食品微生物检验学实验指导.doc

食品微生物检验学实验指导课时分配及主要实验内容(总学时30,其中动检20,动食安30)实验1 微生物检验常规试验预备 3主要内容：菌落总数测定和大肠菌群检验所需的1）研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌；2）实验所需培养基（营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管）和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。实验2 菌落总数测定 3主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种与琼脂倾注；3）24h后菌落计数及结果报告。实验3 大肠菌群MPN测定 3主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种于乳糖胆盐发酵管，培养；3）24h后观察产酸产气情况，划线于EMB琼脂，培养；3）48h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；4）查MPN检索表，报告结果。实验4 蜡样芽孢杆菌检验 3主要内容：1）将细菌肉汤培养物划线于普通琼脂、MYP琼脂，点种于卵黄琼脂平板，接种生化培养基，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果。4）报告。实验5 致病性球菌检验 3主要内容：1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。4）报告。实验6 魏氏梭菌检验 3 主要内容：1）形态及染色特性观察；2）细菌厌氧培养；3）家兔“泡沫肝”试验实验7 霉菌检验 2主要内容：1）观察曲霉、毛霉和青霉在PDA琼脂上的菌落特性；2）挑取霉菌培养物制备压片，在显微镜下观察霉菌菌丝、孢子等结构。实验8 肉的微生物学检验 2主要内容：1）鲜肉的感官性状观察；2）鲜肉压印片制备与镜检、细菌计数；3）微生物毒素呈色反应。实验9 乳的微生物学检验 2主要内容：1）鲜乳的感官性状观察；2）乳的涂片制备与镜检、细菌计数；3）美兰还原试验。实验10 食品中沙门氏菌的检验 6主要内容：1）沙门氏菌检验所需培养基的制备；2）细菌分离与菌落挑选；3）细菌生化试验；4）血清学鉴定；5）结果报告。实验一 微生物检验常规试验预备目的与要求1.熟悉菌落总数测定和大肠菌群检验所需的各种培养基的制备。熟悉高压蒸汽灭菌器的使用。2.熟悉玻璃器皿的包装与干热灭菌方法。 主要内容： 1 研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌。2 实验所需培养基（营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管）和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。1）配制700 mL生理盐水（0.9%NaCl），分别分装与5个盐水瓶，每瓶90 mL；分装18支试管，每管9 mL。2）配制乳糖胆盐培养基（发酵管）200 mL，并分装于小试管各3 mL，每管中加入一个充满培养基的小倒管，注意一定不能有气泡。（配方：2%蛋白胨，0.5%猪胆盐，1%乳糖，调pH7.4，然后加入0.4%溴甲酚紫2.5ml/100ml）3）配制普通琼脂培养基400ML，分装于2 个三角瓶。（0.5%NaCl，1%蛋白胨，0.3%牛肉粉（膏），pH7.4，琼脂粉1.5%）4）配制伊红美蓝培养基300 mL。（配方：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.3%，pH7.4，琼脂粉1.5%，加热溶化后加入乳糖1%、2%伊红水溶液2 mL/1000 mL、0.65%美蓝1 mL/1000 mL）5）TTC培养基 （1）2%乳糖发酵管40支，每管2.5ml（2%乳糖，2%蛋白胨）。 （2） TTC培养液100ml（2%蛋白胨，1%Nacl，1%Na2HPO4.12H2O,0.4%十二烷基硫酸钠，PH7.4） （3）灭菌后加10%TTC8ml后分装于（1），每管加2.5ml。6）DC培养基（0.5%蛋白胨，0.5%Nacl，1%乳糖，0.3%K2HPO4.3H2O，0.2%柠檬酸铁铵，琼脂粉0.7%）溶于水后调PH7.2，加入10%去氧胆酸钠 1ml及0.4%溴麝香草酚兰1.6ml。思考题1 配制培养基时的一般原则和注意事项？2 使用高压灭菌器和恒温干燥箱的注意事项？实验二 菌落总数测定目的与要求 通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。 菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。实验器材及试剂 温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液，等。 实验内容（一）检样稀释及培养： 1. 以无菌操作，将检样 2 5 g（或 2 5mL）剪碎放于含有 2 5 0 mL（或 2 2 5 mL）灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1： 10的均匀稀释液。 2. 用1mL灭菌吸管，吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：100倍稀释。 3. 另取lmL灭菌吸管，按（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL灭菌吸管。 4根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。 5. 稀释液移入平皿后，应立即将冷至46 左右营养琼脂培养基（可放置46 水浴中保温）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。 6. 待琼脂凝固后，翻转平板，置37温箱内培养2 42h时（肉、水产、乳、蛋为 482h）取出，计算平皿内菌落数，乘以稀释倍数，即得每g（mL）样品所含菌落总数。（二）菌落计数方法 作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜观察，以防遗漏。在记下各皿的菌落数后，求出同稀释度的各皿平均菌落数。（三）菌落计数的报告 包括三步。 1平板菌落数的选择 选取菌落数在30 3 0 0之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。 2. 稀释度选择 （1）选择平均菌落数在30300之间，乘稀释倍数。 （2）若两个稀释度，其菌落数均在30300之间，则视二者之比来决定。比值小于或等于2，应报告平均数，大于 2则报告其较小的数字。 （3）若所有稀释度的平均菌落数均较大于300，则应按稀释度最高的平均数乘以稀释倍数报告。 （4）若所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低平均数乘以稀释倍数。 （5）若所有稀释度均无菌落的生长，则以小于（）1乘以最低稀释倍数报告之。 （6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以其稀释倍数。3菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示，详见表21。思考题1 菌落总数的食品卫生学意义？2 影响本实验结果的因素有哪些？ 表2-1 稀释度选择及菌落数报告方式例 稀释液及菌落数 两稀释 菌落总数 报告方式次 101 102 103 液之比 （个/g或mL） (个/g或mL)1 多不可计 164 20 16400 16000或1.6 1042 多不可计 295 46 1.6 37750 38000或3.81043 多不可计 271 60 2.2 27100 27000或2.71044 多不可计 多不可计 313 313000 310000或3.11055 27 11 5 270 270 或2.71026 0 0 0 110 107 多不可计 305 12 30500 31000或3.1 104 实验三 大肠菌群数的测定目的与要求 1掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。2熟悉检验中各种培养基的配制。3了解大肠菌群的食品卫生学意义原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber-简称MPN）表示。实验器材及试剂样品：乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、乳糖胆盐发酵管、伊红美兰琼脂、乳糖发酵管、DC半固体培养基、TTC乳糖培养基、灭菌中性定性滤纸片，等。实验内容一、常规检验法1检样稀释及培养 取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成1:10的均匀稀释液为检样。同一稀释度在做菌落总数的测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。 2乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置361温箱内,培养242小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。 3 分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养1824小时后取出,观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。 4证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌落12个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置361温箱培养242小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性. 5报告 根据证实大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)食品中大肠菌群的最可能数. 二、快速检验法（一）T T C（氯化三苯四氮唑）显色快速法 样品处理同常规法。具体操作步骤：1接种 每份样品以无菌操作接种lmL、0lmL、001mL各三管于TTC乳糖培养基中，如接种量为10mL，则用三倍TTC乳糖培养基。 2培养 接种后，置3537 温箱中培养1824h。 3结果判定 观察TTC乳糖培养基呈色和产气情况。按下列标准进行判定。见表3-1，表31 显色法的大肠菌群结果判定 显 色 产气 大肠菌群判定紫红、深红、红色、浅红色、局部红色 十 阳性紫红、深红、红色、浅红色、局部红色 阴性小红点或局部浅红色 阳性无色透明或有小红点，局部浅红色 阴性不变红色 阴性 4结果报告根据阳性管数查MPN检索表，得出结果并报告之。 5注意事项 观察产气时，如小导管内有肉眼可见气泡，均为产气阳性，另要注意导管有无被沉淀物堵塞，如轻轻振动试管，有小气泡上升者仍为阳性。（二）DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法 样品稀释同常规法，具体操作步骤： 1. 接种 液体样品选择原液、1：10、l：100三个稀释度的样品液，每个稀释度取三个1mL，分别放入灭菌试管中。固体样品取1：10稀释液三个10mL（1g）样品分别注入三个灭菌试管内，再取1：10稀释液三个lmL和1：100稀释液三个lmL分别加入灭菌试管内。 2加入培养基并进行培养 接种1mL样品的试管，注入已溶化并冷至50左右的DC半固体培养基3mL，接种10mL样品的试管加入三倍DC培养基5mL，立即将样品与培养基充分混合，待凝固后，置37温箱内培养1824h。取出观察结果。 3结果判定和记录则分别按下述四种处理 （1）培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为。（2）培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡或琼脂崩裂现象，记录为十。（3）培养基为绿色，有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为土。（4）培养基为绿色，记录为-。 4报告结果：判定为（ 1）和（ 4）反应结果，记录阳性管数。查MPN检索表并报告之。 如遇（ 2）、（ 3）项反应结果，可挑23个大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，置37温箱中培养1824h。时，根据产酸产气管数查MPN检索表并报告之。（三）纸片快速法 1制备纸片 将中性定性滤纸裁成 10 12cm，然后叠成 56cm大小双层纸片，灭菌后用专用培养基浸渍，然后3740烘干，以无菌操作放入塑料袋内备用（塑料袋为耐高温的聚丙塑料膜，以利消毒）。 2接种样品 样品稀释方法同前述液体和固体样品培养。（ 1）液体样品：取原液、 1:10、 1:100三个稀释度各三个1mL，分别涂布于9张纸片上。（2）固体样品：取原液、 l:10、 1:100三个稀释度各三个lmL，分别涂布于9张纸片上。3培养 将上述纸片置37士 1温箱中，培养15小时观察结果。4结果判定 根据以下情况分别判定：（1）纸片上出现紫红色菌落，其周围有黄圈者为阳性。（2）纸片为一种颜色，无菌落生长者为阴性。（3）纸片呈紫色，有紫红色菌落，其周围无黄圈者为阴性。（4）酸性食品接种后，纸片变黄，经培养后无紫红色菌落为阴性。（5）纸片变色呈现不典型菌落，结果可疑者，应做复发酵进行验证。5结果报告 根据纸片的阳性片数，查大肠菌群MPN检索表并报告之。6注意事项有二。（1）用培养基浸渍过的纸片，应避光保存，并注意防潮，可放冰箱中保存备用。（2）如发现纸片变为粉红色即为失效。 思考题 1大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？ 2作空白对照实验的目的？ 3为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？ 4复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？表3-2大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN100ml（g）95可信限1ml（g）30.1ml（g）30.01ml（g）3下限上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160520000003333012390130160190102101111000001234070110150102301111111101237011015019030360111122220123110150200240303601111333301231602002402903036022220000012390140200260103702222111101231502002703403044022222222012321028035042070703904702222333301232903604405301001500333300000123230390640950407015012001300180033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000注： 表采用3个稀释度1mL（g）、0.1mL（g）和0.01mL（g），每稀释度3管。 内所列检样量如改用10mL（g）、1mL（g）和0.1mL（g）时，表内数字相应降低10倍；如改用0.1mL（g）、0.01mL（g）和0.001mL（g）时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。 实验四 食品中蜡样芽胞杆菌的检验 目的与要求 通过本实验要求了解蜡样芽胞杆菌的主要生化特性、毒力测定与类似菌鉴别；掌握本菌的形态特征，选择培养基的菌落特点。 实验器材及试剂 温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、硝酸盐培养基、酪蛋白琼脂、10卵黄琼脂、酚红葡萄糖肉汤，等。 实验内容一、活菌计数： 活菌计数是取样品25g（或25mL），用灭菌生理盐水（或磷酸盐缓冲液 PH7.0） 225mL稀释（固体样品如肉或肉制品等，应无菌研磨制成匀浆后稀释），稀释度为1:10，再将此稀释液作1:10（样品的实际稀释度为1:100，以下各稀释度类推）、1:100、1:1000和1:10000稀释，取各稀释度0.1mL，接种在10卵黄琼脂或MYP（甘露醇卵黄多粘菌素）琼脂上涂匀后，置 3 7温箱中培养1220h，选取菌落数在30个左右者计数，蜡样芽胞杆菌的菌落在卵黄琼脂上呈粉红色，周围呈乳白色混浊环，在MYP琼脂上呈灰白色或微带红色，并且在粉红色（表示不发酵甘露醇）的背景中环绕白色至淡红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。 计数后，从中挑取5个典型菌落作证实试验，根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落，计算出该皿内的蜡样芽胞杆菌数，然后乘其稀释倍数，即得每 g（或mL）样品中所含蜡样芽胞杆菌数，例如，将固定检样1:10000的稀释液0.lmL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板上，生成的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g检样中蜡样芽胞杆菌数为： 254510410=2106二、细菌培养：将检样或其稀释液接种于血琼脂或MYP琼脂平板，置37温箱内培养1220h，挑取可疑菌落接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，以备证实试验用。 三、证实试验 1形态观察：革兰氏染色法镜检，芽胞卵圆形，芽胞较菌体小，位于中央或稍偏一端。 2培养特性：蜡样芽胞杆菌在肉汤中呈混浊生长，常微有菌膜或壁环，振荡易乳化。营养琼脂上呈不透明、表面粗糙、似毛玻璃或融蜡状，边缘似齿轮状。 3生化特性：蜡样芽胞杆菌有动力，还原硝酸盐，接触酶阳性，溶血，不发酵甘露醇和木糖，常能液化明胶和溶菌酶试验阳性，淀粉酶试验阳性，厌氧条件下能发酵葡萄糖。1）硝酸盐试验：将纯培养的细菌穿刺接种于硝酸盐培养基中，培养1824h后，取出检查，有动力的细菌，可由穿刺线向四周扩散生长，使周围的培养基变混浊，无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，周围的培养基仍然保持透明，然后沿管壁加入硝酸盐还原指示剂甲液和乙液各二滴，能还原硝酸盐的细菌立即呈红色。 2）酪蛋白琼脂：划线后于37培养48h，观察菌落周围培养基，如透明表示酪氨酸蛋白酶阳性。 3）卵磷脂酶试验：取肉汤培养物点种于10卵黄琼脂平板上，置37培养3h，蜡样芽胞杆菌产生混浊环，6h后混浊环扩散至56mm。 4）厌氧发酵葡萄糖试验：取1环肉汤培养物接种于3mL酚红葡萄糖肉场内，置厌氧罐中，37培养24h，观察培养基颜色是否由红变黄，如果变黄，为厌氧条件下利用葡萄糖产酸阳性。 思考题1 为什么在检验食品中的蜡样芽胞杆菌时要进行活菌计数？2 蜡样芽胞杆菌的主要生化特性？ 实验五 致病性球菌的检验 目的与要求 1掌握葡萄球菌和溶血性链球菌的常规检验方法。 2认识葡萄球菌和溶血性链球菌的形态、培养和生化特性。实验器材及试剂 温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、健康人血浆、新鲜兔血浆、血琼脂平板、杆菌肽药敏纸片等。 实验内容一、葡萄球菌的检验 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，并使血浆纤维蛋白发生凝固，呈现阳性反应。 一）检样的采集与处理 取25 g检样加入 225 mL灭菌生理盐水内制成混悬液。 二）细菌的形态与培养观察 1吸取混悬液5mL接种7.5氯化钠肉场50mL，同时挑取混悬液接种血平板及 Baird-Parker氏培养基，置36士1 温箱培养24h。如果血平板上菌落呈金黄、大而突起、圆形、不透明、表面光滑、周围有溶血圈。BairdParker氏培养基上为圆形、光滑、突起、湿润，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围为混浊带和透明带时，则初步判断为金黄色葡葡球菌。 2挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检，如见到革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞、无荚膜的细菌，则可认为是该菌。 三）血浆凝固酶试验 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL于小试管中，加入葡萄球菌肉场培养物0.5mL，振荡摇匀，放36土 l温箱或水浴内，每小时观察一次，观察6h，出现凝固即为阳性。同时取已知阳性和阴性菌株及肉汤作对照。二、溶血性链球菌 A群链球菌能产生一种激活酶，此酶能激活血液中的溶纤维蛋白酶原（亦称胞浆原），使之变为有活性的溶纤维蛋白酶，以溶解纤维蛋白。产生链激酶的细菌除A群链球菌外，还有C和G等群键球菌。 一）检样的采集与处理 取25 g检样加入225mL灭菌生理盐水内制成混悬液。 二）细菌的形态与培养 1取混悬液接种于血平板上，并吸5mL接种于50mL葡萄糖肉浸液肉场内。如检样污染严重另取5mL接种匹克氏肉场，培养24h。挑取乙型溶血、圆形突起的细小菌落，接种血平板（纯精养）。如菌落呈灰白色、半透明或不透明，表面光滑、有浮光、圆形突起的细小菌落，周围有24mm无色透明的溶血环，可初步认为是溶血性链球菌。 2批取菌落作革兰氏染色镜检，如见到革兰氏阳性球菌，不形成芽胞，无鞭毛，链状排列时可判定为该菌。 三）链激酶试验 1方法：取健康人血浆0.2mL（草酸钾0. 01g、加入5mL人血混匀，经离心沉淀吸取上清液，即为血浆），加入0.8mL灭菌生理盐水，混匀后，加入被检菌肉场培养液0.5mL，再加入0.25氯化钙溶液0.25mL，振荡后放入36水浴中。 2结果：10分钟内血浆先凝固，随后又溶化。血浆溶化的时间长短，视激活酶含量多少，链激酶愈多，溶化所需时间愈短，强阳性者可在20min内完全溶化凝固的血浆，24h仍不溶化者为阴性。 四、杆菌肽敏感试验 1.方法：挑取乙型溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板（肉浸液琼脂加入5%血液）上。用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，放36士1培养1824h。 2结果如有抑菌环现即为阳性，可初步鉴定为A群链球菌，同时用已知阳性菌株作对照。思考题1 金黄色葡萄球菌的毒力主要表现在哪几个方面?2 链球菌与食物中毒的关系? 与肠球菌的比较? 实验六 魏氏梭菌检验目的与要求 1认识魏氏梭菌的形态及染色特性 2掌握魏氏梭菌检验方法。 实验器材及试剂 温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载波片、革兰氏染色液SPS琼脂、动力一硝酸盐培养基含铁牛奶培养基卵黄琼脂平板。 实验内容 一、形态及染色特性观察 本菌为革兰氏阳性的粗大杆菌，单在或成双排列。芽胞呈卵圆形位于菌体中央或近端。在机体内形成荚膜，无鞭毛，不能运动。在陈旧的培养物中，菌体呈革兰氏阴性。 二、活菌计数培养 1按无菌操作称取食品检样25g（ mL）放入均质器，加01蛋白胨水稀释剂225mL，低速搅动12分钟，使之均质化，做成1：10稀释。 2以上述1： 10稀释的均质液按lmL加01蛋白胨稀释剂9mL，做成10-210-6的系列稀释液。 3吸取各稀释液分别放于2个灭菌平皿内各lmL。每个平皿浇注约50的SPS琼脂 1520mL，仔细转动手血，使稀释液和琼脂充分混匀。 4上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内36士 1培养24h。 5选取长有30300个黑色菌落的平板，计数。 三、证实试验 1由平板上任取10个黑色菌落，分别接种FT培养基； 36土 1培养1824h。 2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检，检查培养液的纯净度。 3用接种环（针）穿刺接种动力一硝酸盐培养基， 36土 1培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。然后滴加 a一萘胺液和对氨基苯磺酸液各05mL，观察硝酸盐是否被还原。 4取生长旺盛的FT培养液lmL接种含铁牛奶培养基，于46水浴中培养，2h时后观察有无“暴烈发酵”现象。5h不发酵者为阴性。 5用接种环蘸取FT培养液点种卵黄琼脂平板（每个平板至少可点种10点），倒置厌氧培养装置内，35培养24h，观察接种点的乳白色混浊变化，以判定有无卵磷脂酶产生。 四、菌落计算 根据黑色菌落的计数（5）和证实试验的结果，计算每g（mL）食品检样的含菌数。 例如，10-4稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供作证实试验的10个菌落中有7个被确证为魏氏梭菌，则每g（ mL）食品检样所含魏氏梭菌数： 1000.7104=7105 五、家兔“泡沫肝”试验：取待检菌1824h液体培养物0.5mL，经耳静脉注射家兔，10min后处死，置37温箱内58h，剖检。如有魏氏梭菌存在，则可见各脏器有许多气泡，尤以肝脏为甚，故称为“泡沫肝”或 “海绵肝”。用肝脏作涂片镜检和细菌分离培养。思考题1 魏氏梭菌的形态染色特性和培养特性?2 “暴烈发酵”的原理是什么? 实验七 霉菌和酵母计数目的与要求 了解和掌握食品中霉菌和酵母计数的测定方法；了解霉菌直接镜检计数法。实验器材及试剂被检肉样，灭菌试管，灭菌吸管，灭菌平皿，天平，量筒，三角瓶，剪刀，镊子，载玻片，显微镜，香柏油，擦镜纸等。马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（附加抗生素），孟加拉红培养基。实验内容一、琼脂倾注法1 以无菌操作称取检样25g（mL），放入含有225mL灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇30min，即为1:10稀释的样品。2 用灭菌吸管吸取1:10样品液10mL，注入灭菌试管中，另用1mL一支灭菌吸管反复吹打50次，使霉菌孢子充分散开。3 吸取1:10样品液1mL注入含有9 mL灭菌水的试管中，另换一支1 mL灭菌吸管吸吹5次，制成1:100样品液。4 按上述操作顺序做10倍系列稀释，每稀释一次，换用一支灭菌吸管，根据对样品污染程度的估计选择3个合适的稀释度，分别在进行稀释的同时吸取1mL样液置于灭菌平皿，每个稀释度做个平皿。然后将融化后保存在水浴中的琼脂培养基倾注入平皿，轻轻转动平皿使样液与培养基充分混匀，待琼脂凝固后倒置于温箱中，后开始观察，共观察。 计数方法：通常选择菌落数在10150之间的平皿进行计数，取同一稀释度的两个平皿菌落数的平均值乘以稀释倍数，即为每克（毫升）检样中所含霉菌和酵母数。稀释度选择和菌落报告方式可参照“菌落总数测定”。 报告：每克（毫升）食品中所含霉菌和酵母数以cfug（）表示。二、霉菌直接镜检计数法本方法适用于番茄酱罐头，常用郝氏霉菌计测法。检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460(即浓度为7.9%8.8%)，备用。2 显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90倍125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。3 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液用玻璃棒均匀地摊布于计测室，以备观察。4 观测：将制好的载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一个检样观察50个视野，同一检样应由2人进行观察。5 结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝且其长度超过标准视野直径（1.382mm）的1/6（测微器的一格）或3根菌丝总长度超过标准视野的1/6，即判为阳性，否则为阴性。按100个视野计，其中发现菌丝体阳性的视野数，即为霉菌的视野百分数。附：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）： 马铃薯（去皮切块） 300 g 葡萄糖 20 g 琼脂 20 g 蒸馏水 1 000 mL 制法：将马铃薯去皮切块，加1 000 mL蒸馏水煮沸 10min20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121高压灭菌20 min。孟加拉红培养基： 蛋白胨 5 g 葡萄糖 10 g 磷酸氢二