毕业论文(生物肥料).doc

XX大学

本科生毕业论文（设计）

题 目 微生物肥料中两种菌的最适培养方法
学 院 生命科学学院
专业班级 XX级生技X班
学生姓名 XX
指导教师 XX

2011 年 4 月 28 日

微生物肥料中两种菌的最适合培养方法
XXX
生命科学学院
摘 要：本文主要论述述了微生物肥料中两种有益菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)的扩大培养和在固体培养基上的培养。探讨了如何使固体微生物肥料中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌都在实验室远远超过国家规定菌数，以便在工厂里生产时能达到国家规定的要求。这个实验的探讨方向主要是从选择培养菌数最多的培养基、两种菌的分别的最佳摇床时间、两种菌的最佳混合配比三个方面进行比较，最后对比结果得出最适合的培养方法是使用加豆粕和麸皮的营养肉汤培养基进行菌种扩大培养
关键词: 微生物肥料；枯草芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌；最大菌数；液体培养基；固体培养基

The most suitable training methods of two
bacterium in the microbial fertilizer
XXXX
（College of Life Sciences）
Abstract: This paper discusses the culture and the expansion of cultivation in solid medium of two kinds of beneficial bacteria (Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis) in the microbial fertilizer. Discusses are about how to make Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis in solid microbial fertilizer become far more than the state \number of bacteria in the laboratory in order to achieve\production requirements of the State in factory. The main direction of this experiment were compared in three aspects, the most selective culture medium for bacteria count, the most suitable shaking time of the two strains, the best mixing ratio of the two strains .And finally comparing the obtained results ,the most Appropriate training method is to use plus soybean meal and wheat bran nutrient broth culture medium for bacteria to expand.
Keywords: Microbial fertilizer; Bacillus subtilis; Bacillus licheniformis; the maximum number of bacteria; liquid medium; solid medium
引言：
微生物肥料又称生物肥料、菌肥、接种剂，是一类以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品。由于微生物种类繁多、功能多样，研究和应用的潜力巨大。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用，保护环境，以及提高农作物产品品质和食品安全等方面已表现出不可替代的作用。尤其是在人类面临能源危机、资源紧缺、环境污染等压力下，为了我国农业的可持续发展，研究和应用微生物肥料是一条必由之路，近10年的实践也已证明了这一观点。自20世纪90年代后期，微生物肥料的研究与应用有向多菌株复合方向发展的趋势，不同功能的多菌株组合、功能互补的复合微生物肥料已成为研究和应用的主要发展方向。这需要研究者在深入了解有关微生物特性的基础上，采用新的技术手段，根据用途把几种所用菌种进行科学、合理组合，使某种或几种性能的菌种组合后微生物肥料功效明显提高，发挥复合或联合菌群的互惠、协同、共生等作用，减少相互拮抗的发生。
1 材料与方法
1.1 材料
枯草杆菌(编号ACCC11088)、地衣芽孢杆菌（ACCC11106）、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、蒸馏水、琼脂、豆粕、麸皮、草炭、蔗糖、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、石灰水
1.1.1菌种
　（1）枯草芽孢杆菌 ACCC11088从中国农科院土肥所购买，防治花生线虫病
（2）地衣芽孢杆菌ACCC11106购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，抗梨黑星病。
1.1.2 仪器
高压蒸汽灭菌锅、显微镜、1000 ml刻度分装搪瓷缸、200 ml 烧杯、角匙、天平、称量纸、PH试纸、500 ml三角瓶、纱布、玻璃棒、棉花、平皿、接种环、试管、酒精灯、1 ml吸管、5 ml吸管、10 ml吸管、玻璃刮铲、无菌水、玻璃珠、记号笔等
1.2 方法
1.2.1菌种复壮
(1)斜面培养基配方：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、水1000mL、琼脂20g、pH值7.2～7.4。
(2)按配方准确称取所需的物品，溶解、过滤、分装、包扎、灭菌（121℃30min）、冷却、摆斜面。
(3)斜面无菌检查。
(4)接种：无菌室清洁、紫外灯灭菌、操作人员清洁、消毒、用接种
环接种斜面。
(5)培养：在恒温箱内37℃培养 24 h, 即可见到一层白色圆整、 边缘光滑的枯草芽孢杆菌菌落。
(6)重复转接3代斜面
(7)镜检。分别用简单染色或革兰氏染色涂片观察，菌的生长情况，是否有杂菌。
备注：
（1）培养芽孢杆菌时加入5mg MnSO4.H2O有利于产生芽孢。
（2）枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为短杆状，有椭圆芽孢。地衣芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态和排列成杆状，芽孢椭圆状。

图1 枯草芽孢杆菌
衣地衣芽孢杆菌:革兰
（） 图 图图2 枯草芽孢杆菌图性杆状
01.2.2 菌种的摇床扩大培养
.（1）液体培养基的制备　
培养基分为三组
1组为普通的营养肉汤培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、水1000mL、调节PH7.0；
2组为中国普通微生物菌种保藏管理中心推荐使用的加富培养基：豆粕30g、麸皮50g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、5mg/L MnSO4.H2O(注：配制时麸皮、豆粕混合加0.2%NaOH溶液1L，煮沸1h后过滤。然后再滤液中加其余成分，加热溶解后分装。
3组为实验室做的优化培养基：豆饼粉10g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、K2HPO42g、KH2PO4 0.5g、硫酸铵0.4g、硫酸镁0.2g、碳酸钙5g、水1000ml,PH7.0-7.5.并可在其中加入山梨酸0.2%、苯甲酸甲酯0.1%、丙酸0.3%中的一种来促进孢子萌发。
按照上述三中营养培养基配方，进行计算、称量、溶化、调节PH等步骤配置好液体培养基。
（2）将以上培养基分装到250ml的烧瓶中，并标记清楚。
（3）121℃高压灭菌30 m in 备用。
（4）将试管斜面培养基上已培养好的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌在超净工作室中接种到250 m l的上述三种培养基中,如下接种第一组、第二组、第三组培养基各接一瓶088菌和一瓶106菌，摇匀,37℃摇床内培养 。
1.2.3 菌种的培养时间控制
（1）用上述第二种培养基对两种菌按照上述步骤从新培养。
（2）每隔一天观察液体培养基中的情况，并记录各瓶中菌的生长情况，是否变浑浊，如果变浑浊，需记录变浑浊的培养时间，并拿出摇床，测菌数。没有变浑浊的继续培养。
（3)测菌数样品
稀释液的制备 准确吸取取待测样品l0ml，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液5ml，移入装有45ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液5ml，移入装有45ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液。
　　用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。因此，若出来的结果10-6上的菌数为几十个或以上，则应继续稀释到10-7。　　
涂抹平板计数法先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，并记录实验时间，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上203～0min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。

图3 地衣芽孢杆菌菌落

图4 枯草芽孢杆菌菌落
选择每一种培养基的每个菌种两个菌落张的较好，菌落数在20 CFU～200 CFU，又没有杂菌污染的梯度（每一梯度三个平行），查菌落数后，应用MPN计数按照公式：

计算活菌数，把结果记录下来。
（4）第三步中原液体培养基，继续放回摇床培养，每隔一定时间按第三步中的步骤测一下菌数并计算出每毫升的含菌量。
（5）把106、088两的一定培养时间的菌数进行比较，选出最优培养基和两种菌的最适摇床培养时间。
1.2.4 把液体培养基中的菌转移到固体培养基中
（1）固体培养基的制作
豆粕1/4、麸皮和草炭各1/2，蔗糖0.1%、酵母膏4‰、蛋白胨2g、K2HPO40.5‰、KH2PO40.2%、硫酸铵1.2％、硫酸镁0.08％、PH6.0左右，用石灰水调节。
清洗六个罐头瓶，并121℃灭菌30min，然后按照上述配方计算、称量、混匀、调节PH、分装。
（2）088菌和106菌各吸取液体菌5ml到6罐固体培养基中，放置恒温箱培养
（3）一定时间后，观察两种菌的菌落形态，并将6罐088、106固体培养罐拿出。可观察到088和106菌落形态的不同，枯草芽孢杆菌菌落不规则，表面有裂纹时，裂纹也不规则；地衣杆菌菌落规则，圆形较光滑，表面有裂纹时，裂纹呈花形。
（4）将两种固体培养基取出用纱布包裹并在40℃下烘干。
（5）将088、106烘干的样研磨成粉状。
（6）准确称取研磨粉状物l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释，依次做六个梯度，测出固体培养基中的菌数。
（7）再过一段时间，两固体培养基有明显变化时，再测菌数，并将记录两种菌随时间的变化，选出两种菌数量同时达到比较高的时间，进行混合。
1.2.5 088菌和106菌的混合
由于做过验证试验可以证明088和106这两种菌的培养后混合比混合后培养两种菌的数量都高，因此采取培养后混合。
把088 和106 按1∶1的比例和1∶2的比例混合两种固体培养基上的菌
（1）从恒温箱里分别取出1罐已经培养72小时的106菌和088菌。
（2）用2块纱布分别包裹好取出的固体菌，并标记。
（3）在40℃下烘干，并研磨成粉状。
（4）把研磨后的固体菌装袋，标记。
（5）分别称取10g106菌和088菌按照1:1的比例有180ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s。
（6）同理，分别称取6.7g106菌和13.4g088菌按照1:2的比例有180ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s。
（7）同理，分别称取6.7g088菌和13.4g106菌按照1:2的比例有180ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s。
（8）放置24小时后，对三组混合菌做平板，36h后测各组菌数，以上三组实验分别记为记录①组、②组、③组。
1.2.6 整理记录数据，分析两种菌的最适合生长条件，使微生物肥料中的这两种菌的活菌数可以达到最大值。
2 结果与分析
2.1 三种培养基的实验结果
三种培养基的活菌计数：

表1 活菌计数表
培养基
菌种
第一组
肉汤培养基
第二组
加富培养基
第三组
化学培养基
088（枯草芽孢杆菌）
3.18亿/克
12.8亿/克
5.22亿/克
106（地衣芽孢杆菌）
4.73亿/克
24亿/克
7.38亿/克

对实验结果进行直观分析如下: 按表1 的结果分析可以得出，①第二种培养基更适合两种菌的培养，而后两种培养基比第一种肉汤培养基的效果明显要好，而第二种培养基加了豆粕和麸皮，初步判断豆粕和麸皮在菌种的扩大培养上发挥较大作用；第三种培养基比第一种大体上多加了一些化学试剂，如磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙等离子化合物，这些离子因素在上述两种菌的摇床扩大培养上也影响了菌数的增长，但效果不如豆粕和麸皮。② 枯草芽孢杆菌比地衣芽孢杆菌长的慢，应此培养时间要长。
可见，应选用第二种培养基对他们摇床培养，并且枯草芽孢杆菌的长势不如地衣芽孢杆菌。
2.2 第二种培养基中两种菌的活菌数随时间的变化
表2 活菌数随时间的变化

对实验结果进行直观分析如下：088菌（枯草芽孢杆菌）和106菌（地衣芽孢杆菌）的活菌数都经历了一个由低升高，再有高降低的过程。106菌长势较088菌好，并在48h后达到对数期，而088菌在96h后才达到对数期。
因此，在做固体微生物肥料时，这两种菌应分别在液体培养基中的扩大培养48h、96h后转接到固体培养基中最适。

2.3两种菌的混合配比

第①组

第②组

第③组
菌落生长情况
两种菌的长势都较好，菌数相差不大。
088菌长势比106菌好，总体菌数少。
106菌菌数多于第②组，088少。
活菌数
15.65亿/克
7.12亿/克
9.22亿/克

从上述结果可以看出，第①组即088:106=1:1的配比菌数最多，且两种菌
各自的生长趋势比第②组和第③组要好，可以推出088菌和106菌有拮抗作用，而第②组和第③组中放置前两种菌数相差较大，导致两菌的拮抗作用比第①组要大，因此配置微生物肥料时，应选择088:106=1:1的配比。
3 小结
3.1
微生物肥料在农业生产、改善土壤生态环境等方面起到不可忽视的作用。国家规定的微生物肥料菌剂中的有效活菌数≥2亿/克，为了达到国家规定，最好选用加豆粕和麸皮的液体培养基进行扩大培养。而且要控制培养时间和配比，使两种菌的有效活菌数达到比较高的水平。

参考文献：
[1]《 枯草芽孢杆菌的培养》(山东农业大学动物科技学院　泰安牧神饲料有限
公司　陈蕾　申丽　陈官营　常维山　271000)
[2] 《枯草芽孢杆菌培养基配方优化的研究》王 妹 ，陈有光 ，段 平， (1 上海海洋大学’上海201306；2山东省淡水水产研究所，山东济南250117；
3济宁市水文水资源勘测局，山东济宁272019)
[3] 沈　萍主编1 微生物学1 北京: 高等教育出版社, 200014271
[4] 诸葛健, 王正祥1 工业微生物实验技术手册1 北京: 中国轻工业出版社, 199416281
[5] 钱柔存, 黄仪秀1 微生物实验教程1 北京: 北京大学出版社, 19991198～1961
[6] 《 地衣芽孢杆菌TS201 固态发酵培养基的优化》3谷春3 3　萨仁娜　佟建明(中国农业科学院畜牧研究所　北京　100094)
[7]喻子牛 何绍红《农业微生物学实验技术》 中国农业出版社 1996
[8]农业行业标准 NY/T 798-2004 复合微生物肥料检测标准

致 谢

首先，非常感谢学校和院里给我们安排的毕业实习，让我们每个人都能充分锻炼自己的动手能力，并开拓了我们的思维方式，它给我们搭建了一个平台，使我们不再局限于书本里的知识，使我们懂得怀疑，懂得去验证，让我们站在了一个更高的层次上使我们获益匪浅。
其次，也同样感谢XXXXXXX，XXXXX给我提供了实习的地方和材料，让我有了实习最基本的空间和舞台。在XX老师的指导下，我不仅学会了有机肥中活菌的检测方法，还设计了自己的毕业实习。XXX老师给我指明了实习的方向，使我的设计条例非常清晰。
再有，我要感谢学姐XXX和XX同学，在我遇到困难时，不余遗力的帮助我，教导我，使我在实习的过程中，不但收获了知识，还获得了友谊。
最后，感谢指导修改我论文的XXX老师。