HPLC实验报告.doc

水体中雌激素的高效液相色谱法分析李甜甜 指导老师：凌婉婷1. 前言目前, 环境内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, edcs) 被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后的又一新的环境污染问题, 成为当前国际上研究的热点。至今所报道的各种内分泌干扰物中, 雌性天然激素及其合成激素被认为是最重要的干扰物之一。这些外源性化学物进入体内后通过和内源性雌激素相同的作用机制( 主要是核受体蛋白介导作用) 干扰内分泌系统而产生一系列的不良作用, 包括致癌、损伤生殖功能导致神经系统和免疫系统异常等。环境中的雌激素主要是由人类和动物的新陈代谢而产生的，随着尿和粪便等排泄物而进入废水中，经过污水处理厂处理后进入到自然水体中，并在城市水系统中的固液相之间进行迁移和转化。再者，由于激素类药物在人类日常生活和养殖业中被大量使用，不同种类的雌激素因此会进入城市污水管网，经污水处理厂处理后，排放进入环境。edcs 是城市水循环过程中长期存在的一类典型污染物，虽然其含量较低，但是在极低的浓度( ngl-1 )水平下就能造成动物内分泌紊乱、雌性化、发育不良以及畸形化等不良影响，而且有可能和水体中残留的其他雌激素类物质发生协同作用, 因此这类物质对生态环境潜在的危害性是不可忽视的。同时由于edcs 的亲脂和难降解特性，在城市水循环的过程中会逐渐积累，威胁到城市居民的身体健康，对生态环境存在潜在的危害性，已经成为城市环境保护的核心问题，急需针对城市水体中的edcs 开展基础研究工作。因此在环境中建立一套科学、完善、高效的雌激素类物质检测方法是十分必要的。近年来，随着色谱、质谱及色谱-质谱联用技术等的快速发展，微量雌激素类污染物的检测技术也随之有较快的发展。目前测定edcs 的方法有gc- ms 法 、hplc法, 荧光光度法 , 酶联免疫分析法(elisa), 极谱法等。其中gc - ms 和hplc是比较常用的方法。gc- ms 法需对样品进行酯化处理, 操作繁琐, 重复性差。本文采用固相萃取(spe) 浓缩净化技术, 通过高效液相色谱(hplc)分离, 荧光检测器进行定性定量分析, 建立了快捷、便利、有效的对水中内分泌干扰物ee2的测定方法, 并可在污水监测中得到应用。2. 实验材料2.1. 仪器与试剂lc-20a高效液相色谱仪，rf-10axl荧光检测器。色谱柱：inertsil ods-sp-c18（150mm4.6mm,5m）。固相萃取仪（hp-6019-12 spe），圆周形氮气吹干仪，固相萃取柱（6ml）。炔雌醇（2g/ml,ee2），实验用水（超纯水），甲醇、乙腈均为hplc级试剂。c18，玻璃棉。2.2. 标准溶液及模拟水样的配制分别取2g/ml ee2 0.25ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，7.5ml于棕色容量瓶中，并用甲醇稀释定容至10ml，摇匀，配制成不同浓度的标准溶液，保存待用。取2g/ml ee2 0.5ml于容量瓶中，用超纯水定容至100ml，摇匀，配制模拟水样，保存待用。2.3. c18 spe柱的制作订制6ml固相萃取玻璃柱管，在柱管底部填入一定量的玻璃棉，称取0.2gc18填料加入柱管中，轻轻敲打柱身使其均匀，将填料填平、压实，上层再覆盖一层玻璃棉，再以清洁的玻璃棒按压使其装填紧密，保存待用。2.4. 色谱条件色谱柱：inertsil ods-sp-c18（150mm4.6mm,5m）；流动相为甲醇/乙腈/水（体积比为25:30:45）；流速：1.0ml/min；柱温：40；进样量：20l；荧光检测器波长：激发波长为280nm，发射波长为310nm。2.5. 样品的前处理将配制好的100ml模拟水样以约为58ml/min的流速通过已分别用5.00ml甲醇和5.00ml超纯水活化的c18 spe柱，用5.00ml超纯水淋洗柱体并继续抽吸3.0min，淋洗后的萃取柱用10.00ml甲醇洗脱，洗脱液收集至小试管中。将小试管置于40的恒温水浴并用氮吹仪缓慢吹干，然后加入50%甲醇水溶液将附着物重新溶解至2.00ml，通过0.22m孔径滤膜后，用于hplc/fld分析。 3 结果与讨论3.1 标准曲线将配制好的浓度分别为0.05g/ml，0.1g/ml，0.2g/ml，0.4g/ml，1g/ml，1. 5g/ml的ee2标准溶液，进样进行hplc/fld分析。图1为标准ee2溶液的液相色谱- 荧光检测色谱图。图1 标准溶液的色谱图表1为标准溶液的荧光检测目标组分的峰面积（y）和目标组分相应的质量浓度（x，g/ml）数据。表107号样在配制时由于摇匀失误导致试样洒出，故绘制标准曲线时舍去该样数值。绘制的标准曲线如图2所示。以荧光检测目标组分的峰面积（y）对目标组分相应的质量浓度（x,g/ml）作标准曲线，回归方程为：y=4.6106x+2557.8，r2=1.0000 。3.2 萃取样品的回收率计算经hplc/fld分析的萃取样品的峰面积为1768277，代入标准曲线的回归方程计算得质量浓度为0.3838g/ml。回收率（w%）计算得： w%=3.3 结果分析实验过程中的一些操作会对实验回收率造成影响。1）c18 spe柱的制作过程中，由于填料不紧实，对样品的萃取造成影响，导致回收率不高；2）萃取样品的萃取流速会直接影响萃取样品的回收率；3）萃取样品时，模拟水样过柱不小心洒出柱外，导致回收率下降；4）使用氮吹仪吹干萃取样品，氮吹过程中氮吹气体不匀，致使液滴飞溅，使萃取样品回收率大打折扣。4 结论采用固相萃取(spe) 浓缩净化技术, 通过高效液相色谱(hplc)分离, 荧光检测器进行定性定量分析, 建立了快捷、便利、有效的对水中内分泌干扰物ee2的测定方法。该方法准确度高，测得的标准曲线线性良好，相关系数大于0.9995，ee2回收率达76.76%，适合水中雌激素的日常检测，能够在污水监测中得到应用。参考文献1 王晓东, 赵新华, 张新波, 等. 固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法同时测定水中的壬基酚和双酚a. 分析试验室, 2006, 25(9): 2729 0.3838g/ml?2ml2g/ml?0.5ml?100%?76.76%2 高会, 祖国仁, 顾佳, 等. hplc-ms/ms法联合分析环境水体中喹诺酮类抗生素和雌激素. 分析试验室, 2011, 30(12): 8123 陈彤, 云霞, 那广水, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定海水中雌酮、雌二醇、雌三醇. 分析试验室, 2009, 28(11): 41444 那广水, 陈彤, 张月梅, 等. spe-hplc-ms/ms法检测水体和沉积物中六种甾体雌激素.海洋环境科学, 2011, 30(3): 4244275 谭丽超, 葛峰, 单正军, 等. 超高效液相色谱串联质谱法测定污水处理厂水样中的雌激. 生态与农村环境学报, 2011, 27 (5): 86926 郁倩, 王洪新, 安可. 水中5 种雌激素的固相萃取高效液相色谱测定法. 环境与健康杂志, 2008, 25 (5): 4384417 江明, 林怡, 张江华, 等. 高效液相色谱法测定环境水中超痕量双酚a. 分析化学研究简报, 2006, 34(10): 141914228 汪莉, 刘红河, 李丽莎. 高效液相色谱法测定环境雌激素. 实用预防医学, 2004, 11(2):3603619 蒋学之. 环境雌激素对人类健康的潜在影响. 中国公共卫生, 1997, 13 (4) : 251-252 10魏慧斌, 林金明. 环境雌激素检测方法研究进展. 生命科学仪器, 2005, 3(5): 310 11刘晓燕, 张海霞, 刘满仓. 酚类环境雌激素的色谱分析方法. 分析测试学报, 2007,26(2):288294篇二：高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告一 、实验目的1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过hplc分离测定来对目标化合物的分析鉴定。二 、实验原理液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。三 、高效液相色谱的分类吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法四 、高效液相色谱仪的基本构造高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。 1 输液系统：包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合hplc要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。 2 进样系统：将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两项功能。 3 分离柱：色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的hplc微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3m、5m、7m、以及10m。采用的固定相粒度甚至可以达到1m，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10m。hplc填充柱效的理论值可以达到50000/m160000/m理论板，一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的死体积。 4 检测系统：hplc检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器和磁光旋转检测器。这类检测器适用范围广，但是对于流动相有响应，受温度变化、流动相流速和组成变化的影响，检测灵敏度低，不能用于梯度洗脱的分离模式。专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，可用于测量被分离组分某类特性的变化。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。 5 数据处理系统：数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类，前者可以完成一般的色谱数据处理任务，有些软件可以实现部分仪器的控制功能。前者即一般的色谱工作站，后者通常称之为专家系统。五 、实验数据数据一：数据二：11六 、高效液相色谱的使用中的注意事项流动相：1. 、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 样品：1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的35倍； 色谱柱：1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如ph值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱；4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子；7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；篇三：hplc实验高效液相色谱分析实验仪 器 分 析 实 验 报 告实 验 名 称： 高效液相色谱分析实验一、 实验目的1. 了解hplc的结构，了解仪器的开、关程序。 2. 了解流动相的制备和样品溶液的制备。 3. 知道仪器的运行程序和进行样品分析。二、仪器和试剂仪器：美国安捷伦1200型hplc、10l的微量注射器 试剂：磷酸乙腈溶液(ph=3)、重蒸水、邻氯苯甲酸三、实验步骤1. 流动相的准备流动相只有一组：ph=3的磷酸乙腈溶液，进过脱气，用蠕动泵输送。 2. 开机，色谱柱平衡当1完成后，开机，待色谱柱平衡。 3. 样品溶液的准备配置好邻氯苯甲酸溶液，按要求选好滤纸的孔径大小。用低压过滤装置过滤，由于美国安捷伦1200型hplc配有脱气装置，因此滤液无需事先脱气就可以进行分析。 4. 基线的查看由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。 5. 样品进样分析用10l的微量注射器取5l的邻氯苯甲酸，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入到注射的孔时，打开微量注射阀，将邻氯苯甲酸注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。 6. 色谱柱的清洗分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用适当的液体来清洗色谱柱。 7. 关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。四、实验数据及处理1. lc参数2. 色谱柱参数3. 四元泵状态a： 0.0 流速：1.000ml/min b： 0.0 压力：91bar c： 0.0 d： 0.05. 色谱分析谱图见附页，经过注射5l的邻氯苯甲酸，得到三组实验色谱图，根据谱图列表数据如下：色谱柱长(l)、理论塔板高度(h)与理论塔板数(n)三者的关系为： n = l / h 理论塔板数和色谱参数之间的关系为：n = 16 ( tr / wb ) 2 = 5.54 ( tr / y1/2 ) 2 则取第五组数据计算得：tr =2.437 min = 146.22s y1/2 = 2.354(0.1375min / 4 ) = 4.855125 s n = 5.54 ( tr / y1/2 ) 2 =5025 (块)五、实验分析与讨论见图分析：（色谱图见附页）图中第一个峰是出现在1.188min的一个小峰，第二个峰是出现在1.420min的一个小峰，第三个峰是出现在1.531min的一个小峰，第四个峰是出现在1.816min的一个小峰, 第五个峰是出现在2.437min的一个大峰，第六个峰是出现在3.196min的一个小峰。 注意事项：1、实验过程中要注意仪器在运行中不能进入气体，否则会导致压力不稳定，影响柱效。2、色谱柱标明了流体的流动方向，不要改变其流动方向，否则会降低色谱柱的性能。篇四：高效液相色谱分析实验实 验学专班姓指 导日 仪器分析实验报告 名 称： 液相色谱分析实验 院： 化学工程学院 业： 化学工程与工艺 级： 化工113班 名： 号教 师： 期： 2014年5月6日一、实验目的1. 了解hplc的结构，了解仪器的开、关程序；2. 了解流动相的制备和样品溶液的制备；3. 掌握外标法计算浓度的方法。二、实验原理液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，试剂瓶中的流动相被泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。高效液相色谱分析的流程。由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而hplc改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 高效液相色谱的分离过程。同其他色谱过程一样，hplc也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。三、仪器与试剂仪器：液相色谱仪（大连依利特）、10l的微量注射器。试剂：乙腈和重蒸水溶液6:4混合液、2,2-双4-（4-氨基苯氧基）苯基丙烷（bapp）四、实验步骤1. 流动相的准备准备所需的流动相乙腈和重蒸水，将其分别用有机滤膜和水膜过滤，再以6:4的比例混溶，然后超声脱气。2. 开机，色谱柱平衡当步骤1完成后，开机，待色谱柱平衡。3. 样品溶液的准备取合适计量的样品(如取50mg的bapp溶于50ml的水中)，在重蒸水里溶解，最后用容量瓶里定溶，最后用有机滤膜过滤，把它注入子弹头里。4. 基线的查看由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。5. 样品进样分析用25ml的微量注射器取5ml的bapp溶液，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入注射器的孔时，打开微量注射器阀，将bapp注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。6. 色谱柱的清洗分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用适当的液体来清洗色谱柱。7. 关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。五、实验数据y=701.393x+14.513峰高与浓度的关系图y=30830.8x-796.07峰面积与浓度的关系图由上图可得以下结论：该样品的主峰出现在12.983min，在此之前与之后分别存在杂质峰。主峰的峰宽为0.3326min，峰高为1619.79114mau，峰面积为93.3238104mau*s。查浓度与峰面积以及浓度与峰高关系图可以读出：当峰面积为9.33238104mau*s时，浓度c=3.05mg/ml；当峰高为1619.79114mau时，浓度c=2.29mg/ml。综上所述，该未知液的浓度为2.29mg/ml。六、实验结论与分析由于实验组分比较简单，只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用外标法作为定量的方法。最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用甲醇溶液润洗干净，以免相互影响。下面两幅图是标准溶液在不同浓度时峰面积图和峰高图。由给定的数据关系可做峰高与浓度，峰面积与浓度的关系图，在根据所得的结果，在一下图上找点，如下：由色谱图和实验结果可知，我们组该实验做的还是比较成功的。但实验中还是应该注意以下几点：1. 注意注射器的选择，应选用平头的注射器。2. 实验过程中要注意仪器在运行中不能进入气体，气泡会使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。3. 不能用纯乙腈等作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4. 每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。5. 液相色谱柱应选择c-18反相色谱柱。6. 使用缓冲溶液时，先用5%的乙腈和95%水冲洗，再用纯的乙腈清洗40分钟以充分洗去离子。7. 流动相的浓度不可以太高。篇五：乳制品中三聚氰胺的含量的测定(高效液相色谱法)实验报告2009级化学教育仪器化学综合性与设计性实验指导老师：曹* 2011年 5月 30号一、实验目的1通过分析化学综合性实验、设计性实验，培养学生初步的解决分析化学实际问题的能力，培养学生的创新意识与创新能力。2学习查阅参考文献、综合参考资料、设计小型分析化学实验。3复习和巩固有关理论基础知识并用于指导实践。4进一步熟练掌握实验操作技术。 实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法） 摘要、关键词：摘要 为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取, 离子交换萃取小柱净化, 结合高效液相色谱进行样品测定。 色谱条件: a液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/l）+ 1.0640 g柠檬酸（ph=3-4）用高纯水品配制1l溶液；b液：甲醇；色谱条件：30%b+70%a。色谱柱：cnwsil c18液相色谱柱 （4.6250mm，5 m），检测波长：239 nm结果表明: 三聚氰胺标准曲线为y = 4495951 x +18978.83 , 相关系数r = 0.9999693, 在0.17110.0 mg/l范围内线性关系良好, 方法检出限为0.12 mg/l, 两个样品三个水平的加标回收率分别为96.34 % (rsd =8. 76)、84.86 % (rsd = 7.21) 、104.29 % (rsd = 7.63) 和95.31 %(rsd = 4.39) 、89.25 % (rsd = 3.88) 、92.59 % (rsd = 5.27)。关键词 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品 引言一、目前有关三聚氰胺在乳制品中的概述：三聚氰胺(melamine) ）（化学式：c3h6n6），俗称密胺、蛋白精，iupac命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种重要的氮杂环有机化工原料, 通常用于塑料制品中合成树脂的生产 1 。它是白色9. 1g/l常温），可溶于甲醇、甲醛、不可用於食品加工或食品添加物。由于中国采用估测食品和饲料工业蛋白质含量方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人掺杂进食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被作假的人称为“蛋白精”。 蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16左右，而三聚氰胺的含氮量为66是通过测出含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5所以掺杂后不易被发现。奶粉事件：近年来, 一些不法厂商将三聚氰胺添加到奶粉中, 以增加蛋白质含量。 2008年9月, 震惊中外的“三鹿婴幼儿奶粉事件” 2 暴露出乳制品行业的“潜规则”, 国内一些知名乳品品牌也被检出其产品中含三聚氰胺 3 。 各个品牌奶粉中蛋白质含量为15-20%（晚上在超市看到包装上还有标示为10-20%的），蛋白质中含氮量平均为16%。某合格奶粉蛋白质含量为18%计算，含氮量为2.88%。而三聚氰胺含氮量为66.6%，是鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质。微溶系指1g(ml)溶质能在100ml在水中微溶，在牛奶这种水包油型的乳液中溶解度未找到实验数据，应该比水的溶解度要好一些，待验证。检测方案：在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测目前并无国家标准。因此，德国莱茵t&uuml;v集团参照美国食品化学品法典(fcc)hplc-uv定量方法，同时还可采用hplc/ms检测方法（实验室方法）对婴儿食品，宠物食品，饲料及其原料(包括淀粉，大米蛋白, 玉米蛋白, 谷朊粉、粮油等)开展的检测业务，检测结果具备权威性。因此, 如何快速、准确分析乳制品中的三聚氰胺成为多方关注的问题. 本次设计性实验在ny/t 13722007标准 4 的基础上进行改进, 结合其他产品中三聚氰胺的测定方法 5 , 利用高效液相色谱法对乳制品进行三聚氰胺含量的测定。二、对三聚氰胺的测定方法概述：国家质量监督检验检疫总局与标准化管理委员会联合发布了原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，即国标gb/t22388-2008。这一新标准制定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法及气相色谱-质谱联用法三种检测方法与标准。三聚氰胺的检测方法还包括试剂盒检测法（elisa）、离子交换色谱-紫外检测法等。1、高效液相色谱法（hplc)：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。在添加浓度2mg/kg10mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。2、气相色谱-质谱联用法（gc-ms和gc-ms/ms）：试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（sim）或多反应监测质谱扫描模式（mrm），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。其中gc-ms法在添加浓度0.05mg/kg2mg/kg浓度范围内，回收率在70%110%之间，相对标准偏差小于10%；gc-ms/ms法在添加浓度0.005mg/kg1mg/kg浓度范围内，回收率在90%105%之间，相对标准偏差小于10%。3、液相色谱-质谱/质谱法（lc-ms/ms）：试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。在添加浓度0.01mg/kg0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。4、试剂盒检测法（enzyme linked immunosorbent assayelisa）：试剂盒检测法即为酶联免疫吸附剂测定，是利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定的一种方法。5、离子交换色谱-紫外检测法：何强建立离子交换色谱-紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品用水和乙腈提取，分析时用lc-scx离子交换色谱柱分离，浓度为0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（ph3.0）-乙腈（70：30）为流动相，在紫外波长240nm处检测。三聚氰胺为0.5mg/l-100.0mg/l时，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），最低检出限为1.0mg/kg，加标回收率为93.8%102.5%，rsd<3.5%。6、其他检测法：利用抗原与抗体相互识别的原理，制作出能识别三聚氰胺的抗体试纸，将试纸插入稀释的奶制品中，则可检测出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分离技术萃取样品溶液，然后采用紫外可见光度法或化学检验的方法检测样品中三聚氰胺的含量。三、选定实验方案的原理：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，（其中包括 试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液），再经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。