国家高技术研究发展 8 6 3计划资助项 目(N o 2 0 0 6 A A 0 2 A1 3 2)；中国山东省眼科学重点实验室一 省部共建国家 重点实验室培育基地开放基金课题资助项目(N o 2 0 0 6 K 0 5)作者单位：(2 6 6 0 0 3)中国山东省青岛市，中国海洋大学角膜组 织 工程 重点 实验 室；(2 6 6 0 7 1)中国山东省 青 岛市，山东省 医学 科学 院山东省眼科研究所 作者简介：樊廷俊，男，教授，理学博士，中国海洋大学海洋生命 学院副院长，国家生命科学与技术人才培养基地主任，国家细胞 生物学教学团队带头人，山东省高等学校教学名师，研究方 向：动物细胞工程与细胞分化，主要成果：在国际上建立了首个非转 染的人角膜内皮细胞系，在体外重建 出结构和功能与在体角膜 内皮类似 的组织工程人角膜 内皮等。通讯作者：樊廷俊 t j f a n o u e e d u a n 收稿 日期：2 0 1 0 0 l 一 0 8 修回 日期：2 0 1 0 0 l 一 2 8|n v i t r o r e c o n s t r u c t i on o f t i s s u e e n g i n e e r e d h u m a n c o r n e a I e n d o t h e l i u m a n d c h a r a cte r-o l o g y a n d s t r u ct u r e Ti n g J u n F a n ，J u n Z h a o ，J i n g W a n g ，Ri-S h a n C o n g ，X i u X i a Y a n g ，We i-Y u n S h i ，Y i-Qi a n g Wa n g Foun dat i o n i t e ms：Na t i o na l Hi g h Te c hn o l o g y Re s e a r c h a n d D e v e l o p me n t P r o g r a m(“8 6 3”P r o gr am)o f C h i n a(N o 2 X I6 A A 0 2 A 1 3 2)；Op e n i n g Pr o gra m f r o m The S t a t e Ke y L a bo r a t o r y Cu l t i v a t i o n Ba s e，S h a n d o n g P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f O p h t h a l m o l o g y(N o 2 0 0 6 K 0 5)Ke y La bo r a t o ry f o r Co r n e a l Ti s s ue En g i n e e r i n g，Oc e a n Uni v e r s i t y o f C h i n a，Q i n g d a o 2 6 6 0 0 3，S h a n d o n g P r o v i n c e，C h i n a；S h a n d o n g E y e I n s t i t u t e，S h a n d o n g A c a d e m y o f M e d i c a l S c i e n c e s，Q i n g d a o 2 6 6 0 7 1，S h a n d o n g P r o v i n c e，C h i n a Co r r e s p 0 n d e n c e t o：Ti n g J u n F a n Ke y L a b o r a t o r y f o r C o r n e a l T i s s u e E n g i n e e r i n g，O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a，Q i n g d a o 2 6 6 0 0 3，S h a n d o n g P r o v i n c e，C h i n a t j f a n o u e e d u a n Re c e i v e d：2 0 1 0 一 O 1 0 8 Ac c e p t e d：2 01 0 0 1 2 8 Ab s t r a c t AI M：T O r e c o n s t r u c t t i s s u e e n gi n e e r e d h u m a n c o r n e a l e n do t h e l i a(TE HCE)i n v i t r o a n d c h a r a c t e r i z e t h e m i n mor ph o l o g y a n d s t r u c t ur e ME THODS：Mon o c l o na l HCE c el l s(mc HCE c e l ls)we r e c l o n e d f r 0 m un t r a n s f e c t e d HCE c el l l i R e b y l i mi t ed di l u t i o n，a n d t h e i r k a r y o t yp e s we r e a n a l y z e d b y r o u t i n e m e t h od s o f c h r om o s o m a l pr e pa r i n g a n d k a r y os y s t e ma t i c s Mo dif i e d d en u d e d a mni o t i c me mb r a n e s(md AMs)we r e p r e p a r e d f r Om a mni o t i c memb r a n e b y i n v e r t e d t r y p s i n d e nu d a t i on a n d c o a t e d wi t h e x t r a c e l l u l ar ma t r i x pr o t e i n s T E HCE s we r e i n v i t r o r e c 0 n s t r u c t e d b y u s i n g mc HCE c e l l s a t I o ga r i t hmi c p h a s e a s s e e d c e l ls a n d md AMs t I l e d on we l l b o t t oms o f a 2 4 一 we l l c uI t u r e p l a t e a s s c a 仟o l d c a r r i e r swh i c h wer e c u l t ur e d i n 2 0 0mL L f e t a I b o v i R e s er u m(F BS)一 c o n t a i n i n g DMEM F 1 2 me di u m a t 3 7 i n a 5 0 mL L C02 i n c u b a t o r Th e mo r p h o l o g y o f s e e d c e l l s，f o r ma t i o n o f c e l l j u n c t i o n s，i n t e g r a l i t y o f e n d o t h e l i a l m o n ol a y e r a n d i t s i n t e gr a t e d s t a t u s t o m d AM we r e i n v e s t i g a t e d b y Al i z a r i n r e d s t a i n i n g，f r e e z e s e c t i on s h e ma t o x y l i n e o s i n(H E)s t a i n i n g，i n v e e d mi c r o s c o p y a nd s c a n n i n g e l e c t r on m i c r os c op y Th e ult r a s t r u c t ur e o f s e e d c el l s o n md AM a n d f o r ma t i on o f c el l i un c t i on s we r e e x a mi n e d b y t r a n s mi s s ion e l e c t r o n mi c r o s c o p y T h e e x p r e s s io n p a tte r n s o f d i fie r e n t c e l l i u n cti o n p r o t e i n s o f T E HC E s e e d e r c e l l s we r e d e t e cte d b y i mmu n o f l u o r e s c e n t t e c h n i qu e s RE SUL TS：Se v e n mc HCE c el l s t r a i a s wi t h n or ma I k a r y o t y p e(2 n=4 6)we r e s c r e e n e d ou t f r O m t h e u n t r a n s f e c t e d HCE c e l l l i R e Ab ou t 3 0 h ou r s a f t e r r e c 0n s t r u c t i On i n i t i a t i o nmc HCE s e e d er c e l ls f or me d a n i n t e gr a t e d mon o I a y e r o n md AM wi t h a c e l l d e n s i t y a s h i gh a s 3 4 1 3 mm M o s t o f s e e d c e l l s we r e i n p ol y g on a l mor p h ol o g y，i n t e g r al e n d o t h e I i a l m o n ol a y e r wa s r e c On s t r u c t e d wit h v a r i ou s c el l-c e l l a n d c el l _ md AM i un c t i on s An d t h e u l t r a s t r u c t u r e of s e e d c e l l s wa s s i m i l a r t o t h a t o f HCE c e I l s v i v owi t h a l o t o f m it o c h o nd r i a s c a t t e r e d i n c y t op l a s m Be s i de st h e s e ed c e l l s ma i n t ai n e d p os i t i v e e x p r e s s i on o f c e l l i u n c t i on pr o t e i a s s u c h a s z on ul a O C C I u d en s p r o t e i n 1，N c a d h e r i n c o n n e c x i n 4 3 a n d i n t e g r i n v B 5 CONCL SUI ON：Th e TE HCE s，wit h s i mi l a r mo r p h o l o g y a n d s t r u c t ur e t o t h os e o f HCE i n v i v o，we r e s u c c e s s f u l l y r e c o n s t r u c t e d，a n d c a n b e u s e d p r omis i n gly a s H CE e q u i v a l e n t s f or c I i n i c a l c or n e a I e n d o t h e l i u m t r a n s D l a n t a t i 0n K E W V ORDS：h u m a n c or n e a l e n d o t h e I i a I c el 1 mod i f i e d d en u d e d a mni o t ic me m b r an e：t i s s u e e n gi n e e r e d h uma n c or n e al e nd o t h eI i u m：i n v i t r o r e c On s t r u c t i O n：mor ph o I og y；s t r u c t u r e F a n T J，Z h a o J，Wa n g J，e t a 1I n v i t r o r e c o n s t r u c t i o n o f t i s s u e e n g i n e e r e d h u ma n c o r n e a l e n d o t h e l i u m a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f i t s m o r p h o l o gy a n d s t r u c t u r e Int J O p h t h a l m o l(C o j i Y a n k e Z a z h i 2 0 1 0；1 0(2)：2 2 5 2 2 8 摘要 目的：组织工程人角膜 内皮(t i s s u e e n g i n e e r e d h u m a n c o r n e a e n d o t h e l i a T E H C E)的体外重建及其形态结构。方法：用有 限稀 释 法 从 H C E细 胞 系 筛选 出单 克 隆细 胞(m c H C E细胞)，用常规染色体标本制作和核型分类学方 法进行核型分析。用羊膜 的胰 酶倒置 消化 和细胞外 基质 蛋 白包被方法制 备去 上皮 层修 饰羊 膜(m d A M)。以核 型 正常的对数期 m c H C E细胞为种子细胞，以平铺于 2 4孑 L 培 养板孑 L 底 的 m d A M 为载体支架，用 2 0 0 m L L胎牛血清 D ME M F I 2培养液在 3 7 c I=，5 0 m L L C O，培养 箱中进 行 T E H C E的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片 H E染 色、倒 置显微镜 和扫 描电镜 观察种 子细胞 的形态、细胞连接 的 形成情况、细胞单层的完整性及其与m d A M结合的紧密程 国际眼科杂志2 0 1 0年 2月第 1 O卷第2期WV,A,V IJ O c n 电话：0 2 9 8 2 2 4 5 1 7 2 8 3 0 8 5 6 2 8 电子信箱：I J O 2 0 0 0 1 6 3 c o m 度。用透射 电镜方法 鉴定种子 细胞 的超 微结构 以及 细胞 连接的形成情况。用 免疫荧光技术 检测种 子细胞对 不 同 细胞连接蛋 白的表达模式。结果：从非转染 H C E细胞系中筛选出了7 个核型正常(2 n=4 6)的单克隆细胞株。在启动重建 3 0 h后，m c H C E种子细 胞在 m d A M 上 形 成 了 完 整 的 细胞 单 层，细 胞 密 度 高 达 3 4 1 3 ra m 。H C E细胞呈多角形细胞形态，形 成了完整 的 细胞单层，且在 细胞一 细胞 以及 细胞 一 m d A M 问形成 了多种 细胞连接，种子细胞 在超微结构上与在体 H C E细胞类似，胞质中含有许多线粒体，并具有紧密连接蛋白一 1、钙黏蛋 白、间隙连接蛋 白一 4 3和整联蛋 白 o L v 3 5的阳性表达。结论：体外重 建 的 T E H C E在 结构 和功 能 上与在 体 H C E 相似，有望作为 H C E的替代物用于临床 角膜 内皮移植。关键词：人角膜内皮细胞；去上皮层修饰羊膜；组织_T程；体外重建；形态；结构 D O I：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 2-5 1 2 3 2 0 1 0 0 2 0 0 7 樊廷俊，赵君，王晶，等 组织T程人角膜内皮的体外重建及其形 态结构鉴定 国际眼科杂志 2 0 1 0：1 0(2)：2 2 5 2 2 8 0引言 人角膜 内皮(h u m a n c o rne a l e n d o t h e l i a l，H C E)层 在维 持角膜正常厚度和透 明度 中具有不可替代 的作用，是人眼 发挥正常视功能的必要条件。角膜 内皮盲(p r i m a r y c o r n e a l e n d o t h e l i o p a t h y)是 H C E细胞 密度低于维持 角膜 内皮 层 完整性及其生理功能 的临界密度后所引起 的不可逆病 变，绝大多数(约 9 9 9 o)患者因得不到可用于移植的捐献角 膜而无法复明。角膜组织 工程 的兴起为组 织工程 人角 膜 内 皮(t i s s u e e n g i n e e r e d h u m a n c o r n e a l e n d o t h e l i a，T E H C E)的体外重建和患者通过临床角膜 内皮移植重见光明 带来 了希望。许 多学者利用癌基因转染 的永生化 H C E细 胞、原代培养 H C E细胞或仅传 45代的 H C E细胞在体 外成功重建出了人角膜 内皮的组织类似物，为组织工 程角 膜内皮的体外重建开辟了道路，但由于所用永生化转染的 种子细胞 具有 潜 在致 瘤性 而 无法 用 于 临床 角膜 内皮 移 植，所重建 的 H C E类似物移植后仅使新西 兰兔 角膜维 持透 明 1 w k 左右，离 角膜 内皮盲的临床移植应用还差得很 远。去上皮层修饰羊膜(m d A M)为来 自人胎盘羊膜 的 修饰 物，目前 已广泛用 于 眼表损伤、角膜基 质炎、角膜 溃 疡、大泡性 角膜病变及新生血管性 青光眼 的移植治疗。我们 以非转染 H C E细胞 系的单克隆 细胞株 为种子细 胞、以 m d A M为载体支架进行 了 T E H C E的体外重建，并对其 形态结构进行 了鉴定，旨在为形态 结构正常 T E H C E的体 外重建及其作为角膜 内皮替 代物进行 临床角膜 内皮移植 奠定基础。1材料和方 法 1 1材料无 眼疾健康新 西兰兔，体质量 2 0 2 5 k g，不 分雄雌，由山东省眼科所实 验动物 中心提供 与饲养；非转 染 H C E细胞 系，由本实验室 自行建立，现已传至第 2 8 2 代；新鲜羊膜(A M)由山东省眼科所友情惠赠。用胰酶消 化法收获对数期第 2 4代 H C E细胞，经 C a s y 细胞计数仪计 数后用 2 0 0 m L L胎牛血清(F B S)一 D M E M F 1 2(1：1)培养 液将细胞密度 调整为 8 X 1 0 个 L，接种 于预铺 有饲 养层 细胞(f e e d e r c e l 1)的 9 6孔 板 内(0 1 m L L)，置 3 7 c c，5 0 m l ML C O，培养箱 中进行克 隆化培养。每周换培 养液 1 次，每 3 d 观察细胞克 隆的形成情 况，23 w k后挑 出细胞 单克隆进行扩增培养，对每个细胞单克隆进行核型分析，筛选 出具有正常 核型(2 n=4 6)的单 克隆 细胞株，扩增后 作为种子细胞备用。另新鲜 羊膜经 生理 盐水 冲洗 后用硫 酸妥布霉素液浸泡消毒，经 D H a n k s 漂洗后让羊膜上皮 面 朝下用胰蛋 白酶一 E D T A于 3 7 倒 置消化，获得 去除上皮 细胞 的 d A M，经 D H a n k s 液漂洗后用眼科剪将羊膜剪 成直 径 1 5 6 c m 的圆片，使 其上皮 面朝上 平铺 于 2 4孑 L 培养板 中，滴 加 d A M专用包 被液处理 过夜，吸 出包被 液晾 干后，作为 m d A M载体支架使用。1 2方 法 单 克 隆 细 胞 株 种 子 细 胞 用 2 0 0 m L L F B S D ME M F 1 2(1：1)培养液将细胞密度调整 为4 21 0 L，按 l m L -E将种子细胞悬液接种于预铺有 d A M 的 2 4孔培 养板 中，置 3 7。C，5 0 m L L C O，培 养箱 巾进 行体 外 重建培 养，每 2 d 换液 1 次，每 日观 察种子 细胞 的形 态、增殖 和细 胞单层形成情况，待种子 细胞长成 紧密单层后 用于形 态结 构鉴定。形成细胞 单层后 的 T E H C E，置 N i k o n E c l i p s e T S 1 0 0倒置显微镜 下观 察，随机 选取 5个视 野，利用 网格 目 微 尺统计单位面积 的细胞数，计 算出 T E H C E单层 的细胞 密度。形成细胞单层后 的 T E H C E，用生理盐 水轻轻漂洗 后，滴 加 1 0 L茜 素红 染液染 色 1 5 m i n，吸除染液 后用 生 理 盐水轻轻 冲洗，在 N i k o n E c l i p s e T S 1 0 0倒置显微镜下观 察并 照相。从培养孑 L 中取 出 T E H C E单层，经 冰冻胶低温 固定冰冻切片厚 5 6 ix l n，甲醇 固定后空气干燥 3 0 m i n，水洗 后用苏木素染色 3 0 s，经 1 0 m I 1 盐酸一 乙醇分化和水洗后 伊红染色 1 0 s，脱 水封 片，光镜下 观 察并 照相。从 培养孑 L 巾取 出 T E H C E单 层，经 4 0 L戊 二醛一 蔗 糖添 加 二 甲肿 缓 冲液 固定 后，进 行 C O，临 界 点 干 燥 和 喷金 处 理，使用 J S M 2 8 4 0扫描 电镜进 行 观 察和 照 相。从 培 养孔 中取 出 T E H C E单层，经 4 0 g L戊二醛一 蔗糖添加二 甲胂缓 冲液固 定后，按常规方法进行包埋 和超 薄切 片，利 用 H 一 7 0 0透射 电镜进 行 观 察 和 照相。形 成 细 胞单 层 后 的 T E H C E，经 P B S 轻轻漂洗后，用 4 0 g L多聚 甲醛于 4 固定 1 0 ra i n，吸 出固定 液后用 P B S洗涤 2次，用 4 0 g L小牛血 清于 3 7 湿盒 内封 闭处理 3 0 m i n，分别加 入 山羊 抗人 Z O 1(z o n u l a o c c l u d e n s p r o t e i n l，紧密连接 蛋 白 1)(1：5 0)、小 鼠抗人 N 一 钙 黏蛋 白(N c a d h e r i n)(1：5 0)、小 鼠抗人 问隙 连接蛋 白一 4 3(c o n n e c x i n 一 4 3)(1：2 5 0)和小 鼠抗 人整联 蛋 白 v B 5(i n t e g r i n v 3 5)(1：5 0)m A b(第 1 抗体)于 4 温盒 中 过夜孵育，用 P B S液 冲洗 5次后冉 加入 F 1 T C荧光 素标记 的兔抗羊 I g G(1：1 0)或羊抗 鼠(1：1 0 0)I g G第 2抗体，于 3 7 湿盒 内下避光孵育 2 h，经 P B S冲洗 5次后置 N i k o n E c l i p s e T i 倒置荧光显 微镜 观察并 照相。用 P B S 代 替第 一 抗体作为阴性对照。2结果 2 1 T E-H C E的体 外重 建H C E种子 细胞 接种 至 m d A M 上之后，逐渐开始贴膜伸展，细胞 形态 多为多角形，l 5 h 后 已接近形成细胞单层(图 1 A)，3 0 h后 已形 成完整 的细胞 单层，即体外 重建 的 T E H C E(图 1 B)。利用 网格 目微 尺 对 T E H C E进行 细胞计数 的结果显 示，T E H C E单 层 的细 胞密度约为 3 4 1 3 ra m 。2 2 T E-H C E的形态结构 对体外重建 T E H C E形态结 构的检测结果显示，冰冻切片 中的种子细胞在 载体支架上 形成 了连续 的细胞单层，且种子细胞与载体支架结合状态 紧密(图 2 A)；茜素 红染色 中的 H C E种子细胞 在 m d A M上 多为多角 形，细胞 之 间形 成 了广泛 的细 胞 连接，形 成 了 H C E样 的紧密细胞单层(图 2 B)；扫捕 电镜下的种子细胞