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组蛋白H2AX与DNA损伤的分子感应
王会平(综述)，周平坤(审校)
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京　100850)
　　【摘要】 DNA双链断裂是电离辐射对DNA的重要损伤类型，与细胞死亡、基因突变甚至细胞恶性转化有密切联系。DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2AX的C末端丝氨酸残基发生磷酸化，形成γ-H2AX。磷酸化的γ-H2AX快速转导DNA损伤信号，导致下游分子磷酸化的激活，引发一系列的生物级联反应和和细胞学反应。γ-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA损伤感应分子。
　　【关键词】 DNA双链断裂； γ-H2AX； 信号转导； 电离辐射
　　中图分类号： Q512.7　　　　文献标识码： A　　　　文章编号： 1004－616X(2006)04－0334－03
　　组蛋白是真核细胞特有的蛋白质，是染色质的主要组分之一。它包括H1、H2A、H2B、H3和H4五类，其中H2A、H2B、H3和H4各两分子构成组蛋白八聚体，以146个碱基对为一单元的DNA片断缠绕组蛋白八聚体1.75圈形成核小体的核心颗粒，H1位于DNA进出核心颗粒的结合处。
　　最近研究发现，DNA损伤后核心组蛋白的化学修饰能引起染色质结构的改变，从而促进DNA的修复。组蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化，在大量细胞核事件尤其是转录调控中发挥广泛作用。如组蛋白H3和组蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferase, HAT)突变体HAT1通过Asf1p依赖的染色质重构影响DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)的修复[1]；组蛋白H4的乙酰化也影响了细胞DSB的修复活性[2]；组蛋白H2A除参与了DNA修复，还参与了细胞减数分裂和细胞凋亡等过程[3]。组蛋白H2A家族包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX，其中H2AX在H2A中含量很少，但在DNA损伤信号的分子感应和染色质代谢中发挥至关重要的作用[4]。我们就近年来组蛋白H2AX的研究进展作一综述。

　　1　H2AX的基本生物学特性
　　H2AX基因是在80年代被克隆的，H2AX是组蛋白H2A家族的成员之一，与组蛋白H2A家族的其它成员相比，其C末端区更长，且含有一个进化上高度保守的C末端基因序列。从酵母到人类，该C末端进化上高度保守的基因序列是以丝氨酸为关键的4个氨基酸残基组成SQ(E, D)。这种高度进化保守性提示H2AX C末端的基因序列可能有重要功能[5]。目前，在动物、植物、真菌类，多种原生生物如贾第鞭毛虫的进化中，都发现含有H2AX同源物。在啤酒酵母和非洲酒酵母中，完整的H2A家族由三个基因组成，两个H2AX同源物和一个H2AZ。四膜虫的H2A家族也有三个基因，除了一个H2AX基因和一个H2AZ同源物外还有一个基因编码H2A1同源物。H2AX的C末端残基是疏水性的，其SQ基因序列后都有一个酸性氨基酸残基。而H2AX的球部与C末端的距离随进化过程增加，如哺乳动物要比贾第鞭毛虫长16个碱基。
　　那么该高度保守的SQ基因序列究竟有何重要的功能？重要发现是：当外源性(如电离辐射，类放射性复合物)和内源性因素使细胞和动物体内的染色质DNA发生双链断裂时，该基序中第139位丝氨酸残基被快速磷酸化形成γ-H2AX[5]。

　　2　DNA双链断裂与H2AX快速磷酸化
　　无论是在高等的哺乳动物，还是低等的爪蟾、果蝇和酵母中，当电离辐射和其它因素使DNA发生双链断裂时，H2A C末端SQ基因序列均发生磷酸化，且磷酸化在DSBs产生后1 min开始出现，10 min达到高峰。针对磷酸化的H2AX C末端多肽的特异性抗体显示，γ-H2AX分子在间期核呈不连续的点状分布，在中期染色体呈带状，且带中所含免疫结合位点的数量与DNA双链断裂点的数量接近。随着DSBs被逐渐修复，γ-H2AX发生去磷酸化(半衰期约为2 h)，与DNA双链断裂的修复动力学相似。
　　在哺乳动物细胞中，每产生一个DSB约有0.03％ 的H2AX磷酸化，相当于H2AX随机分布于2 Mb 染色质区域，然而免疫细胞化学分析提示，这一区域比实际形成点的区域大10倍，说明并不是每一邻近的H2AX分子均会发生磷酸化[5]。
　　2.1　外界因素诱发DNA DSBs与γ-H2AX形成
　　γ-H2AX的形成实际上是细胞内一个快速敏感的DNA损伤信号分子感应，当环境、代谢等因素使细胞内的染色质DNA发生双链断裂时，SQ基因序列的139位丝氨酸残基快速发生磷酸化形成γ-H2AX。
　　用脉冲微束激光使细胞特定区域的DNA发生双链断裂，在这些位置出现γ-H2AX点。而培养的细胞在有丝分裂时受非致死剂量的电离辐射后，其染色体臂和已断裂的染色体臂γ-H2AX由点状变为带状结构，且在辐射后30 min即使DSBs还存在，这一带状结构也不再扩展。同样用微束激光处理单个细胞产生的γ-H2AX位点与激光路径一致，而且与Cy3-dCTP荧光标记的DNA DSBs末端图像径迹完全吻合[6]。
　　在羟基脲和紫外线作用下，培养的S期细胞形成γ-H2AX大大高于G1/G2/M期细胞，这种S期高γ-H2AX产率被认为是DNA复制叉破坏产生DSB的缘故[7]。而受到电离辐射作用的细胞，无论处于细胞周期那个阶段都能形成γ-H2AX。研究表明，细胞在羟基脲或紫外线作用后，γ-H2AX的产生依赖于ATM(Ataxiatelangiec-
tasia-mutatedgene, ATM)和Rad3相关蛋白ATR(ATM and Rad3 related protein, ATR)，但共济失调毛细血管扩张症突变基因缺陷不影响这两种因素所致γ-H2AX的产生。电离辐射恰恰相反，它诱发细胞形成γ-H2AX是依赖于ATM的功能而与ATR的功能无  关[8]。ATM敲除的鼠细胞系γ-H2AX形成出现严重障碍。当ATM敲除细胞系转染ATM基因后，经电离辐射后形成γ-H2AX。在体外对细胞提取物ATM做免疫沉淀发现结合有γ-H2AX，且从照射过的细胞提取的ATM免疫共沉淀物中 γ-H2AX形成要更加活  跃[9]。当DNA发生双链断裂后，细胞核中ATM部分残留在γ-H2AX位点[10]，10 min后，残留的ATM和γ-H2AX点都能看见，30 min密度最大，1 h后较弱[11,12]，说明电离辐射后γ-H2AX的形成主要与ATM有关。
　　影响电离辐射后细胞形成γ-H2AX的另一个激酶就是DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA dependent protein kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)。人类星形胶质瘤细胞系M059J无DNA-PKcs活性，受照射后γ-H2AX形成有部分缺失。磷脂酰肌醇(-3)激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase, PI-3K)抑制剂wortmannin对γ-H2AX位点和DNA修复蛋白形成的斑点有明显的抑制作用，而照射   5 min后加入则无效，表明γ-H2AX对其它因子聚集到DNA损伤部位是必需的。通过对ATR和DNA-PKcs缺陷细胞受电离辐射后H2AX磷酸化的动力学研究发现，ATR和DNA-PKcs在磷酸化过程中起互补作用[13]。
　　2.2　细胞自身代谢产生的DNA DSBs与γ-H2AX形成
　　除了环境因素引起DNA双链断裂外，真核细胞也会产生一些重要的生理性DNA断裂，如在哺乳动物免疫系统发育过程中DNA的V(D)J重排和细胞减数分裂过程的重组等细胞的凋亡过程都证实有γ-H2AX形成。
　　在哺乳动物免疫系统发育过程中，不同区域的基因组库通过V(D)J重组在机体形成各种不同的淋巴细胞群。这一过程包括从产生DNA双链断裂到DNA片段移位及DNA重新连接形成有功能的基因。V(D)J位点特异性DNA荧光素原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)探针检测发现，γ-H2AX在V(D)J重组位点出现[14]。
　　在细胞第一次减数分裂期的偶线期，同源染色体发生同源联会，而在细胞减数分裂粗线期，DNA重组由Spo11依赖的DSB启动，并与γ-H2AX的形成有关。早期重组以依赖于联会的方式进行，是因为γ-H2AX的消除无论在时间和空间上都与联会有关，即使这种联会是非同源的。H2AX－/－雄性小鼠由于不能处理在减数分裂的粗线期发生的DNA双链断裂而不育[15]，而H2AX＋/－细胞与H2AX－/－细胞相比，由同源重组引起的靶向性表型细胞的数量要降低10～20倍[16]。
　　2.3　γ-H2AX与DNA DSBs修复
　　在细胞和生物体中，H2AX－/－纯合子细胞对DNA DSBs的诱发因素如电离辐射和类放射药物高度敏感。H2AX－/－细胞系在自发和电离辐射诱导的异常中期染色体如染色体断裂、融合、交换、大范围的核碎裂等方面也要比正常细胞系高2～10倍[16]，表明γ-H2AX与DNA修复密切关联。
　　哺乳动物组蛋白H2AX的C末端区和酵母的H2AX含一致的PI-3K位点，在DSB后快速发生磷酸化形成γ-H2AX[5]，并快速形成核小点，这些核小点包括有重要DNA修复蛋白Nbs1，Rad51和Brcal1[17]。非同源末端连接(Nonhomoguous end joining, NHEJ)是DSBs的重要修复途径，用抗γ-H2AX抗体标记表明，在DNA连接后γ-H2AX仍存在，表明在细胞学能观察到末端连接并不意味着断裂DNA的修复在分子水平上是完全的[18]。
　　当各种因素引起DNA DSBs时，γ-H2AX在断裂位点形成，而作为组蛋白的H2AX以最直接的方式或最快的速率与损伤点接触，形成一种结构信号分子，为PI-3K如ATM或ATR提供高亲和位点。PI-3K激酶分子聚集到断裂位点，又促使该区域10％～20％的H2AX发生磷酸化。ATM分子能以γ-H2AX一样的速度积累并形成聚集的点。特异抗体检测发现，在γ-H2AX位点有多种DNA修复蛋白如BRCA1，Nbs1，53BP1，Rad50和Rad51[19]。Kobayashi   等[20]对DNA修复蛋白在γ-H2AX位点聚集进行了研究，结果发现，Nbs1与H2AX之间存在着一种磷酸化依赖的生物物理关系。Nbs1特殊的N末端区包含叉状头部区(Forkhead-associated, FHA)和BRCA1的C末端区BRCT(BRCA1 C-terminal, BRCT)域，这两个结构域与Nbs1和γ-H2AX的结合有关。这样，H2AX磷酸化的丝氨酸和Nbs1的FHA/BRCT结构域可能提供了一个新的信号识别分子聚合体。H2AX锚定在染色质上并标记断裂位点，移动因子如53BP1由于与γ-H2AX的C末端尾部有亲和力或染色质变构聚集到断裂位点[5]。
　　虽然H2AX缺陷对生命没有威胁，但H2AX对大量重要蛋白在辐射诱导聚集点(foci)的形成是必须的。Celeste等[21]发现，DSBs修复蛋白和信号蛋白的移位在H2AX－/－细胞不能被清除，Nbs1和Brca1等多种因子虽然最初聚集到DSBs位点，但终不能形成点。γ-H2AX并不构成DSBs修复蛋白重分布于损伤染色质的初始信号，但对断裂DNA附近的浓集蛋白起作用。H2AX的缺失虽然破坏了Nbs1聚集到修复位点，但并不影响聚集到复制点[16]。

　　3　γ-H2AX的临床医学意义
　　Banath等[4]通过对6种人类宫颈癌细胞系的DNA断裂与修复及γ-H2AX形成与消除的动力学研究发现，不同的细胞系经电离辐射照射后γ-H2AX的丢失有所差别，其中部分与细胞系本身的辐射敏感性有关。有辐射抵抗性的肿瘤组织或正常细胞系，在照射后的前几个小时内，γ-H2AX的消失速度要快的多。在辐射敏感的细胞或C3H鼠分离的正常组织，γ-H2AX的消失速度则相对较慢。应用流式细胞术检测培养细胞系、肿瘤细胞和正常组织DSBs后γ-H2AX的浓度，发现γ-H2X的表达可能为区分辐射敏感的肿瘤组织或正常组织提供信息[22]。
　　Kai等[23]发现，在培养的初始成纤维细胞系受很低的辐射剂量(≈1 mGy)照射时，DSBs很多天都不修复。这与高剂量照射时DSBs的高效修复形成鲜明对比。而经照射的培养细胞增值后与未经照射的细胞相比，其DSBs水平降低，提示这一效应可能是由含不能修复的DSBs的细胞的清除引起的。该结果与当前风险评估模型相比显示，在低剂量(1 mGy～200 mGy)和高剂量(10 Gy～80 Gy)辐照后，其细胞效应是同样有效的，提示γ-H2AX点的形成可能作为人类受低剂量电离辐射后直接的生物学标记。
　　成胶质细胞瘤是威胁人类生命的脑肿瘤。研究发现，具有辐射抗性的T98G成胶质细胞瘤细胞在转入H2AX后，对辐射和依托泊苷(抗肿瘤药)引起的DNA损伤敏感性增加。当转入H2AX的T98G细胞受电离辐射照射后，Brcal和Nbs1聚集到DSB位点，表现为细胞周期的G2/M期阻滞，并且照射后的H2AX-T98G细胞可观察到Brcal上调。转染H2AX并不影响在基因毒性刺激下非肿瘤细胞的生长活性，这表明H2AX基因的转入可能能克服基因组的不稳定性，为成胶质细胞瘤的放化疗提供了新的模型，而Brca1和Nbs1在这一方法中可能至关重要[24]。
　　组蛋白在DNA复制、转录、细胞周期和DNA损伤修复细胞凋亡等细胞事件中发挥着重要作用。对H2AX功能研究将有助于我们加深对一些基本细胞活动的认识，为临床应用提供理论基础。另外，γ-H2AX的免疫检测为多种肿瘤和遗传性疾病提供了有效的生物学指标，从而有助于肿瘤早期诊断和治疗。

动基体（kinetoplast）是在Trypanosoma类及Bodo类存在的具有自身繁殖性的细胞器。最早以细胞内的嗜伊红性的颗粒而记载，在鞭毛与基底小体会合的地方存在，亦称副基底小体。它是特化了的线粒体，含动基体 DNA（ K－DNA），有时只把含DNA的部位称为动基体。K－DNA由两种环状DNA即小型环状DNA（minicir－cle）与大型环状DNA（maxicircle）组成。小型环状 DNA数千个分子与少数大型环状 DNA以连环（catenane）状连接成网（ kinetoplast DNAnetwork），约占细胞全DNA量之20％。小型环状DNA占动基体DNA的95—97％，合约2500个核苷对、碱基对多种。而大型环状DNA含有 4万核苷对，为具有同一碱基排列顺序的DNA群。大型环状DNA一般认为相当于通常的线粒体DNA。

拓扑异构酶（topoisomerase） 　　是指通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。拓扑异构酶Ⅰ、通过切断DNA中的一条链减少负超螺旋，增加一个连环数。某些拓扑异构酶Ⅱ也称为DNA促旋酶。
　　DNA拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑状态。近来的研究表明，在RNA转录过程中，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模板的调节。主要存在两种哺乳动物拓扑异构酶。DNA拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。哺乳动物拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。拓扑异构酶毒素类药物的抗肿瘤活性与其对酶-DNA可分裂复合物的稳定性相关。这类药物通过稳定酶-DNA可分裂复合物，有效地将酶转换成纤维毒素。
临床使用的几种抗肿瘤药物可以作为哺乳动物异构酶II型毒素。这些药物包括阿霉素（adriamycin）、放线霉素D（actinomycinD）、道诺梅素（daunomycin）、VP-16、VM-26（替尼泊苷teniposide或者表鬼臼毒素（epipodophyllotoxin）。相对来说，无论是临床，还是处在试验阶段的，作为哺乳动物异构酶II型毒素的药物较多，而目前确定可以作为拓扑异构酶I毒素的药物只有极少数。喜树碱（Camptothecin）及其类似体是研究得最为广泛的拓扑异构酶I型毒素。最近已被确定为拓扑异构酶I型的毒素有： 　　双-和四苯咪唑（Chen等，CancerRes.1993,53,1332-1335;Sun等,J.Med.Chem.1995,38,3638-3644；Kim等,J.Med.Chem.1996,39,992-998），某些白屈菜生物碱（benzo[c]phenanthridine）和原小檗碱类生物碱（protoberberine）与合成的类似体（Makhey等，Med.Chem.Res.1995,5,1-12； Janin等，J.Med.Chem.1975，18，708-713；Makhey等，Bioorg.&Med.Chem.1996,4,781-791），以及bulgerain（Fujii等,J.Biol.Chem.1993，268，13160-13165），saintopin（Yamashita等，Biochemistry1991，30，5838-5845）和indolocarbazoles(Yamashita等，Biochemistry1992，31，12069-12075)。其他被确定的拓扑异构酶毒素则包括某些白屈菜生物碱（benzophenanthridine）和cinnoline化合物（见LaVoie等，美国专利6140328，以及WO01/32631）。尽管这些化合物大有用途，但是由于其较低的溶解性使得他们的应用受到限制。 　　2006年1月下旬，美国专利局连续授予了美国新泽西大学关于以拓扑异构酶（topoisomerase）为作用靶位的氨基和硝基替代类药物的合成及应用的四个专利。
　　可以分两类：一类叫拓扑异构酶I，一类叫拓扑异构酶II。拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。E.coli DNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链．它们通常需要能量辅因子ATP。在拓扑异构酶II中又可以分为两个亚类：一个亚类是DNA旋转酶(DNA gyrase )，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶．另一个亚类是转变超螺旋DNA(包括正超螺旋和负超螺旋)成为没有超螺旋的松弛形式(relaxed form )。这一反应虽然是热力学上有利的方向，但不知道为什么它们仍然像DNA旋转酶一样需要ATP，这可能与恢复酶的构象有关。这一类酶在原核生物和真核生物中都有发现。
拓扑异构酶I
　　DNA拓扑异构酶能催化的反应很多，这里只能作简单叙述。DNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快。现已知道，生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶1和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码E．coli拓扑异构酶I的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。拓扑异构酶I作用的碱基序列特异性不高，但切点一定在C的下游方向4个碱基(包括C本身)的位置。在将DNA单链切断后，拓扑异构酶I连接于切口的5端，并贮藏了水解磷酸二脂键的能量用以连接切口，因而拓扑异构酶I的作用不需能量供应。此外．拓扑异构酶I还能促进两个单链环的复性，其作用是解除复性过程所产生的链环数的负值压力，以使复性过程进行到底。如果在一个单链环上一个部位切断，而使另一部位绕过切口．则可产生三叶结结构分子 (trefoil knot)。如果有两个双链环，其中一个有一个切刻，拓扑异构酶1则可以将切刻对面的一条链切断，伎完整的双链环套进去，再连接起来而成为环连体分子(catenane)，以上这三种反应示于右图。拓扑异构酶I还能催化其他反应，这将在复制和重组的机制中再讲述。
拓扑异构酶II
　　大肠杆菌的拓扑异构酶II(gyrase)除了引入负超螺旋以外．还具有形成或拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。II类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链DNA结合。DNA旋转酶有两个α亚基和两个β亚基。α亚基约105KDa，为gyrA基因所编码，具有磷酸二脂酶活性，可为萘啶酮酸(nalidixic acid )所抑制。A亚基约95KD，为graB基因所编码，具有ATP酶活性，可为新生霉素(novobiocin )所抑制。这两种药物均可抑制野生型大肠杆菌的DNA复制。可见DNA旋转酶为E．coli的复制所不可缺少的。在切断一条DNA双链后，两个a亚基各结合于切口的一个5'端，并贮藏了水解磷酸二酯键而获得的能量，由于该酶的整体性，因而DNA链的四个断头并无任意旋转的可能性。由于酶的别构效应，使完整的双链穿过切口，然后再重新形成磷酸二酯键。β亚基的功能在于水解ATP以使酶分子恢复原来的构象，以便进行下一轮反应。这一点可以用ATP的同系物β,γ-亚氨基ATP代替ATP而得到证实。因为这一同系物不能被DNA旋转酶所水解，但它确能促进第一轮拓扑异构反应，使负超螺旋增加，而妨碍以后进一步的拓扑异构反应。
编辑本段DNA拓扑异构酶催化反应
　　很多，其反应本质是先切断DNA的磷酸二脂键，改变DNA的链环数之后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能．然而它们并不能连接事先已经存在的断裂DNA，也就是说，其断裂反应与连接反应是相互耦联的。拓扑异构酶（包括Ⅰ型和II型）都可以用符号转化模型进行解释（下图左中） 　　除了DNA拓扑异构酶可以产生异构变化以外，很多能够嵌入相邻碱基之间影响碱基堆集作用的试剂，特别是片状的染料分子．也能改变DNA的拓扑状态，最明显的例子就是溴化乙锭(ethidium bromide)。例如以SV40的CCC分子与溴化乙锭的结合试验为例，当没有染料时，此DNA为负超螺旋，具有较高的沉降常数(21S)；当加入染料分子与核苷酸之比为0.05时，沉降数降至l6S，此时DNA为没有超螺旋的松弛形式；当染料分子和核苷酸的比值增加到0.09时，沉降常数又上升到大约21S，此时DNA分子为正超螺旋。这种关系如上图右所示，不过要注意的是，溴化乙锭并没有改变Lk值，只不过是由溴化乙锭分子的嵌入，增加了局部DNA二级结构的紧缠状态。因而，随着嵌入染料分子数的增多，起初表现为负超螺旋的减少与消失，随后便是正超螺旋的增加。这与单链DNA结合蛋白促进负超螺旋转变为泡状结构的情况是类似的。 　　拓扑异构酶（topoisomerase）:通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来改变DNA连环数的酶。拓扑异构酶Ⅰ、通过切断DNA中的一条链减少负超螺旋，增加一个连环数。某些拓扑异构酶Ⅱ也称为DNA促旋酶。
编辑本段DNA拓扑异构酶 DNA topoisomerase
　　为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶（top- oisomeraseⅠ），通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶（topoisomeraseⅡ）。属于Ⅰ型的拓扑异构酶，有大肠杆菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11万的单个多肽链所成）及各种真核细胞中存在的切断-结合酶（nicking-closing enzyme，分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的）。Ⅱ型拓扑异构酶，有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。另外，噬菌体λ的irt基因产物和噬菌体φX174的基因A的产物等也具有切断—结合酶的活性，可认为是拓扑异构酶之一种。Ⅰ型拓扑异构酶不需要ATP的能量而催化异构体化，作为反应的中间产物，在原核生物来说是游离型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端与酶形成共价键，而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端与酶形成共价键。此酯键中所贮存的能量，可能在切断端的再结合上起着作用。Ⅰ型拓扑异构化酶催化的反应有下列各种：使超螺旋DNA在每一切断—结合反应中，使L数（参见DNA拓扑学异构体）发生一种变化，即松弛（relaxation）（图1）。将互补的单链环状DNA转变成具有螺旋结构的双链环状DNA（图 2），使单链DNA打结（topological knot）或解结（图3）。另外在二个环状双链DNA一个分子的一个链切断时，形成链环状二聚体的分子（ca-tenane）。在Ⅱ型拓扑异构酶中，DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋，这是独特的。其它二个型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，还可催化促旋酶的催化反应。真核细胞的拓扑异构酶Ⅰ，参与核小体的形成，细菌的ω蛋白参与转录和某种转位子的插入。促旋酶和T4拓扑异构酶Ⅱ参与DNA的复制和转录过程。　DNA 拓扑异构酶 I （DNA Topoisomerase I）催化4种反应：①超螺旋的松弛；②绳结(knot)的形成；③环状双链分子的形成；④环状双链分子的连接。本酶由于来源于小牛胸腺，与来源于原核生物的酶性质不同，即使在Mg2+不存在的条件下也显示活性。而且，原核生物由来的DNA Topoisomerase I 只作用负链的超螺旋分子，而本酶则能使正负两方的超螺旋分子均形成松散型。
编辑本段用途
　　DNA的结构转换和解析 　　Ⅱ型拓扑异构酶 　　Ⅱ型拓扑异构酶巧妙地执行了打开DNA双螺旋的过程。它将DNA的一个双螺旋结构切开，并让另一个螺旋从缺口处穿过，在此之后一个双螺旋便被打开。这里显示的图片是由两个蛋白构建的：这个编号为1bgw的蛋白具有拓扑异构酶的下半部分结构，另外一个编号为1eil的蛋白来自于一个旋转酶的结构域，它与拓扑异构酶的上部很相似。拓扑异构酶具有很高的催化活性，它具有一些类似于“门”的结构，控制着DNA进入到其上面的两个裂口内。 此处用红色显示的两个酪氨酸与DNA链相结合并形成共价键，并且这种紧密的结合方式直到DNA重新恢复为止。 　　具体的讲解可以到这几个URL查看 DNA复制 拓扑异构酶的视频文件URL
编辑本段作用
　　是使超级螺旋松弛。所谓超级螺旋是DNA中张力积聚的形式。拓扑异构酶抑制成分是重要抗肿瘤药物，被认为通过稳定拓扑异构酶与DNA之间所形成的一种共价复合物来发挥作用，后者又为DNA复制机制设置了一障碍。科学家对以拓扑异构酶为作用目标的药物的药效起源仍不是很了解，但现在对Topotecan（一种主要用来治疗卵巢癌和小细胞肺癌的药物）和一种拓扑异构酶IB-DNA复合物之间的相互作用所做的单分子研究，显示了一过程中为详细的内容。本期封面图片所示为由于该药物的作用而造成的正向DNA超级螺旋的积累。DNA的这种超级缠绕会妨碍一种DNA聚合酶的前行，并且在阻止或破坏复制叉，从而导致细胞死亡过程中也可能扮演一个角色。
编辑本段DNA螺旋与拓扑异构酶相互作用的新发现
一个荷兰人领导的国际性研究组在分子水平上破解了自然释放DNA中积累起来的扭曲张力的机制。来自Delft理工大学、Ecole Normale Superieure和Sloan-Kettering研究所的研究人员将他们的发现公布在3月31日的《自然》杂志上，并成为这一期杂志的封面。 　　IB型拓扑异构酶能够释放DNA链中积累的扭力。研究过程中，研究人员能够在分子水平上跟踪一个单个的拓扑异构酶分子一段时间内在单个DNA分子上的活动。拓扑异构酶能够夹着DNA、切开两个DNA链中的一个并使DNA在与粘性末端重新结合在一起前变得舒展。在灵敏的检测仪器的帮助下，研究人员能够测量不同参数，如在酶空腔中的旋转的DNA的摩擦力。这项研究对DNA和这种酶之间的相互作用有了新的了解。 　　DNA的两个单链纽在一起并形成双螺旋结构，而双链的碱基对序列储存着遗传信息。在细胞分裂过程中，遗传物质被复制并且负责复制的酶必须能够将这些碱基序列转录。但是要实现这个过程就必须将需要转录的DNA部分变直。这种缠绕和舒展共存的DNA分子中产生了扭力，其扭力的大小随着细胞分裂过程的发展而增加。这种力能够延迟细胞分裂过程并且在一些情况下甚至终止分裂，而IB型拓扑异构酶则能减少这些扭力。 　　这种酶释放DNA扭力的步骤如下：拓扑异构酶先像夹子一样夹住双链DNA，然后瞬时穿过两条DNA链中的其中一条。DNA分子中积累的这种扭力然后在完整链附近被消磨掉。在旋转之后，这种酶再次紧紧抓住旋转的DNA并将断裂的链重新粘连起来。研究人员能够测定出这种拓扑异构酶在剪切和粘连过程之间卸掉的超螺旋的确切数目。 　　IB型拓扑异构酶工作的精确机制还对癌症研究有重要意义。能够抑制IB拓扑异构酶功能的药物已在临床上有所使用，但它们的使用可能在获得这些发现后得到改善

122卷第5期《细胞》杂志（Cell）封面是一双错配的袜子，配以的文章是关于DNA错配和修复的。文章的通讯作者为华人科学家——李国民，他曾经就读于武汉大学生物系，在那里获得了理学学士学位。后来又在美国韦恩州立大学取得理学博士学位，目前是美国肯塔基大学的副教授。
李教授多年来从事DNA复制错配修复研究。我们知道DNA除了外界环境影响会造成损伤外，在其本身的复制过程中也会出现错配。尽管这种出错的几率十分微小，但是生命这台精密的仪器不允许任何差错。因为就算是一个碱基的错配也可能造成严重的疾病。如果错配修复基因存在缺陷的话就可能造成癌症，比如：遗传性非多发性息肉结肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer）。
对于复制过程中出现的错误，比如碱基错配、少量插入、缺失，机体内本身就存在有校正机制。这种校正机制通常可以由DNA聚合酶3’→5’的校对功能立即进行纠正。如果DNA聚合酶没有发现错配，就需要错配修复（mismatch repair, MMR）系统来完成。
在大肠杆菌中的错配修复系统已经研究得十分透彻了（如下图所示）。这个系统主要包括酶错配矫正酶（mismatch correction enzyme）、DNA聚合酶Ⅲ和DNA连接酶等11种蛋白参与。可以分为步骤：启始、切除和修复。启始：根据序列上GATC中腺嘌呤（A）的甲基化程度不同，酶错配矫正酶中的MutS部分识别错配区域，而MutH和MutL识别没有甲基化的GATC序列。之后，将新合成的单链上切出一个缺口（nick）。切除：由核酸外切酶将距离GATC到错配区域间的DNA链切除。为了防止剩下的暴露的单链遭到降解，需要有单链结合蛋白（Ssb）将其保护起来。修复：由DNA聚合酶Ⅲ全酶进行合成，连接酶对缺口进行连接。生物通

错配修复系统是一种高度保守的途经。理论上，它在真核系统中的修复过程应该与原核系统中的相类似。原核系统是依靠甲基化程度来判断哪条是新合成链，而在真核系统中是如何识别错配单链的机制尚未明确。但是，人们在体外可以利用含有MutSα或者MutSβ、MutLα、RPA、PCNA、EXO1、HMGB1、RFC和DNA聚合酶δ的系统将含有缺口的双链DNA进行修复。生物通
本期Cell的封面文章就是《在纯化后的系统中重构人类5’方向修复系统》（Reconstitution of 5′-Directed Human Mismatch Repair in a Purified System）。文章利用纯化后的人源蛋白在体外对5’方向存在缺口的错配DNA进行了修复。这一系统包括了MutSα或者MutSβ、MutLα、RPA、PCNA、EXO1、HMGB1、RFC和DNA聚合酶δ蛋白。在这个系统中，MutSβ对于碱基错配的修复作用十分有限，它对于插入/缺失错配的修复率比MutSα高；MutSα对于两种类型的错配修复率是一样的。MutLα可以减低EXO1的酶切活性，并且在错配区域被切除后MutLα可以终止EXO1的催化切除效果。如果缺乏MutLα蛋白EXO1就会无法停止作用而切除过多的DNA。
RPA和HMGB1在MutSα激活的EXO1催化切除的错配修复启始、切除过程中起到相似但是互补的作用，但是RPA在协助MutLα调节切除过错配区域后的终止过程中起到完全不同的作用。一个碱基有效的错配修复需要MutSα-MutLα多分子复合物的参与。这一研究描述了一种由错配引起的DNA切除的启始和终止模式。
在体外重新构建的错配修复系统能执行的只是体内错配修复系统的一部分功能。它必须以出现缺口的双链DNA为底物进行反应，而在体内这种缺口产生的机制仍不清楚，特别是先导链（leading strand）缺口的产生。在这项研究中将真核系统错配修复系统中MutLα的作用机理进行了进一步的阐明，是MutLα使EXO1失去酶切的活性，从而使切除反应终止。这对于错配修复系统是否能正常工作是一个关键的步骤。
中国科学院上海药物研究所丁健研究员最近应邀在国际著名的药理学杂志Trends in Pharmacological Sciences(Trends Pharmacol Sci 2006; 27:338-344)(IF 10.372)上发表了题为Emerging cancer therapeutic opportunities target DNA-repair systems的综述性文章，系统地总结了当前DNA修复及DNA修复干扰的研究现状，提出了通过DNA修复干扰增强DNA损伤剂的抗肿瘤疗效、克服肿瘤耐药的构想，揭示出DNA修复系统中潜藏的抗肿瘤治疗新机会。
 损伤DNA是当前临床治疗肿瘤常用的离子辐射及绝大多数抗癌药物共同的基本分子机制。不同因素导致的DNA损伤可以通过六条既相互依存又相互独立的修复通路予以修复。DNA修复能力异常激活和增强是导致肿瘤对DNA损伤剂先天性或获得性耐药的重要分子基础；相反，修复缺陷则使肿瘤对其高敏感。DNA修复的遗传性缺陷也是多种遗传性疾病的分子基础，这些患者常常表现出极高的肿瘤易感性。所有这些构成了将干扰DNA修复作为一种抗肿瘤辅助治疗措施的基础。目前已有约十种靶向不同DNA修复分子的化合物正在进行不同阶段的临床试验。现有资料显示，O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)抑制剂和聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂是两类有希望的抗肿瘤辅助药物。前者与氯乙基或甲基化烷化剂合用可显著增强后者在多种实体瘤包括结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、胶质瘤的疗效；而后者更为特别的是，其单独使用即可对同源重组修复缺陷(如BRCA1、BRCA2缺陷)的肿瘤产生高度选择性杀伤作用。另一特别值得关注的是，由中国科学院上海药物研究所研发的抗肿瘤新药沙尔威辛可以直接损伤DNA并干扰DNA非同源重组修复通路，延缓耐药性的产生，增强治疗效果，开创了同一药物兼具损伤DNA和干扰修复双重作用的范式
DNA修复（DNA repairing）
一、DNA的损伤
环境作用
1.物理因素 　　紫外线：形成嘧啶二聚体，使转录终止，复制受阻。 　　电离辐射：αβγX-射线等，主要通过电离作用造成损伤。可造成多种损伤，如DNA断裂、碱基脱落、杂环破裂、氧化等。 　　
2.化学因素 　　烷化剂：有活泼烷基，可转移到碱基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子气等。鸟嘌呤的O6和N7最易烷化，导致错配(GT)或脱落。磷酸三酯不稳定，易断裂。双功能试剂可造成交联。 　　碱基或核苷类似物：FU、BrdU、6-巯