猪流行性腹泻的实验室诊断方法.pdf

主题策划FE A T U R E54猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2010年 第12期猪流行性腹泻的实验室诊断方法李思银，杨亮宇，杨玉艾*（云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201）猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的一种猪的高度接触性肠道传染病，病猪以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征1，俗称冬季拉稀病。本病于 1977 年由比利时的 Pensaert 首先发现，并从病料中分离出一株不同于猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirusofswine，TGEV）的病毒，将其命名为类冠状病毒（CVL）CV777 株。随后英国、匈牙利、西德、加拿大、日本等国相继报道有该病的发生。1982年国际病毒分类委员会将该病毒归类为冠状病毒属。我国于 1980 年首次分离得到 PEDV，以后许多地区均报道有该病的发生。据有关部门对我国 26 个省、市、自治区 1987-1989 年疫病普查的不完全统计，在 36 种猪病总死亡率中该病的死亡率占 1.74。近年来，资助项目：云南省科技厅项目（2008CD129）作者简介：李思银（1987），女，湖南人，硕士研究生，临床兽医学专业。通讯作者：杨玉艾（1978），女，陕西人，博士，硕士生导师，临床兽医学专业。摘 要：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征的高度接触性肠道传染病。其流行病学和临床症状与猪传染性胃肠炎很类似，无法通过临床症状、流行病学和病理变化进行确诊，必须借助于实验室检查方法才能确诊。本文对目前常用的猪流行性腹泻病毒的实验室检查方法、病毒的分离鉴定、微量血清中和试验、免疫电镜、免疫荧光、ELISA、RT-PCR进行了阐述，旨在为该病的诊断及防控提供理论依据。关键词：猪；流行性腹泻；实验室；诊断该病的流行区域有不断扩大的趋势，成为严重危害养猪业的传染病之一。1病原学PEDV 为冠状病毒科冠状病毒属的成员，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，长 12 24 nm，由 核 心 向 四 周放射，其间距较大且排列规则，呈皇冠状。该病毒平均直径为 130 nm（95 190 nm），在外界条件下呈球形，而在粪便中常呈现多种形态。目前发现，该病毒只有一个血清型，不能凝集人、兔、猪、鼠、犬、马、羊、牛的红细胞。该病毒对外界抵抗力弱，对乙醚、氯仿敏感，一般消毒药可将其杀灭，60 30 min，可使其失去感 染 力，但 在 4，pH 5.0 9.0、37，pH 6.5 7.5 或 50条件下相对稳定。2流行病学该病仅发生于猪，各种年龄的猪均可感染发病，哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达 100，母猪的发病率在 15 90，哺乳仔猪尤为严重，病死率平均为 50，成年母猪发病率 10%90。病猪和带毒猪是主要传染源，被含有病毒的粪便污染的运输车辆、饲养员的鞋子或其他带毒的动物，均可成为本病的传播媒介，主要通过消化道传播，也有经呼吸道传播的报道。PEDV 可在猪群中持续存在，并能在猪体内产生一定的免疫记忆。各种年龄的猪对该病均易感，本病多发生于冬季，12 月份至翌年 2月份为本病的高发期，夏季也可发生。PEDV 可单一感染，也可与 TGEV 混合感染，但以混合感染较为常见。近年来，临床上出现了 PEDV 与猪圆环病 毒（porcine circovirus，PCV）混合感染的报道，但发病原因尚不明确。3临床症状PED 常以暴发性腹泻的形式发生在非免疫断奶仔猪或各种年龄的猪，主要临诊症状与 TGE 相似，多表现为水样腹泻，粪稀如水，呈灰黄色或灰色，或于进食或吮乳后伴发呕吐，但程度较轻，传播稍慢。病猪具体临床主题策划FEA TURE55 2010年 第12期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学min 离心后，通过电镜观察到了典型的病毒粒子形成的免疫复合物，并建立了具有 3 次筛选作用改良的 IEM 法。该方法简便、直观、快速、定性准确，但该方法要求有价格高昂的电镜设备，而且电镜检查一般需 3 7 d 才能出报告，不适用于大规模临床诊断。5.4免疫荧光法试验研究证明，用直接免疫荧光法（fluorescentantibodytechnique，FAT）检查病料中的猪流行性腹泻抗原是可靠的特异性诊断方法，目前应用最为广泛。取病猪小肠作冰冻切片或小肠黏膜抹片，风干后丙酮固定，加荧光抗体染色，充分水洗，封盖镜检，1 2 h 即可得出结果。为了与猪传染性胃肠炎鉴别，最好同时用猪传染性胃肠炎荧光抗体染色检查。崔现兰等6对免疫荧光法用于猪流行性腹泻的诊断进行了大量的探索，结果表明：FAT 的检出率为 91.4，间接免疫荧光法（IFAT）的检出率为 89%，而且比电镜更敏感、更可靠。林志雄等7用适应于 Vero、PK-15 等传代细胞株生长繁殖的 PEDV-G1 株建立了PEDV 的直接免疫荧光法，并与哈尔滨兽医研究所的荧光抗体方法检测结果相比较，阳性符合率达95（19/20），阴性符合率 90（9/10），且与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等没有交叉反应，证明FAT 法用于猪流行性腹泻的诊断具有表现因年龄不同而有差异，年龄越小，临诊症状越重。1 周龄内新生仔猪常于腹泻后 2 4 d 内因脱水而死亡，病死率可达 50。断奶猪和肥育猪以及母猪常呈现沉郁和厌食等临诊症状，持续腹泻 4 7 d，逐渐恢复正常。成年猪仅表现沉郁、厌食、呕吐等临诊症状，如果没有继发其他疾病并护理得当，猪只很少发生死亡。少数病猪出现体温升高 1 2，精神沉郁，食欲减退或废绝，尤其是繁殖种猪。4病理剖检该病的病理剖检变化主要在小肠，表现为小肠膨胀，充满淡黄色液体，肠壁变薄，空肠段上皮细胞的空泡形成和表皮脱落。少数病例小肠黏膜有出血点，肠系膜淋巴结水肿，胃内有多量的黄白色凝乳块，其他实质性器官无明显病理变化。电镜观察可见肠绒毛萎缩，绒毛与肠腺的比率从正常的 7 1 降至 3 12。5诊断该病的流行病学和临床症状方面与猪传染性胃肠炎无显著差别，只是传播速度比较慢，无法通过临床症状、流行病学和病理变化进行确诊，必须借助于实验室检查方法才能确诊。目前，常用的实验室检查方法有病毒的分离鉴定、微量血清中和试验、免疫电镜（IEM）、免 疫 荧 光（FAT）、ELISA、RT-PCR 等。5.1病毒的分离鉴定由于细胞培养液中的小牛血清会抑制 PEDV 与细胞受体的结合，且胰酶有一定的耐受性，另外原代 PEDV 不易在猪肾传代细胞系（PK-15、IBRS）及非洲绿猴肾（Vero）等细胞上增殖，故该病毒很难培养。1982 年通过胎猪肠上皮细胞单层和胎猪小肠绒毛上皮细胞成功分离得到 1 株病毒。近年来又将其适应了 Vero 细胞。也有研究表明：用含有 60 g/mL 胰酶液的细胞培养液中进行 PEDV 传代适应，在第 3 代就出现明显的 CPE，第 5 代毒价可达 10-7.0/0.1mL，并通过乳猪回归试验和特异性中和试验证实所增殖的病毒为猪流行性腹泻病毒3。这些病毒分离鉴定的方法对 PED血清学、病原学、免疫学等方面的研究提供了一个良好的技术平台，但由于病毒的分离鉴定需要有一套成熟的细胞培养体系，而且 PEDV需要在细胞系中连续传代才能出现明显的 CPE，目前尚无法推广应用。5.2微量血清中和试验林志雄等4利用已适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒 PEDV-G1株，以 PK-15 作指示细胞，与被检血清进行微量中和，测定待检血清中的特异性抗体，48 h 进行结果判定，证实该方法可以用来检测猪流行性腹泻病毒，而且检测结果准确、可靠，具有较高的敏感性，可用于大规模的流行病学调查，并建立了 PED 微量血清中和试验。但该方法需要标准毒株作为指示毒株和成熟的细胞培养体系，实验条件的限制因素比较多，很难在短期内应用于临床实践。5.3免疫电镜法（IEM）IEM 法 可 用 已 知 的 PEDV 高 免血清检测未知的病毒，又可用已知的 PEDV 抗原检测未知抗体。取经滤过的肠内容物，加等量经过稀释的高免血清，混合后在 37条件下感作30 min，再移至 4感作 18 h，然后将 标 本 在 4 以 31 000 r/min 离 心60 min，沉淀物以少量蒸馏水悬浮后铺在铜网上，用 2%磷钨酸负染后作电镜观察，如可疑病料中含有猪流行性腹泻病毒粒子，由于抗原和抗体的特异性结合，病毒粒子呈晶格状排列，并可见到毒粒间的抗体桥。王继科等5把PEDV 的抗原和抗体分别经 10 000 r/min 离心、免疫复合物又经 12 000r/主题策划FE A T U R E56猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2010年 第12期较高的准确性和特异性。由于该方法需要在病死猪只或在腹泻早期扑杀后取肠道组织制备切片，故很难用于临床诊断。5.5酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA 试验可直接应用于粪便中PEDV 的检测，而且比电镜更敏感、可靠，应用较为广泛。当病猪一出现腹泻，即可进行检测，甚至痊愈不久的病猪，仍可用该方法进行检测。陈茹等8用分离纯化的 PEDV 抗原，建立了用于检测 PEDV 抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA），并对比了该方法和琼脂扩散试验的检测情况，结果表明，Dot-ELISA 更敏感，且该法重复性较好。邹勇等9用 PEDV 细胞培养物提纯的抗原，组织毒免疫获得的高免血清建立了间接 ELISA 检测PEDV 抗体水平。结果表明：包被抗原浓度为 1 20000，酶标羊抗猪 IgG浓度选用 1 250 为测定抗 PEDV IgG抗体的最适工作浓度。田间检测结果与临床发病和预期结果一致。韩国学者 Kim O 等10建立了可在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出 PEDV 的单克隆抗体基础上的免疫组化法，该方法也可用于鉴别诊断 PEDV 与 TGEV。但该方法对病料的前期处理比较繁琐。5.6反转录聚合酶链式反应（RT-PCR 法）近年来，随着分子生物学的发展，对于 PEDV 和 TGEV 核酸的检测方法越来越受到人们的重视。有研究表明，RT-PCR 法是目前鉴别诊断 TGEV 和PEDV 最敏感、特异的方法。传统方法诊断主要从病毒的分离与鉴定、抗原检测、电镜检测、血清学诊断等方面进行。与传统方法比较，RT-PCR 方法只需要病猪的粪便即可进行活体诊断，便于疾病的早期诊断，敏感性和特异性高，而且操作步骤更加快速、方便，一般 4 6 h 内可以提供准确的结果。Ishikawa K 等11根 据 S 基 因序 列 设 计 了 1 对 引 物，成 功 建 立了可用于检测细胞和粪便中 PEDV的 RT-PCR 法，此 法 灵 敏 度 可 达100 TCID50/mL，并可在 8 h 内得出检测结果。Kubota 等12在 N 基因的基础上，也成功建立了可进行 PEDV细胞毒和粪便毒的 RT-PCR 检测方法。Kim O 等13-14已 建 立 了 TGEV和 PEDV 的 二 联 RT-PCR 诊 断 方法，并对免疫组化、原位杂交、RT-PCR 3 种方法进行了比较，结果表明RT-PCR 法检测结果的重复性最好，但当被检样品为福尔马林固定时，更适宜采用免疫组化和原位杂交法。吴凌等15将猪流行性腹泻病毒分离株 HLJ02，经过胰酶处理后，在Vero 细 胞 上 增 殖，用 RT-PCR 和RT-nested PCR 分 别 扩 增 出 854 bp的 M 全基因片段和 412 bp 的 M 基因部分片段，而猪传染性胃肠炎病毒和Vero 细胞培养液中未扩增出上述产物，表明 RT-nested PCR 可用于检测猪流行性腹泻病毒。刘邓等对 TGEV和 PEDV 的二联 RT-PCR 检测方法进行了改进，提高了病毒感染初期的敏感性，并建立了用于检测 PEDV 的TaqMan 荧 光 定 量 RT-PCR 法，对TaqMan 荧 光 定 量 RT-PCR 法 和RT-PCR 法的检测结果进行了对比和分析，结果表明普通 RT-PCR 检测PEDV 存在漏检的可能，而 TaqMan荧光定量 RT-PCR 法具有准确、定量、污染低、灵敏度高、特异性强及省时省力等优点16，17。但该方法对实验操作人员以及实验条件等的要求较为严格，以及检测成本的限制，因此在推广上仍有很大的限制。PED与TGE的临床症状极其相似，所以诊断非常困难。最初的实验室诊断主要依靠传统的病毒分离与鉴定、中和试验、免疫电镜、免疫荧光等病原学诊断方法，这些方法都能对 PED做出准确的诊断，但是一般都只能在病猪死亡后或者早期扑杀后才能进行，而且检测前病料的前期处理比较繁琐，有的甚至要求价格高昂的实验设备或成熟的细胞培养体系，操作复杂而且耗时。随着分子生物学的发展，RT-PCR 技术被应用到 PEDV 诊断技术中，虽然此法敏感性和特异性都很好，但由于需要特殊的仪器设备，目前只适用于实验室诊断，不适用于临床诊断。综合考虑，直接免疫荧光法（FAT）和 ELISA 相对比较方便，而且准确性比较高，目前应用最为广泛。参考文献1B.E.斯特劳，S.D.阿莱尔，WL.蒙加林，D.J.泰勒猪病学 M第八版中国农业大学出版社，2000，181-1872邬良贤，丘建华猪流行性腹泻研究概述J福建畜牧兽医，2000，22（5）：7-83李品齐，丁敦志，刘万钧猪流行性腹泻病毒在 Vero 细胞上的适应性试验 J中国兽医杂志，1997，9（23）：244林志雄，李树根，李力复，等猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用J中国兽医科技，1994，24（11）：3-45王继科，刘长明，马思奇，等猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的免疫电镜诊断的研究 J中国畜禽传染病，1991（2）：22-266崔现兰，马思奇，王明，等应用免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的研究 J中国畜禽传染，1990（5）：20-24主题策划FEA TURE57 2010年 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