限制性核酸内切酶消化DNA专家讲座.pptx

1试验二试验二 限制性核酸内切酶消化质粒限制性核酸内切酶消化质粒DNADNA限制性核酸内切酶消化DNA第1页21.1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNADNA原理与方法。原理与方法。2.2.了解酶切反应条件。了解酶切反应条件。限制性核酸内切酶消化DNA第2页3 限制性核酸内切酶是一类能识别双链限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNADNA中某特定中某特定核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNADNA核酸核酸内切酶。内切酶。在一定条件下（如适当温度、盐浓度等），它能在一定条件下（如适当温度、盐浓度等），它能在特定切割位点裂解在特定切割位点裂解DNADNA分子中磷酸二酯键而将双链分子中磷酸二酯键而将双链DNADNA分子断开。分子断开。限制性核酸内切酶消化DNA第3页4 类酶切割位点在识别序列中，有在对称轴处切割，类酶切割位点在识别序列中，有在对称轴处切割，产生产生平末端平末端DNADNA片段片段(如如Sma:5-CCCGGG-3)Sma:5-CCCGGG-3)；有切割；有切割位点在对称轴一侧，产生位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（带有单链突出末端（3 3 突出和突出和5 5 突出单链末端突出单链末端）DNADNA片段称粘性末端片段称粘性末端，如，如EcoR、Hind 切割识别序列后产生两个互补粘性末端。切割识别序列后产生两个互补粘性末端。限制性核酸内切酶消化DNA第4页5EcoR 5-G5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5G-5 3-CTTAA G-5+Hind 5-A5-AAGCTT-3 5-A AGCTT-3 AGCTT-3 5-A AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA-5 3-TTCGA A-5A-5 3-TTCGA A-5+限制性核酸内切酶消化DNA第5页6 质粒是细菌细质粒是细菌细胞内独立于染色胞内独立于染色体之外能自主复体之外能自主复制双链环状制双链环状DNADNA分分子。本试验用到子。本试验用到是是pGEM-T EasypGEM-T Easy质质粒。粒。限制性核酸内切酶消化DNA第6页7 凝胶电泳不但能够分离不一样相对分子质量凝胶电泳不但能够分离不一样相对分子质量DNADNA，也能够也能够分离相对分子质量相同，但构型不一样分离相对分子质量相同，但构型不一样DNADNA分子。分子。质粒有质粒有3 3种构型：种构型：1 1、超螺旋共价闭合环状质粒、超螺旋共价闭合环状质粒DNA DNA；2 2、开环质粒、开环质粒DNADNA，即共价闭合环状质粒，即共价闭合环状质粒DNA 1DNA 1条链断裂；条链断裂；3 3、线状质粒、线状质粒DNA DNA，即共价闭合环状质粒，即共价闭合环状质粒DNA 2DNA 2条链发生断裂。条链发生断裂。这这3 3种构型质粒种构型质粒DNADNA分子在凝胶电泳中迁移率不一样分子在凝胶电泳中迁移率不一样,所以电泳后所以电泳后呈呈3 3条带。超螺旋质粒条带。超螺旋质粒DNADNA泳动最快，其次为线状泳动最快，其次为线状DNADNA和开环质粒和开环质粒DNADNA。限制性核酸内切酶消化DNA第7页8 EcoR或或Hind能够将能够将pGEM-T Easy质粒质粒DNADNA切开成为线性切开成为线性DNADNA。用未。用未经酶切经酶切pUCpUC质粒质粒DNADNA为对照，经过电泳为对照，经过电泳迁移率比较，就能够推测酶切是否成迁移率比较，就能够推测酶切是否成功。功。_+Marker 1 2图片说明：图片说明：1 1 未经酶切质粒未经酶切质粒DNADNA2 2 经经EcoREcoR或或HindHind酶切后线性酶切后线性DNADNA和和目标目标DNADNA3000bpbp1000bp600bp500bp目标目标DNA限制性核酸内切酶消化DNA第8页9主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪主要试剂：限制性核酸内切酶（主要试剂：限制性核酸内切酶（EcoEcoRR、HindHind ）10 10酶切缓冲液酶切缓冲液 琼脂糖琼脂糖 上样缓冲液上样缓冲液 0.5TBE 0.5TBE缓冲液缓冲液 质粒质粒DNADNA 限制性核酸内切酶消化DNA第9页101.1.建立反应体系：建立反应体系：0.5mL0.5mL无菌无菌EPEP管管(总体积总体积2020L)L)2.372.37，水浴，水浴1h1h。3.3.低速短暂离心低速短暂离心。4.4.加加4 4LL上样缓冲液于离心管中混匀，上样缓冲液于离心管中混匀，1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（100V,40min100V,40min）。）。(取取1212LL点样点样)无菌双蒸水无菌双蒸水 12 12LL 质粒质粒 2 2LL 1010bufferbuffer酶切缓冲液酶切缓冲液 2 2LL内切酶内切酶 EcoEcoR R 4 4LL轻轻混匀，低速轻轻混匀，低速短暂离心短暂离心限制性核酸内切酶消化DNA第10页11质粒酶切电泳图质粒酶切电泳图限制性核酸内切酶消化DNA第11页121 1、操作时注意：、操作时注意：（1 1）分子生物学试验多为微量操作，注意吸样量准确性。）分子生物学试验多为微量操作，注意吸样量准确性。（2 2）要求在冰上操作，并充分混匀。要求在冰上操作，并充分混匀。要求在冰上操作，并充分混匀。要求在冰上操作，并充分混匀。（3 3）打开）打开EPEP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。（4 4）水浴时，将）水浴时，将EPEP管盖严，以防水进入管内。管盖严，以防水进入管内。限制性核酸内切酶消化DNA第12页132.2.内切酶使用时注意内切酶使用时注意：(1)(1)不使其污染与浪费；不使其污染与浪费；(2)(2)注意加样次序；注意加样次序；(3)(3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积1/101/10，防止星活性，防止星活性（产生星活性原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高产生星活性原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pHpH（8.08.0）、含有有机溶剂、非）、含有有机溶剂、非MgMg2+2+二价离子存在）二价离子存在）。限制性核酸内切酶消化DNA第13页143.3.质粒质粒DNADNA对结果影响对结果影响：作为内切酶底物，作为内切酶底物，DNADNA应该具备一定纯度，其溶液中不能含酚、应该具备一定纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、氯仿、乙醚、SDSSDS、EDTAEDTA、高盐浓度、酒精等，这些原因存在均不、高盐浓度、酒精等，这些原因存在均不一样程度影响限制性内切酶活力。一样程度影响限制性内切酶活力。这种抑制作用可经过以下方式克服：这种抑制作用可经过以下方式克服：（1 1）增加酶作用单位数（）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA10-20U/ug DNA）、）、（2 2）增大反应体积以稀释可能抑制剂）增大反应体积以稀释可能抑制剂（3 3）延长反应时间）延长反应时间限制性核酸内切酶消化DNA第14页154 4、反应缓冲液影响、反应缓冲液影响反应缓冲液主要由反应缓冲液主要由TrisHClTrisHCl、NaClNaCl、Mg2+Mg2+组成，组成，其中其中Mg2+Mg2+为内切酶辅基；为内切酶辅基；TrisHClTrisHCl维持反应体系维持反应体系pHpH值在值在7.2-7.67.2-7.6之间；之间；NaClNaCl浓度不一样形成种级别离子强度：浓度不一样形成种级别离子强度：低盐（低盐（10mM NaCl)10mM NaCl)中盐（中盐（50mM NaCl50mM NaCl）高盐（高盐（100mM NaCl100mM NaCl）不一样内切酶选择特定反应缓冲液。不一样内切酶选择特定反应缓冲液。限制性核酸内切酶消化DNA第15页165、酶切消化反应温度：酶切消化反应温度：DNA DNA消化反应温度，是影响限制内切酶活性一个主消化反应温度，是影响限制内切酶活性一个主要原因。不一样核酸内切限制酶，含有各自最适反应要原因。不一样核酸内切限制酶，含有各自最适反应温度。多数限制内切酶最适反应温度是温度。多数限制内切酶最适反应温度是3737，少数限，少数限制性内切酶最适反应温度高于或低于制性内切酶最适反应温度高于或低于3737。限制性核酸内切酶消化DNA第16页176、酶切消化反应时间：酶切消化反应时间：反应时间依据酶单位与反应时间依据酶单位与DNADNA用量之比来定，标准是用量之比来定，标准是DNA:DNA:酶酶=-:。本试验本试验1 1小时即可充分酶解。小时即可充分酶解。限制性核酸内切酶消化DNA第17页187 7、限制性内切酶反应终止，通常有以下两种方法：、限制性内切酶反应终止，通常有以下两种方法：（1 1）采取）采取6565条件下温浴条件下温浴20min20min，经过加热失活内切酶；，经过加热失活内切酶；（2 2）加终止反应液（如）加终止反应液（如0.5 mol/LEDTA0.5 mol/LEDTA使之在溶液中终浓度使之在溶液中终浓度到达到达10 mmol/L10 mmol/L）螯合内切酶辅助因子）螯合内切酶辅助因子Mg2+Mg2+使内切酶变性以使内切酶变性以终止反应终止反应.限制性核酸内切酶消化DNA第18页19谢谢谢谢各各位位限制性核酸内切酶消化DNA第19页