植物组织培养实验指导.doc

植物组织培养实验指导书实验性质：设计性武汉工业学院生物科学与制药工程系生物工程实验课程组编写二零零五年六月植物组织培养实验性质：设计性实验学时：8分组人数：2人1.1 实验目的和要求（1） 了解植物细胞和组织培养技术的定义和基本要求（2） 熟悉无菌操作的要求，初步掌握无菌操作技术（3） 初步掌握常规的植物组织培养技术1.2 实验原理细胞分化(cell diferentiation)指细胞后代在形态、结构和功能等发生变化的过程，归根结底是某些功能基因的开启或者关闭。一般说来，终端分化细胞已经失去分化潜能，只具有单能性；而大部分细胞只保留了部分分化潜能，称为多能性。对于动物而言，只有部分干细胞仍保留了分化的全能性。而植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物细胞的全能性(totipotency)。植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养最原始的意义是指愈伤组织培养，但发展至今，其范围已经扩展至植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养：植株培养。指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）作为外植体的无菌培养。胚胎培养。指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。器官培养。指以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖，茎节和切段，叶的叶原基，叶片，叶柄，叶鞘和子叶，花器的花瓣，雄蕊（花药，花丝），胚珠，子房，果实等的离体无菌培养。组织培养。指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层，胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的组织培养。细胞培养。指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。制备外植体的原则是无菌和有活性，无菌是外植体植被的要求，有杂菌带入培养基会造成微生物污染，而阻滞甚至杀死外植体。有活性是外植体制备的前提，无活性的外植体的培养在植物组织培养中是无意义的。无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。事实上外植体的制备过程就是无菌处理过程，而其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的，实验室中经常使用的无菌操作设备是超净工作台。无菌操作者的操作手法和习惯也是无菌操作成功与否的关键，通常进行无菌操作的实验人员也要经过严密的无菌操作训练并建立严格的“无菌概念”。能否把植物组织培养做到满意的人工调控，关键在于人工培养环境。人工培养环境是整个组织培养的难点和重点，也是近百年来植物生理学家一直探讨和研究的重要话题。人工培养环境包括能量的来源光照，新陈代谢的保证温度，气-水平衡湿度，生物原料的来源培养基。这与植物的自然环境是类似的，即光照、温湿度和土壤。光照、温度的选定通常依据所培养植物的生态习性，习惯上采用暗培养与光照培养(8h/d,3000lx)的结合，温度在25-28度。湿度在组织培养中不需特意的调整，因为培养容器中的湿度几乎达到100%。如此说来，人工培养环境的重难点自然而然地落在了培养基上。培养基(Culture medium)是从无土栽培的营养液发展而来的，在某种意义上说就是模拟土壤。最初的培养基就是简单的马铃薯浸出液即土豆汁。后来随着植物生理学和生物化学的研究的深入，培养基越来越复杂，成分越来越多。当支持物(如：琼脂、明胶)的发现并且应用到培养基的培养基中时，固体培养基随之诞生。固体培养基是组织培养基中最常用的一种培养基的类型。人工合成培养基通常包括大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、支持物和植物激素。大量元素和微量元素通常使用无机盐代替，铁盐通常以螯合铁的形式出现，有机复合物通常包括氨基酸、代谢载体和维生素等，糖可采用蔗糖或者葡萄糖，支持物一般采用高分子交联糖链(如聚半乳糖硫酸酯)，这几类物质的用量和配比在多少年的发展中已经基本上形成了若干个模板，例如实验室中常用的MS 、B5、Nicher培养基。植物激素，是植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素，也是人工调控组织培养的“魔术棒”。几乎所有的植物组织培养工作者都认同植物激素在组织培养中具有无可动摇的核心地位。植物激素包括五大类：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、乙烯类和生长抑制素类。在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素。生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中很重要，即所谓的“激素杠杆”。例如：生长素生物学效应高于细胞分裂素时，诱导植物组织脱分化和根原基的形成；细胞分裂素的效应高于生长素时，诱导植物组织再分化和芽原基的形成。生长素包括很多种，如-萘乙酸、吲哚乙酸和2，4-D等，它们的生物学效应有着微妙的不同，但总体效应是一致的。细胞分裂素也是如此，包括6-苄基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤和玉米素等。植物激素在培养基中的用量通常在0.01-10mg/L(ppm)之间变化，细胞分裂素的浓度在非生根培养中要大于生长素。值得指出的是，植物激素的用量要考虑组织内源激素的含量及其生理学周期效应。换言之，激素的生物学效应是组织内源激素和人工添加的外源激素效应的总和。只有准确把握内源激素与外源激素的协同作用，才能有效地操作“激素杠杆”，用好植物激素这根“魔术棒”，做好植物组织培养。当应用组织培养技术建成了某种植物的整体形态，即得到了有茎、根、叶的苗子，要经历一定的炼苗处理，使之逐步由无菌环境到有菌环境，由人工培养环境过渡到自然环境。习惯上是采用“过渡处理法”，即逐渐地使环境改变，如出瓶苗要使用消毒的土壤、保湿、保温，同时还要做一定的壮苗处理，如增加光照和补充营养液等。经过一系列的处理，一株组织培养出来的“克隆苗”就顺利成活了。植物组织培养技术，是植物细胞工程学、遗传学、植物生理学、生物化学与分子生物学研究的重要基本技术。也就是说，植物组织培养技术不仅仅用于快速繁殖，而是有着相当广泛的用途。例如：单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等等。目前，组培快繁技术在兰花等观赏花卉中基本实现了工厂化育苗，由此可见其应用前景的光明。本实验为设计性实验，参加实验的人员应自己确定实验方案，经指导老师审定修改后实施。一般应按如下步骤，从以下几个方面考虑实验方案：（一）按讲义中参考资料，自学植物组织培养相关知识。（二）根据市场及科学研究的需要确定试验材料（即将什么植物进行组织培养）。在本实验中，如果你是第一次进行这项工作，可选取比较容易培养或经典的组培试验材料（如洋葱、胡萝卜、菊花等），还应尽可能选择不处于休眠期的植株，这样可能更有利于你尽快培养出愈伤或芽体，使你建立信心。（三）查阅文献，确定培养基配方（培养基种类及浓度、激素种类及浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度及其他需添加的试剂浓度）、确定切取植株的哪个部位为外植体、确定培养条件（温度、培养基PH、光照时间）。（四）列出实验所需设备、仪器、试剂、用具的清单。1.3 实验材料和仪器1.3.1 实验材料 外植体由每组实验者自定。1.3.2 仪器设备 超净工作台，高压灭菌锅，电冰箱，电热干燥箱，可调式电炉，精密天平（0.01g、0.0001g）、恒温培养室、光照培养箱、恒温培养箱，酸度计，微量移液器及枪头（1000、200、20l），数码相机，微波炉，照度计1.3.3 试剂（1） MS培养基（琼脂粉、肌醇、盐酸硫胺素、核黄素、抗坏血酸、烟酸、盐酸吡哆醇、生物素、叶酸、甘氨酸、硝酸钾、二水氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、氯化钴、硫酸铜）；（2） 植物激素：6-苄氨基嘌呤（6-BA）、6-糠氨基嘌呤（KT）、赤霉素（GA3）；-萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D） （3） 饱和漂白粉（次氯酸钠）溶液、盐酸、氢氧化钠、吐温-80、无水乙醇、95乙醇、新洁尔灭、氯化汞（4） 标准缓冲液（pH4.0，6.86，9.18）1.3.4 玻璃器皿搪瓷烧杯（1000ml、2000ml），玻璃烧杯（50、100、250、500、1000ml）、量筒（25、50、100、250、500、1000ml）、容量瓶（50、100、250、500、1000ml）、试剂瓶（50、125、250、500、1000ml）移液管（2、5、10ml）、三角瓶（50、100、500、1000ml）、广口瓶（125，250 ml）、15025mm组培试管或玻璃试管，12cm培养皿；1.3.5 其他用品（1） 酒精灯；（2） 枪型镊（2025cm），剪刀，手术刀(7#，含刀片)、记号笔、定性滤纸12cm；（3） 无菌培养容器封口膜（专用塑料透气膜）、橡皮筋；（4） 脱脂棉、纱布；（5） 洗洁精1.4 实验方法与步骤1.4.1 洗涤培养瓶及其它常用器皿应充分洗涤干净、烘干。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及洗洁精两种。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干（为节省时间，每班应在本实验前3天内安排实验课以外时间洗涤用具并烘干）。烘时缓慢升温，温度也无须太高(80为宜)。移液管之类的仪器，可用洗耳球和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。1.4.2 灭菌1. 培养基的灭菌 培养基在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24小时之内完成灭菌工序。新制备分装好的培养基，放入高压灭菌锅内加热、加压灭菌。在121的蒸汽温度下，一般少量的液体只要20分钟就能达到彻底灭菌，如果灭菌的液体量大，就应适当延长灭菌的时间。 注：特别要指出，只有完全排除灭菌锅内的空气，使锅内全部是蒸汽的情况下，1.1kg/cm2的压力才对应121，否则灭菌便不能彻底。灭菌的功效主要是依靠温度，而不是压力。高压灭菌锅的放气排空：打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出再关闭。灭菌完毕，当压力逐渐降至零后才能打开盖子，开盖后拿掉防潮物，使湿热蒸汽趁热散去。不可久不放汽，让压力锅自行冷却，这样易将棉塞等闷得太湿，引起后来长霉污染。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑。对高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用瓷碟、器械、纱布、棉塞等，可以延长灭菌时间或提高压力。只有培养基要求比较严格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，因此不能随意延长时间和增加压力。琼脂在长时间灭菌后凝固力会下降，以致不凝固。培养基随容器大小而变化的灭菌时间可参考下表1： 表1 培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间表容积的体积（ml）在120下灭菌所需的最少时间（min）20 501575 15020250500251000301500352000402. 不耐热的物质采用过滤灭菌 赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理。通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后放置无菌场所，当其冷却至40左右，琼脂将要凝结之前，加入经过滤灭菌的各种不耐热成分的溶液，然后混匀放置，待冷凉备用。在培养瓶数量很大的情况下，这一操作很麻烦。如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再立即加入。3. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在准备做无菌操作时，把解剖刀、镊子、剪刀等浸入95%酒精中，用之前取出在酒精灯或本生灯焰上灼烧灭菌，然后架放在灭过菌的支架上，放凉后立即使用。通常刀、镊子等都用两把轮流灼烧使用。4. 桌面、墙面等灭菌 可用70%酒精反复涂擦作表面灭菌。5. 植物材料的表面灭菌 采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细弄干净，如用适当的刷子、画笔等刷洗，硬的材料可用刀刮。把材料切割到适当大小，视清洁程度而异，置自来水龙头下，流水冲洗几分钟至数小时，易漂浮或细小的材料可用尼龙丝网袋、塑料纱窗或铜丝网笼扎住，置烧杯中冲洗。这在污染严重时特别有用，可以有效地提高接种后的得率。刷洗、冲洗是材料处理的第一步。第二步是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动，洗衣粉可按每100毫升水加12角匙的量配制，即浓度较高为好。这是进一步减少污染的处理。大约浸搅5分钟，然后再用自来水冲净洗衣粉水。第三步是材料的表面灭菌，要在超净台或接种箱内操作。将一干净烧杯(大小视材料多少而定)或广口瓶内、外表面用70%或80%酒精棉球擦拭作表面灭菌，放一经同样处理的玻璃棒，置于超净台(已开机10分钟以上)内，再把处理好的植物材料置入，同时已准备好了消毒溶液、无菌水、待用培养基等。工作人员换上洁净的工作服，戴上帽子，防止头发散落尘屑。用肥皂洗手至肘部，用洁净毛巾擦干，戴或不戴乳胶手套，用70%酒精棉擦手。坐到超净台前，附近应放有座钟或表，把沥干水的植物材料转放到消毒过的烧杯或广口瓶中，看好时间，倒入消毒溶液，加消毒助剂吐温-80(Tween-80)数滴，在持续消毒的时间内不时用玻璃棒轻轻搅动或盖上广口瓶盖轻轻摇动，以促进植物材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到预定时间之前12分钟，即开始把消毒溶液倒入另一准备好的大烧杯中，要注意勿使材料倒出。倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。表面灭菌的时间是倒入消毒溶液开始，到倒入无菌水时为止，加以记录，以便今后比较消毒效果，积累经验。无菌水涮洗每次3分钟左右，视采用的消毒溶液种类不同，涮洗的次数变动在310次之间。涮洗完毕，植物材料的表面灭菌就做完了，这时的材料就可以接种了。注：上述灭菌剂都应在使用前临时配制，氯化汞可短时间内贮用。近来发展使用两种甚至两种以上的灭菌剂来处理外植体。多数人提倡在倒入正式的灭菌剂之前，用70%酒精作短暂灭菌，一般在1030秒左右，这在材料较多时颇难掌握，70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞。在做此项处理时，预先准备好，操作者动作要麻利，酒精倾出后，立即倒入无菌水，亦可在70%酒精处理10秒左右，向其中倒入大量无菌水，使酒精浓度降低，再做进一步处理。有一些特殊的材料，如果实，花蕾，包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，主要取用内部的材料，也可只用70%酒精(处理稍长的时间)处理。处理完的材料放在无菌条件下，等酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。灭菌溶液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器里灭菌很多材料。否则，污染会大幅度增加。1.4.3 无菌操作在以上叙述中，已经谈到了无菌操作的一些环节，现将常用于植物组织培养工作中的无菌操作程序再简单连贯地介绍一遍。1. 将初步洗涤及切割好的植物材料放入广口瓶或带螺旋盖的瓶中，置超净台上，看好时间并记录，倒入加有表面活性剂的灭菌液，盖上瓶盖，并轻摇数次。预定时间到了，开盖倒出灭菌液(在预备的大烧杯或瓷杯中)。2. 立即倒入无菌水，盖盖，轻摇，23分钟后将水倒出，再加适当量无菌水，反复涮洗34次或810次，最后沥去水分，用灼烧放凉的镊子将灭好菌的材料放置在灭过菌的纱布上。小纱布包应有4层厚度，可多预备几包。3. 通常小纱布包放在灭过菌的小瓷碟上，上面再放材料，然后一手拿解剖刀，一手拿镊子，使材料在纱布上吸干，并进行适当的切割，有时材料也可在灭菌前全部切好。注意刀和镊子每使用片刻就应擦干净放入95%的酒精中，待灼烧放凉备用。常两把交换使用，可提高工作效率，并防止连续(也称为交叉)污染的发生。如镊子夹了没有消毒好的材料，再夹其它材料，造成污染。又如刀或镊子碰到台面、管(瓶)的外壁、棉塞、包头纸，以及手拿的部位过近，未能充分灼烧，连续使用过久等，都易引起交叉污染。经常灼烧操作器械便可减少这种污染，即便污染也是一个个独立发生的，不会连续成片地污染。材料洗净吸干水分也有防止连续污染的意义。4 .外植体植入培养基表面用上述灼烧消毒过的器械，将切割好的外植体插植到培养基表面上。具体操作是：左手拿试管或其它培养瓶，解开，拿走包头纸，将试管几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将管口外部在灯焰上燎数秒钟，因为气流影响，管口并不能灼烧灭菌(否则棉塞已烧坏)，只是将灰尘、杂菌等固定在原处，此时用右手小指和无名指配合手掌将棉塞在灯焰附近慢慢拔出，以免空气速向管内冲击，引起管口灰尘等冲入，造成污染。棉塞始终拿在手上，这时再将管口在灯焰上旋转，使充分灼烧灭菌，主要注意管口附近，包括管口内表面，然后用右手(棉塞还在手上)大、食、中指拿镊子夹一块外植体送入管内，轻轻插入培养基上，镊子灼烧后放回架上，再轻轻塞上棉塞，换右手大、食、中指再拿住棉塞，这时将管口及棉塞均在灯焰上灼燎数秒，灼燎时均应旋转，避免烧坏，塞好棉塞，包上包头纸，便完成了一管的接种操作，接着再做第二管，如此一直做到外植体全部接完。 操作时要注意棉塞不能乱放，手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分，塞入管内的那一段始终悬空，并不要碰到其它任何物体。如果是螺盖或薄膜，则应小心解下，放置在灭过菌的表面上，放置处应随时用酒精棉团涂擦灭菌。总之，要仔细理解并牢固建立“无菌”的概念，处处严格执行无菌操作。1.4.4 培养在光照培养箱或恒温培养室中，按预定条件下培养1周后，开始观察生长情况。1.5 注意事项（1）无菌操作前，将双手用酒精棉球擦拭消毒；手术刀、剪刀、镊子等金属工具用火焰灼烧灭菌，在酒精中冷却，再将酒精燃尽后方可使用；操作过程中尽量减少培养容器在空气中的暴露时间；所有无菌操作请尽量在燃着的酒精灯附近进行。（2）接种时，可先在实验台练习、后用未消毒外植体在未消毒超净工作台练习，熟练后再对无菌材料进行操作。（3）接种1周后，应注意观察组织的生长情况。1.6 结果记录及实验报告 日 期第X天生长情况染菌情况成活率记录人年 月 日年 月 日年 月 日年 月 日注：此表仅做样本，不够可在实验报告上加行1.7 问题讨论（1） 如果你发现你培养的组织中出现了微生物污染，对此你有什么解决的方案？（2） 为什么用于植物快速繁殖的每一个茎段，都必须至少含有一个生长点？（3） 在以脱毒为目的组培中，植株那些部位可以作为外植体进行培养？1.8 参考资料植物组织培养教程李浚明编译，中国农业大学出版社。高等植物组织离体培养的形态建成及其调控黄学林，李筱菊编著，科学出版社植物细胞组织培养 刘庆昌 等主编，中国农业大学出版社，2003 观赏植物组织培养技术谭文澄等主编，中国林业出版，1991植物组织培养与工厂化育苗崔德才等主编，化学工业出版社，20031.9 附表附表1 MS培养基配方药品名称浓度( mgL)编号大量元素NH4NO333000母液KNO338000CaCl22H2O 8800MgSO47H2O7400KH2PO4 3400微量元素KI166母液H3BO3 1240MnSO44H2O4460ZnSO47H2O1720Na2MoO42H2O50CuSO45H2O5CoCl26H2O5铁 盐FeSO47H2O5560母液Na2-EDTA2H2O7460有机成分肌醇 20 000母液烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1)100甘氨酸400（编写人：钟方旭）