双向凝胶电泳.pdf

目录 第一章 样品制备 2 1.1 一般性原则 2 1.2 样品制备程序 3 1.2.1 培养细胞样品处理方法 3 1.2.2 组织样品处理方法 3 1.2.3文献报道较多的裂解液配方 4 第二章 第一向等电聚焦（IEF）7 2.1 IPG胶条的水化和电泳 7 2.1.1 仪器 7 2.1.2 试剂 7 2.1.3 实验步骤 7 2.2 IPG胶条的平衡 9 2.2.1 仪器 10 2.2.2 试剂 10 2.2.3 实验步骤 10 第三章 第二向 SDS电泳 12 3.1 垂直 SDS-PAGE 12 3.1.1 溶液 12 3.1.2 灌胶步骤 12 3.1.3 电泳步骤 14 第四章 2-DE胶蛋白质点的检测 15 4.1 考马斯亮兰染色 15 4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 15 4.1.2 Neuhoff胶体考染法 15 4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 16 4.2 硝酸银染色 16 1 Appendix I Troubleshooting 18 Appendix II Solutions 23 2DE 分析流程：样品制备（Sample preparation）固相 pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）第一向等电聚焦（IEF）第一向胶条的平衡（IPG strip equilibration）第二向 SDS 电泳（SDS-PAGE）检测染色（Detection/Staining）2 第一章 样品制备（Sample Preparation）1.1 一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用 NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑 制剂（如 EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 IPG 胶条；这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。3 1.2 样品制备程序：1.2.1 培养细胞（culture cell）样品处理方法：培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：(A)7M Urea，2M Thiourea，4（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2 Pharmalyte pH 3-10.其他常用的裂解缓冲液如下：(B)9.5M urea,2%(w/v)CHAPS,0.8%(w/v)Phamarlyte pH3-10,1%(w/v)DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;(C)加入 0.3-1%SDS 在 95 oC 煮样品 5mins，冷却后加入至少 5倍体积的（A）或（B）裂解液。总蛋白抽提程序：（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞 3 次（室温，1000g，各 2min）；（3）将细胞分装到 1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的 PBS；（4）加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入 100L 裂解液），在室温振荡 1h，使其充分溶解；（5）4oC，40,000g，离心 1h；（6）吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78oC 备用。1.2.2 组织样品处理方法：对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。4 三氯醋酸丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：（1）在液氮中研碎叶片；（2）悬浮于含 10三氯醋酸（TCA）和 0.07%-巯基乙醇(可用 DTT替代)的丙酮溶液在20 oC 的冰浴；（3）让蛋白质沉淀过夜然后离心（4oC，40,000g,1h），弃上清；（4）重悬沉淀浮于含 0.07%-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；（5）离心（4oC，40,000g,1h）后真空干燥沉淀；（6）用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4oC，40,000g,1h）。（7）Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78oC备用。超速离心法：（1）取材；（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每 1g样品加入 0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆 30 s；（3）组织悬液 15，10 000 g离心 10 min；（4）上清液 4，150 000 g超速离心 45 min；（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清 6 40,000g再次离心 50 min；（6）取离心上清。Bradford法定量，分装后置 75保存。1.2.3 文献报道较多的裂解液配方 Lysis buffer A (9 M urea,4%w/v CHAPS,1%w/v DTT,0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors)Final concentration Amount Urea(FW 60.06,Sigma,99.5%)9 M 10.8 g CHAPS(FW 614.89,Sigma,98%4%(w/v)0.8 g Ultrapure H2O to 20 ml 5 prepare fresh or store in aliquots at 20 A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25,Promega)1%13 L/200 L Lysis buffer(15.5stock),-20 Lysis buffer B (7 M urea,2 M thiourea,4%w/v CHAPS,1%w/v DTT,0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer C 40 mM Tris-base(pH 9.5)in ultrapure H2O Lysis buffer D (8 M urea,4%CHAPS,40 mM Tris(base),40 ml)Final concentration Amount Urea(FW 60.06)8 M 9.6 g CHAPS 4%(w/v)0.8 g Tris base(FW 121.1)Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at 20 A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25,Promega)1%13 L/200 L Lysis buffer(15.5stock),-20 6 Lysis buffer E (5 M urea,2 M thiourea,2%SB 3-10,2%CHAPS,1%w/v DTT,0.5%CA and a cocktail of protease inhibitors)Final conc.Amount Urea 5 M 3.0 g Thiourea(FW 76.12)2 M 1.52 g SB 3-10(FW 307.5)2%0.2 g CHAPS 2%0.2 g Ultrapure H2O to 10 ml A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25,Promega)1%13 L/200 L Lysis buffer(15.5 stock),-20 Lysis buffer F 100 L SDS sample solution(1%w/v SDS,0.375 M Tris-HCl,pH 8.8,50 mM DTT,25%v/v glycerol 注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和 DTT在临用前加入。广谱蛋白酶抑制剂混合物（如加 tris 可不用此混合物）成分 终浓度 PMSF 35 g/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml(1 mM)抑肽素 0.7 g/ml 蛋白酶抑制剂混合物 亮肽素 0.5 g/ml 其中 C-F是分步法提取的 4种裂解液配方,C 适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F适于提取难溶的沉淀蛋白。欲了解更详细的样品制备信息，可参考：h t t p:/u s.e x p a s y.o r g/c h 2 d/p r o t o c o l s/p r o t o c o l s.f m 1.h t m l.7 第二章 第一向等电聚焦（IEF）双向电泳的第一向 IEF 电泳采用 IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor 包括半导体温控系统(18 C-25 C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步 完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor 一次可进行 12 个胶条槽的电泳(7,11,13，18，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出 的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的 IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。2.1 IPG 胶条的水化和电泳 2.1.1 仪器：IPGphor 2.1.2 试剂：水化液（8M 尿素，2%CHAPS，15mM DTT 和 0.5%IPG 缓冲液）:水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20 度保存，但不可反复冻融)。尿素溶液加热温度不能超过 37C，否则蛋白会发生氨甲酰化。2.1.3实验步骤：一.加样品水化 1.用 样 品 溶 解 缓 冲 液(9 M 尿 素，4%C H A P S，2%IPG 缓 冲 液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。蛋白质上样浓度不要超过 10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。2.吸取适量(见表 2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。8 表 2.1IPG 胶条所需水化液体积 胶条长度(cm)每条需水化液体积*(l)7 125 11 200 13 250 18 350 24 450 *如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积 3.从酸性端（尖端）一侧剥去 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。4.IPG 胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子。5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。6.设置 IPGphor 仪器运行参数：IPG 胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表 2.2。表 2.2 IPGphor 运行条件 温度 20 C 最大电流 0.05 mA per IPG strip 样品体积 350 l(180 mm 长 IPG strip)电压 时间 30 V 10-12 hours(水化),200 V 1 hour 500 V 1 hour,500-8000 V 30 min 8000 V 3 hours(IPG 4-7);2 hours(IPG 4-9,3-10L,3-10NL)低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。7.IPG 胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。8.暂时不进行第二向的 IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80 C 保存几个 9 月。注意：不推荐每条 IPG 胶条的电流超过 50A，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG 胶条甚至会烧胶。二.不加样品水化(一)标准型胶条槽：1.用适量的水化液进行胶条水化，方法同步骤 3-5，水化过夜。2.于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入 7.5l样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入 30l 样品。3.设置 IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见表 。4.进行等电聚焦电泳。5.暂时不进行第二向的 IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80 C 保存几个月。(二)通用型杯上样胶条槽：1.采用 Immobiline DryStrip 水化盘或标准型胶条槽进行 IPG 胶条的水化，加入适量的 水化液进行胶条水化，方法同步骤 3-4，水化过夜。2.将通用型杯上样胶条槽的尖端与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。3.将已水化的 IPG 胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将 IPG胶条尖端(阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与 IPGphor 仪器的两个电极板接触的区域。对于 7cm 和 11cmIPG胶条，需将 IPG 胶条的平端距离胶条槽平端大约 1.5cm 处放置，并确保胶条位于胶条槽的中央(通用型杯上样胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置的位置)。4.在 IPG 胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽。5.取两个 IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。6.分别将两个 IEF 电极片放在 IPG 胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。7.样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的 IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。10 8.在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。9.上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样 100l。10.盖上胶条槽的盖子，再盖 IPGphor 仪器的盖子。11.设置 IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表。2.2 IPG胶条的平衡：IPG 胶条平衡两次，每次 15 分钟。平衡缓冲液包括 6 M 尿素和 30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入 DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的 DTT 烷基化(银染过程中，DTT 会导致点拖尾point streaking)。将 IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向 SDS 胶中。如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从 IPG 胶条转移到 SDS 胶的效率。这种情况下建议在蛋白从 IPG 胶条转移到 SDS 胶后，将 IPG 胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG胶条。2.2.1 仪器：玻璃管(200 mm 长,20 mm i.d.),Parafilm,振荡仪 2.2.2 试剂：1.4x 分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl,pH8.8 和 0.4%（w/v）SDS）：45.5g Tris 和 1g SDS 溶于 200ml 去离子水中，用 6N HCl 调节 pH 到 8.8，最后用去 离子水将体积补足到 250ml，加入 25mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于 4C 储存两周。2.平衡缓冲液(0.05 M Tris-HCl,pH 8.8，6 M 尿素,30%(w/v)甘油和 2%(w/v)SDS)：180 g 尿素,150 g 甘油,10 g SDS 和 16.7 ml 分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将 体积补足到 500ml。此种缓冲液可于 室温下保存两周。3.溴酚蓝溶液:0.25%(w/v)溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中 25 mg 溴酚蓝溶于 10 ml 分离胶缓冲液中，4C 储存。11 2.2.3 实验步骤：1.使用前每 10ml 平衡缓冲液中加入 100mg DTT(相当于平衡缓冲液 I)，根据表 2.3 加入适量平衡缓冲液 I 和溴酚蓝溶液。取出 IPG 胶条分别放入玻璃管中(支持膜贴着管壁，每个玻璃管中放入一条 IPG 胶条)，用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液 I。2.每 10ml 平衡缓冲液加入 400mg 碘乙酰胺(相当于平衡缓冲液 II)。根据下表加入适量平衡缓冲液 II 和溴酚蓝溶液。用 Parafilm 封口，在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液 II。表 2.3 IPG 胶条平衡液用量 胶条长度(cm)建议平衡液体积(ml)/条 溴酚蓝溶液(l)7 2.5-5 12.5-25 11 5-10 25-50 13 5-10 25-50 18 10 50 24 15 70 3.用去离子水润洗 IPG 胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分 钟，以去除多余的平衡缓冲液。4.IPG 胶条的转移：将 IPG 胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将 IPG 胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在 IPG 胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。5.可选操作：加入分子量标准蛋白 分子量标准蛋白溶液与等体积的 1%琼脂糖溶液混合后，加入到 IEF上样纸片上能得到很好的效果。终浓度为 0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。其他可选的方法是，将标准蛋白以 15-20 l 的体积加入到 IEF 上样滤纸片。如要减少加样量将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在 IPG 胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。6.最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液（约 1-1.5ml)使 IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。12 第三章 第二向 SDS 电泳 目前由于更多的使用垂直的系统来进行第二向 SDS-PAGE，故这里不再介绍水平的 MultiphorII 系统。3.1 垂直 SDS-PAGE：3.1.1 溶液：1.丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到 1000ml。过滤后可于 4C 储存两周。2.分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl,pH8.6 和 0.4%（w/v）SDS）：90.85gTris 和 2gSDS 溶于 400ml 去离子水中，用 6N HCl 调节 pH 到 8.6，最后用去离子水将体积补足到 500ml，加入 50mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于 4C 储存两周。3.10%（w/v）过硫酸铵溶液：1g 过硫酸铵溶于 10ml 去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。4.覆盖液（缓冲液饱和的异丁醇）：混合 20ml 上述分离胶缓冲液和 30ml 异丁醇，等几分钟后去掉异丁醇层。5.取代液（50%(v/v)甘油和 0.01%溴酚蓝水溶液）：混合 250ml 甘油（100%）和 250ml 去离子水，再加入 50mg 溴酚蓝，搅拌几分钟。6.低熔点琼脂糖溶液：含有 0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。3.1.2 灌胶步骤：根据第一向 IEF 电泳时 IPG 胶条的大小选择第二向合适的垂直电泳槽。最新推出的 Ettan DALT II 是为大规模、高通量、高重复性双向电泳第二向SDS-PAGE 专门设计的。同时进行 12 块 26 x 20cm 板胶电泳，适于长至24cmIPG 胶条。其灌胶模具每次最多可 灌制 14 块胶。通常不需要浓缩胶。13 表 3.1 凝胶浓度与其对应的分离范围 胶浓度 分离范围(KD)5%36-200 7.5%24-200 10%14-200 12.5%14-100 15%14-60 表 2.3 灌制垂直 SDS 胶的配方 10%T，2.6%C 12.5%T，2.6%C 15%T，2.6%C 单体贮存液 4x 分离胶缓冲液 10%SDS 去离子水 33.3ml 25ml 1ml 40.2ml 41.7ml 25ml 1ml 31.8ml 50ml 25ml 1ml 23.5ml TEMED*过硫酸铵*（10%）33l 500 l 33 l 500 l 33 l 500 l 最终体积 100ml 100ml 100ml*TEMED 和过硫酸铵在灌胶前再加 胶的组成：分离胶：10%T、12.5%T 或 15%T 的均匀胶，2.6%C，0.1%SDS,375mM Tris-HCl PH8.8 垂直电泳仪器类型 配制凝胶溶液体积(ml)MiniVE or SE260(10X10.5cm 玻 璃板)1mm 厚的胶 10 1.5mm 厚的胶 15 SE600(18X16cm 玻璃板)1mm 厚的胶 30 1.5mm 厚的胶 45 Ettan DALT II(26x20cm 胶)14 块 1mm 厚的胶 950 14 1.按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液（在 Hofer DALT 和 Ettan DALT II 的灌胶模具中，拔掉灌胶的胶管后，取代液会把管道中剩余的凝胶溶液压入模具中）。在每块胶的上面加入覆盖液以得到平的凝胶上样平面。2.灌胶后立即在每块凝胶上铺上一层用水饱和的正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶面。3.同时灌制多块凝胶时，室温下至少聚合 3 小时。聚合后倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面。4.暂时不需要的凝胶可用塑料薄膜包好于 4C 保存 1-2 天。将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可 4C 条件下保存 1-2 周。3.1.3 电泳步骤：1.电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为 15 C。2.将平衡好的 IPG 胶条浸入电极缓冲液中几秒钟。3.将 IPG 胶条小心的放置于 SDS 胶面上，并轻压使 IPG 胶条与 SDS 胶面充分结合，上面覆盖 2ml 热的琼脂糖溶液(75 C)，使琼脂糖在 5 分钟内凝固。其余的 IPG 胶条重复上述操作。4.将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。采用垂直的 SDS 胶电泳，不必象水平电泳一样，电泳过程中去除 IPG 胶条。6.当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。7.跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。附 1：SE600 系统电泳参数：Constant current，15oC Phase Current Duration 1 10mA per gel 15 min 2 20mA per gel Approximately 5 h 附 2：Ettan Dalt II 系统电泳参数：Constant power,20oC Phase Current Duration 1 5w per gel 45 min 2 20w per gel Approximately 6 h 15 第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测 2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等。这几种检测方法的灵敏度各不相同。目前最常用的是银染法和考染法。由于银染的灵敏度是考染的 50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。4.1 考马斯亮兰染色:4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序：1 固定 20%TCA 1h 2 染色 0.1%CBB in 40%EtOH/10%acetic acid 2h 3 脱色 40%EtOH&10%acetic acid 2x 30 min 4 强化 1%acetic acid overnight 5 清洗 deionized H2O 30 min 局限：灵敏度低（1g protein/spot）4.1.2 Neuhoff 胶体考染法：1 固定：12（w/v）三氯醋酸（TCA）2h 2 染色：200ml 染色液混合 50ml 甲醇 16-24h 染色液：在 490ml 含 2（w/v）的 H3PO4中加 50g(NH4)2SO4直至完全溶解，再加 0.5g CBB G-250（已溶于 10mlH2O 中），搅拌混合。无需过滤，使用前摇匀。3 漂洗：1）0.1 mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；2）25（v/v）甲醇漂洗不超过 1min 16 4 稳定：在 20的(NH4)2SO4中稳定蛋白质染料复合物。优点：背景低，灵敏度高，可达到 200ng protein/spot.4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：1 染色（0.025%(w/v)考马斯亮兰 R350）：将 1 片 Phast Gel Blue 药片溶入 1.6L 10%醋酸，将染色液加热到 90oC 倒入凝胶染色盘，振荡10min；2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色 2h，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；脱色液和染色液可重复使用。脱色后的凝胶可进行扫描分析，选中的点可用 Spot Picker 自动切胶仪挖出，再进行后续的硝酸银染色可得到更多的蛋白点。用考马斯亮兰预染过的胶再进行银染灵敏度比单独银染更高，且热染过程迅速。二次染色 待考马斯亮兰染色后的背景完全脱除后，可用以下的银染法进行二次染色。因为蛋白点已经经过固定，可直接从敏化步骤开始染色。4.2 硝酸银染色：银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于 1 ng/蛋白质点，故广泛的用在 2D 凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后，再通过考染富集该目的点，然后做进一步的肽段指纹图谱分析（PMF）或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展，对银染后的 f mol 级的蛋白质点直接测定已非难事。这里介绍一种可兼容质谱分析的银染方法，实验程序如下：Step Solution(250ml per gel)Gel Type 1mm unbacked 1mm on film or glass support or 1.5 unbacked 固定 25ml acetic acid,100ml methanol 2x15 min 2x60 min 17 125ml milli-Q water 敏化 75ml methanol,0.5g Na2S2O3,17g NaAc,milli-Q water to 250ml 30 min 60 min 漂洗 250ml milli-Q water 3x5 min 5x8 min 银染 0.625g AgNO3,milli-Q water to 250ml 20 min 60 min 漂洗 250ml milli-Q water 2x1 min 4x1 min 显色 6.25g Na2CO3,100 l formaldehyde,milli-Q water to 250ml 4 min 6 min 终止 3.65g EDTA,milli-Q water to 250 ml 10 min 40 min 漂洗 250ml milli-Q water 3x5 min 2x30 min 银染注意事项：1).很多银染程序都使用了戊二醛（glutardialdehyde），它能提高银染的灵敏度和染色结果的重复性，但是因为戊二醛会修饰蛋白质，从而会影响对蛋白质点的质谱鉴定和分析；2).保证所有的染色器皿绝对的干净，可使用玻璃或塑料做染色器皿；3).水的纯度对染色结果好坏影响是很大的，至少要用双蒸水（导电率2S），有条件的可使用 Millipore water；4).染色过程中避免手去接触凝胶，必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套；5).所用的化学试剂一定是要分析纯（AR）。18 Appendix I:Troubleshooting 1.总的策略 化学试剂纯度要高，至少是分析级，目前国产试剂达不到纯度要求 使用去离子水(电导8M)和去污剂(1%)浓度过高，至少需水化 6 小时，最好过夜 采用 Multiphor II 做第一向电泳时，水化后的 IPG 胶条需用去离子水清洗，否则 IPG 胶条表面会有尿素结晶，干扰 IEF。(使用 IPGphor 时，IPG胶条水化后不必清洗)IPG 胶条水化时，其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时，胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发 5.第一相 IEF 5.1 采用样品杯上样 样品体积不能少于 20l 样品在阴极或阳极附近上样，未知样品需检查在何处上样，结果更好 样品浓度不能过高(最大 10mg/ml)，以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑，最好用裂解缓冲液稀释，增大上样体积 样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释，低电压使样品慢慢进入胶中 5.2 水化时加入样品 样品溶液体积需根据 IPG胶条大小调整(18cm 长 IPG胶条约需 400l 样品溶液)，以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。最好检查高分子量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 IPG 胶中 5.3 等电聚焦 使用 IPG 胶条时，不要进行预聚焦，否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条 为使样品进入胶的效率增加，采用 30V 低电压水化；继续以低电压梯度(200V，500V，1000V 各 1 小时)进行电泳，最后达到 8000V 的进行电泳 聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、pH 范围有关。短的 IPG 胶条或宽 pH 梯度 20 范围 IPG 胶条，聚焦时间短 IEF 结束后，如果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳，可于-78 C 冷冻保存 上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高，可脱盐或稀释样品，低电压上样，延长样品进入胶的时间 6.IPG 胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)平衡时间应该充分长(至少 2 x 10 分钟)平衡缓冲液包括 Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入 DTT(1%)是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 DTT(银染过程中，DTT 会导致点拖尾)对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于 DTT 和碘乙酰胺，tributylphosphine 更有效 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶的长度至少超过 25mm 蛋白从一向(IPG 胶条)到二向(SDS 胶)的转移为避免点拖尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行(场强25mm 蛋白没有被 SDS 充分包裹 平衡缓冲液 SDS 浓度1%，平衡 2 x 15分钟 糖蛋白 用硼酸缓冲液代替 Tris 缓冲液 用宽范围小孔梯度胶 蛋白去糖基化 部分自由的巯基再次氧化生成二硫键聚合物 平衡缓冲液中加入充足的 DTT，使蛋白烷基化 用 tributylphosphine 代替 DTT 和碘乙酰胺 蛋白发生氨甲酰化 含有尿素的溶液加热温度不能超过 37 C 使用前，尿素去离子化(deionize urea)样品制备时，内源的蛋白酶没有被抑制 TCA-丙酮处理使蛋白酶失活 加 SDS 或蛋白酶抑制剂一起煮沸 GelBond PAG 膜使用前没有清洗 使用前，用去离子水洗 6 x 10 分钟 灰尘或多余的 DTT 过滤所有的缓冲液 21 第二步平衡缓冲液中加入碘乙酰胺去除多余的 DTT 双向电泳图谱部分变形的可能原因 解决办法 IPG 胶条中 NP-40 或 Triton X-100浓度过高 如果可能减少 NP-40/Triton 的量 用 CHAPS 代替 NP-40/Triton 蛋白从一向到二向转移完成后，IPG胶条没有从水平的 SDS 胶上取走 第二向采用水平 SDS-PAGE 时,蛋白从 一向到二向转移完成后，取走 IPG 胶条 缓冲液条没有覆盖 SDS 胶上原 IPG胶条结合的位置 第二向采用水平 SDS-PAGE 时，取走 IPG 胶条后，将缓冲液条前移，恰好覆盖 IPG胶条与 SDS 胶结合位置的前沿 溴酚蓝迁移前沿不平的可能原因 解决办法 水 平SDS-PAGE：冷 却 板 和 GelBong PAG 膜之间有气泡 去除气泡 水平 SDS-PAGE：缓冲液条和胶面 结合不好 轻压缓冲液条，使其与胶面充分结合 SDS 小孔梯度胶灌胶和聚合时不水平 采用水平台灌胶 7.银染 使用纯度高(分析级)的化学试剂 使用高纯去离子水或双蒸水(电导3 小时或过夜，充分清洗去除复合物 试剂质量差 使用分析级或更好的试剂 水的质量差 电导2uS 水化盘或胶条槽被蛋白污染 彻底清洗水化盘或胶条槽 23 Appendix II:Solutions 常用试剂的配方：A.裂解液(lysis solution)(8M Urea,4%CHAPS,2%Pharmalyte3-10,40 ml)Final concentration Amount Urea(Fw 60.06)8M 19.2g CHAPS 4%(w/v)1.6g Pharmalyte3-10 2%800l Double distilled H2O To 40ml 新鲜配制或者分装贮存于-20 1.如果需要，尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8 M,也可用 7 M U r e a，2 M T h o i u r e a.2.其他的去垢剂（如 T r i t o n X-1 0 0,N P-4 0,还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂）可以取代 C H A P S.3.如果需要，蛋白质酶的抑制剂和或者还原剂可以加入。B 水化液（不含有 IPG buffer,Rehydration stock solution without IPG buffer）(8M Urea,2%CHAPS,bromophenol blue,25ml)Final concentration Amount Urea(FW 60.06)8M 12g CHAPS 2%(w/v)0.5g Bromophenol blue 0.002%(w/v)50l Double distilled H2O To 25ml 分装贮存于-20 1.D T T和 I