Western-Blotting实验报告.doc

Western Blotting 本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。 Western Blotting的 blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。它通常分为两种方法：Western Blotting方法一: 直接法方法二: 间接法优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。据有无浓缩效应可将电泳分为两类：i. 连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。ii. 不连续系统：缓冲离子成分、 pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、 分子筛效应、浓缩效应区分。SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。本实验采用人血清为材料，人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中 IgG占血清免疫球蛋白总量的75%80%。人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG。二、试剂，器材和实验材料【试剂】1. 30丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。2. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。3. 分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。4. 10过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。5. 10SDS(w/v)。6. 10TEMED。7. 电极缓冲液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。8. 样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20甘油，4SDS，10巯基乙醇，0.005溴酚兰。9. 考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。10. 脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。11. TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,12. 500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。13. TTBS：取100mlTBS，加250l 20Tween-20。14. 封闭液及抗体稀释液：3脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。15. 底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10l H2O2，临用前配制。16. 考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸，总体积500ml。17. 脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。【器材】1. 夹心式电泳槽2. 转移电泳槽3. 电泳仪【实验材料】1. 人血清2. 硝酸纤维素膜三、 实验步骤 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 灌胶前的准备： 将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。2. 配制胶液胶液浓度% 分离胶 浓缩胶 12%4%30%贮备液(ml) 3.20.53分离胶缓冲液(ml) 2浓缩胶缓冲液(ml) 1.0重蒸水(ml) 2.662.3610%SDS(ul) 8040混匀后再加入以下试剂： 10%TEMED(ul) 804010过硫酸铵(ul) 4020总体积(ml) 843. 灌 胶：将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板 顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用。待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合 ，大约30min完成聚合。倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端 ，插上样品梳，放置待其聚合。4. 配制电极缓冲液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每组配1000ml。5. 制 样：5l人血清，加45l水，再加50l加样缓冲液。沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。 6. 加 样：1、加入电极缓冲液；a) 拔出样品梳；b）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5l分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10l人血清样品。 稳压120V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。7. 切 胶：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝R-250全蛋白染色。窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色。8. 胶条保存：将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20 冻存。 转印蛋白质到硝酸纤维素膜上1. 将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝R250染色、脱色：将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。2. 放置NC膜和胶条：a) .切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。b) .准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。c) 打开转移转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵 b. 一张浸湿的滤纸c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e. 一张浸湿的滤纸f. 一张浸湿的海绵。3. 转 移：小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。 膜的酶联免疫染色1. 封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。加封闭液1ml后封闭开口，37摇床上摇动30min。2. 加封闭液及抗体 a)与第一抗体结合(1) 弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37摇床上轻轻摇动50min。(2) 取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋内。 b)与酶标第二抗体结合(3) 加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37摇床上轻轻摇动50min。(4) 取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。 加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。转入水中保存。3. 结果分析：在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。实验结果： 做标准蛋白曲线的的凝胶的总长为7.53cm条带1条带2条带3条带4条带5条带6蛋白条带标准分子量Mr/KDa66.245.035.025.018.414.4logMr1.821.651.541.401.261.16蛋白质条带迁移距离/cm1.582.413.174.185.155.82相对迁移率0.210.320.420.560680.77带有人血清IgG的硝酸纤维素膜的总长为7.24cmIgG轻链迁移距离/cmIgG轻链相对迁移率IgG重链迁移距离/IgG重链相对迁移率数值4.080.562.380.33由公式y = -1.1451x + 2.0366知： 当x（重链相对迁移率）=0.33时，y=1.6587 得IgG重链相当分子量为：45.57KDa 当x（轻链相对迁移率）=0.56时，y=1.3953 得IgG轻链相当分子量为：24.85KDa讨论：一、 实验注意事项：1. .丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，注意不要沾在皮肤上，如有沾染可用水洗净。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2. 电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断铂电极丝；注意保护玻璃板。3. 一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。4. .如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。5. 滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。6. 如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜所产生的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间；并考虑延长每一步的清洗时间。7. 一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定最佳条件。8. 一般情况使用0.45m的NC膜，0.10.2m的小孔径膜只适合于分子量小于20kD的蛋白质。二、 实验思考题：1. 12%的分离胶适合分离多少分子量范围的蛋白质？答：由分子克隆中的分离胶浓度与蛋白质分子量线性关系图知，12%的分离胶适合分离分子量范围在15-60KDa的蛋白质。2. 电极缓冲液中甘氨酸的作用?答：SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸，电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。3. 不加封闭液会产生什么样的结果？答：在实验中加封闭液的作用是防止NC膜上没有蛋白质的地方粘上一抗，否侧经底物显色反应后，整个NC膜都会背上色，无从辨别实验蛋白。故需不与一抗、二抗识别的非特异蛋白质提前占位。