细胞生物学实验-细胞周期观察.pdf

细胞周期观察细胞周期观察实验目的：1.了解稳定细胞系的概念和相关技术2.熟悉荧光显微镜的操作方法3.观察稳定细胞系的荧光染色和不同细胞周期时相的细胞形态学特征实验器材：荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、稳定表达微管蛋白的Hela细胞、DAPI（0.1 M）、PBS、2的甲醛in PBS、0.1%Triton X-100 in PBS、抗淬灭剂、指甲油。分析基因的功能需要将该基因稳定转染至宿主细胞染色体。进入细胞的外源基因只有部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性重组最终整合进细胞基因组。但是整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同染色体区段的外源基因的表达量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常需要根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括原生动物、细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞。是筛选稳定细胞系最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有418的选择性培养基中生长。418的这一选择特性已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。稳定细胞系加药时间由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每35天需要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。培养基加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1、死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2、孔中细胞数目太少时，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。可以使用适应性培养基来解决这个问题，适应性培养基是细胞汇合度达到80%时换液培养过夜之后的培养基，通过滤器消毒后，和新鲜的培养基按1：2混合备用。在后面的筛选过程中就可以应用这种适应性培养基。稳定细胞系挑选单克隆的优化为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。鉴定之后一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。稳定细胞系1.G418：1g G418溶于1ml 1M HEPES中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞的细胞悬液，等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右转入外源性基因。3.筛选培养基：根据特定的细胞系，准备不同G418梯度浓度的筛选培养基。4.G418筛选：吸去培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换筛选培养基。确定最佳筛选浓度：在筛选1014天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。这样就需要在两个梯度浓度之间增加适量的梯度浓度，以达到最好的筛选效果。稳定细胞系由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418活性也有差异，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在1014天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以开始构建稳定细胞系。1.细胞培养：取待测培养细胞的细胞悬液，等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右转入外源性基因。2.转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养至细胞密度5070。3.筛选:去掉培养基，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。4.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选1014天后，可以看到有抗性的克隆出现。5.挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释到1细胞个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔板中增殖。6.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。稳定细胞系培养基处理：体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养基具有同化作用，即细胞从培养基中摄取营养的同时，也向培养基排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。可以用适应性培养基来解决这一问题。适应性培养基的配制：1.培养同源细胞至50时，更换一次培养基，继续培养2448小时后吸出所有培养基。2.离心：30004000rpm 10 min后，吸取上清液。3.过滤：用直径0.22um滤膜过滤，再补充2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。稳定细胞系Mitosis in fixed newt lung cells stained with antibodies to reveal the microtubules(green),and with a dye(Hoechst 33342)to reveal the chromosomes(blue).The spindle forms as the separating astral MT arrays,associated with each centrosome(A to C),interact with the chromosomes.Once the chromosomes are segregated into daughter nuclei(F and G),new MT-based structures known as stem-bodies form between the new nuclei(G).These play a role in cytokinesis(H)Mitosis in fixed newt lung cells Interphase Prophase Metaphase Anaphase TelophaseProtein X-TubulinDAPIMerge细胞周期观察实验步骤：1.在盖玻片上涂一层Polylysine以帮助细胞贴附2.取对数生长期的Hela细胞（稳定表达Tubulin）消化后均匀铺在盖玻片上3.铺片24小时后吸去培养基，PBS润洗后用2的甲醛固定5分钟4.PBS润洗 5分钟 X 35.0.1%Triton X-100 in PBS穿孔5分钟6.PBS润洗 5分钟 X 37.加入DAPI，37 2分钟8.PBS润洗 5分钟 X 39.加入抗淬灭剂（增强荧光强度，延长荧光素寿命，降低背景）10.指甲油封片11.荧光显微镜观察不同周期时相细胞的形态学特征（染色体和细胞骨架）