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(word完整版)医学微生物与学实验指导

医学微生物与免疫学

实验指导

主 编 韩 莉
副主编 王嘉军 吴红艳
编 者 （以姓氏笔画为序）
王 磊 王嘉军 刘 英 吴红艳
杨建林 周永芹 张 颖 张丽红
宋银宏 邹黎黎 韩 莉 柳长柏

三峡大学医学院生物病原部
20012年5月29日

前 言
本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成,通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时，学生也能利用本实习指导作为工具,顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导.限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验,发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。
为了提高实验课效果,保证实验课质量，要求学生做到：
1．实验前必须做好预习，以了解实验的内容、目的、理论依据、操作方法及注意事项，避免或减少错误的发生.
2．实验过程中坚持严肃性,严格性与严密性，对操作的实验要在全面理解的基础上，按步骤依次进行操作，进行积极地思考；对示教内容要仔细观察并与有关理论密切联系.
3．如实记录,分析结果，得出结论.如结果与理论不符，应尽量分析，探讨起原因以培养训练自己的思维能力,最后写出实验报告。
4．实验报告中部分内容需要绘图，其具体要求如下：（1)必须在认真观察多个标本并基本掌握所观察标本的典型结构之后再绘图。（2）绘图要用规定的报告纸和铅笔画点线构成的轮廓图（部分绘图用彩色笔）。（3）绘图时要线条清晰，注字准确清楚，并应向右侧指线。（4）要妥善处理同一标本各部层次及同类标本间大小，比例关系.将放大倍数写于图下
编者
2012年5月29日

内 容 简 介

第一篇 医学微生物学
医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分,我们将医学微生物学实验课内容分为六个单元,改变以往单一的实验方式,在综合性实验的基础上开设设计性实验，学生能比较系统地了解常用微生物学实验的原理、方法、结果分析、注意事项及用途，可以帮助学生理解和巩固所学的理论知识，培养学生的操作技能以及观察问题，分析、解决问题的能力、严谨的科学态度，同时实验与病案讨论结合，学生能将理论知识与临床实践有机联系,为学习其它基础医学,临床医学及预防医学奠定基础,从而提高学生的综合素质。

第二篇 医学免疫学
实践教学是课程建设的重要环节，培养和提高学生的综合素质与创新能力重要途径。在免疫学实验教学中我们大力改革实验教学的形式和内容，将免疫学的16学时实验内容分为两大部分,第一部分为综合性实验,包括了解天然免疫的组成与生物学功能的检测；常见体液免疫检测指标的设计，使学生能较熟练应用基本的免疫学实验技术，能针对不同的临床病例开展相关免疫学项目的基本检测，并对检测结果进行合理的临床解释和分析.为了学生既能适应一般临床与科研工作，又具有一定的创新工作能力。第二部分我们开设设计性实验：市场有某一生物制剂有免疫增强作用,请设计实验方案证实。在这部分内容要求同学们初步掌握从不同角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计，掌握与了解常见细胞免疫的检测技术和应用（ELISA检测细胞因子）、免疫标记技术的种类、原理、特点、应用、淋巴细胞分离记数技术、淋巴细胞增殖等实验。

目 录

第一篇 医学微生物学
实验室规则 ………………………………………………………………………6
实验一 常见细菌形态学检查方法（综合性实验) …………………………7
实验二 细菌的分离培养法与消毒灭菌（综合性实验） ……………………15
实验三 化脓性球菌的分离鉴定（设计性实验） ……………………………30
实验四 肠道杆菌的分离鉴定（设计性实验） ………………………………34
实验五 厌氧菌、分支杆菌的检查法(综合性实验）……………………… 43
实验六 真菌及其它微生物检测(综合性实验）…………………………… 49
实验七 病毒学检查法（综合性实验）……………………………………… 49
实验八 微生物学分子生物学技术
微生物学各论自学提纲………………………………………………………… 59
第二篇 医学免疫学
实验一 天然免疫功能的检测（综合性实验）…………………………………60
实验二 常见抗原抗体反应（综合性实验）……………………………………67
实验三 细胞免疫检测I：细胞因子的检测(设计性实验）……………………86
实验四 细胞免疫检测II：淋巴细胞分离、计数及活性检测（设计性验）…………………………………………………………………………………96
实验五 细胞免疫检测III:淋巴细胞增殖实验（设计性实验）……………105
综合复习 ……………………………………………………………………… 104
附录 ……………………………………………………………………………115

实 验 室 规 则
由于实验对象主要是病原微生物，进入实验室必须严格遵守下列规则：
一、必须穿工作服(白大褂)才能进入实验室，除必要的书籍、文具外，其它杂物不得带入室内，离室时脱下的白大褂折叠好。
二、实验室内不准吸烟、饮食，不准口吸移液管或用嘴湿润铅笔、标签等.实验室要保持肃静和秩序，不得高声谈笑和随处走动。
三、实验室中若不慎发生病菌污染桌面、衣物、伤口等意外，请报告指导教师进行适当处理,微生物学实验室意外的紧急处理办法:
1．皮肤破损：先除去异物，用生理盐水或蒸馏水洗净后，涂2 %红汞或2 ％碘酊。
2．烧伤：局部涂凡士林、5 %鞣酸或2 %苦味酸。
3．化学药品腐蚀伤：强酸--先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和。强碱--先用大量清水冲洗，再用5 %硼酸溶液洗涤中和.如受伤处为眼部，经上述步骤处理后，用橄榄油或液体石蜡1～2滴滴眼。
4．菌液误入口中：立即将菌液吐入消毒容器内，并用1：1000高锰酸钾液或3 ％双氧水漱口；根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。
5．菌液污染桌面:将适量2 ～3 %来苏或0。1 %新洁尔灭倾倒于污染处，浸泡30分钟后抹去。如手上沾有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后,再用肥皂和清水洗净。
6．火警：如发生火警时须沉着、冷静，切勿惊慌，应立即关闭电闸和煤气阀门。如为酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭。
四、请爱护、节约实验材料,若有损坏应报告教师，适当赔偿。
五、沾染过传染材料的吸管、滴管、玻片等不要乱放乱动，须按规定处理，未经许可室内物品不得携出室外.
六、实验完毕,及时清理实验室，肥皂、清水洗手;值日生打扫室内卫生，关好水电、煤气、门窗、肥皂、清水洗手后离室。

实验一、常见细菌形态学检查方法（综合性实验）
【实验内容】
一、细菌涂片制作及革兰氏染色法。
二、细菌的基本形态与特殊结构观察。
三、细菌动力的观察(悬滴法）。
四、显微镜油镜的使用和维护。
五、电镜观察细菌的菌毛。
【目的要求】
一、初步掌握细菌涂片制作过程及革兰染色的操作技术。
二、认识细菌基本形态。
三、了解细菌特殊结构及其与医学实践关系。
四、初步掌握油镜的使用和维护.
五、了解电镜在医学微生物学研究中的应用。
【实验原理】
一、革兰染色法
细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术。由于细菌个体微小，无色半透明，在普通光学显微镜下不易清晰观察,一般需经染色来增加反差，从而有利于对细菌标本的观察。染料有带阴离子着色基团的酸性染料和带阳离子着色基团的碱性染料。在一般生理条件下（pH 7.4左右），细菌菌体都带负电荷,故用于细菌染色的染料多为带阳离子着色基团的苯胺染料，如美蓝、结晶紫、碱性复红等，它们较易与细菌菌体结合.
染色方法可分单染色法和复染色法两大类。前者只用一种染料染色，只能观察细菌的形态和排列，不能显示细菌结构及染色反应性；后者是以两种以上的染料染色，可显示出细菌的特殊结构或染色反应性能，在细菌的鉴别上有一定意义,其中最常用的为革兰染色法。
细菌革兰（Gram）染色是最常用的细菌鉴别染色法,首先由Gram创用而得名.细菌染色后不仅可区别其形态和排列方式，还可根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类；不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌(G+菌），被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌（G-菌）。革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别,同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。
革兰染色的原理目前存在三种假说:
1．通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质,乙醇易渗入。
2．等电点学说 革兰阳性菌等电点(pI 2 ～3)比革兰阴性菌（pI 4 ～5）低,在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易脱色。
3．化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色.
在细菌标本染色前，必须将细菌固定在载玻片上，常用的固定方法为加热法，其目的是杀死细菌，且保持原有形态,并使细菌粘附在载玻片上，不致染色时脱落。
二、细菌的基本形态和特殊结构观察
1、油镜用油的原理
观察细菌形态，需要放大，过去的实验课观察标本时，多用低倍镜、高倍镜放大。观察细菌标本时,必须用放大倍数更高的油镜才能清楚地看到细菌形态特点。因之微生物学实验主要使用油镜。
油镜的特点是前透镜很小，油镜头的标记也因厂牌不同而异，一般多刻有放大率。如(90×，100×），镜口率(N.A=l。25或1.30),Oil，国产镜头刻“油”字等。
油镜可以使标本放大1000—2500倍，研究细菌形态必须用油镜。油镜观察时,在标本与镜头之间必须滴加镜油，否则视野不清。原因是油镜前透镜很小，光线通过玻片标本后在空气中发生折射,进入镜头的光线少，致使视野暗物象不清。如在标本与镜头间加一滴（切勿散开）与玻片折光率（N=l。52）相近的香柏油（N=l。515）则进入镜头的光线增多,视野明亮物象清晰(图2）滴油又能增加油镜孔径数值，提高显微镜的分辩率等。

玻片
透镜
香柏油

图-2 油镜的原理

2、细菌的基本形态和特殊结构
细菌的基本形态可分为球菌、杆菌和螺形菌三类。球菌按其分裂繁殖方向与分裂后排列情况又分为双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等;杆菌也有球杆菌、链杆菌、分枝杆菌、棒状杆菌等之分;螺形菌中菌体仅有一个弯曲，呈逗点状者叫弧菌，菌体有2～3个弯曲，且较僵硬者为螺菌。某些细菌除了有细胞壁、细胞膜、细胞浆和核质这些基本结构外，还具有其他特殊结构，包括荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。这些特殊结构有着各自的不同意义。
三、细菌动力的观察（悬滴法）
许多杆菌、弧菌具有鞭毛，有动力，在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地方.一般球菌无鞭毛,没有动力，但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的颤动。
四、电镜观察细菌的菌毛
电子显微镜是根据电子光学原理,用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。
 电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示.20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0。3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米）。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子。
【实验材料与仪器】
一、无菌牙签、革兰染色液（结晶紫染液、碘液、95%酒精、复红染液）、生理盐水、载玻片、冲洗用具等
二、普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸
三、球菌、杆菌、螺形菌及特殊结构示教片
四、葡萄球菌、变形杆菌幼龄（8～12小时）肉汤培养物、凹玻片、盖玻片、 凡士林等
五、电镜H-7500，放大倍数20～60万倍,最大分辨能力0。204 nm
【实验方法与步骤】
 一、细菌涂片制作及革兰氏染色法
1．制片：
⑴ 涂片：取清洁玻片一张,在玻片的中央滴一小滴生理盐水（滴加生理盐水不宜过多)。用无菌牙签挑取牙垢少许，与玻片上的水滴混匀，涂布成一厘米大小的均匀薄膜.
⑵ 干燥：将涂片放室温中自然干燥，切勿紧靠火焰烘烤，以免标本烤焦，损害菌体结构。
⑶ 固定：持玻片一端，标本面向上，迅速通过火焰三次（约2~3秒)，以玻片温度达到皮肤能耐受的温度为宜。固定的目的是杀死细菌，使其固定于玻片上，并能增强细菌对染料的通透性。
2．革兰染色：
⑴ 初染:将已固定的涂片标本，加结晶紫染液于涂面上染色1 min，然后水洗。
⑵ 媒染:加革兰氏碘液媒染1 min，水洗。
⑶ 脱色：滴加95%酒精，频频摇动载玻片，斜持载玻片，使脱下的染液流下，再次滴加酒精脱色，直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止，水洗.
⑷ 复染:用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min，水洗，自然干燥或吸水纸印干.
3．观察结果：
用油镜观察染好后的标本片,记录所见结果，染成紫兰色者为革兰氏阳性菌，染成红色者为革兰氏阴性菌。
注意事项
1．玻片一定要清洁无油。
2．加生理盐水切莫贪多以免难于干燥，涂片要均匀且薄。
3．固定标本时切勿过热，以免菌体变形.
4．要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色的时间,不宜过长或过短，以脱色至涂片为灰色为宜.
5．水洗时要以细流水徐缓冲洗，否则会将玻片上的标本冲掉.
 二、细菌的基本形态与特殊结构观察
1．方法
(1)使用显微镜油镜、观察各种球菌、杆菌和螺形菌以及细菌特殊结构的示教片，比较各菌的形态、大小、排列和特殊结构特点。
（2）绘图：将观察到的结果画在报告纸上并加以适当的描述。
2．结果
(1）细菌基本形态的观察
①球菌：见排列方式不同的各种球菌，而且革兰染色性亦不同。
②杆菌：大肠杆菌为革兰阴性的短杆菌；炭疽杆菌为革兰阳性杆菌，可见菌体粗大，两端平齐,酷似竹节状。
③弧菌：弧菌为革兰阴性菌，菌体略带弯曲,呈逗点状或括弧形，霍乱弧菌涂片染色可出现“鱼群状”的排列特点。
（2）细菌特殊结构观察：
① 肺炎链球菌（荚膜):肺炎链球菌为革兰阳性菌，成双排列。在双球菌体外围有一层较厚的透明区域，即为荚膜。
② 变形杆菌（鞭毛）：变形杆菌为革兰阴性菌，通过鞭毛染色，可见菌体周围有细长弯曲的数根丝状物，即为鞭毛。
③ 破伤风梭菌（芽孢）:破伤风梭菌为革兰阳性菌。经芽胞染色后，可见菌体顶端有一圆形,比菌体宽的结构，即为芽胞。芽胞与菌体相连形似鼓槌状,在细菌中为独有的形态。肉毒梭菌菌体次极端有一椭圆形、比菌体宽的芽胞,与菌体相连，形似网球拍状。
三、细菌的动力观察（悬滴法）

图3 细菌的动力观察（悬滴法）制片方法

1．取凹玻片两张、在凹窝周围涂抹少许凡士林。
2．各取一接种环的变形杆菌、葡萄球菌幼龄培养物，分别放于两块盖玻片中央。
3．将凹玻片反转。使凹窝对准盖玻片中心，覆于其上，粘住盖玻片后再反转。以接种环柄轻压盖玻片，使与凹窝边缘粘紧.
4．先以低倍镜找至悬滴的边缘后，再换用高倍镜观察(因凹玻片较厚,油镜焦距很短，故一般不能用油镜来检查）.
5．观察时，注意比较变形杆菌和葡萄球菌的运动情况有何不同.
注意事项
1．观察悬滴标本时，先用低倍镜找到悬滴的边缘，然后将视野移至悬滴中央,将集光器下降，缩小光圈，使亮度减弱，再用高倍镜观察，否则亮度太强,不好观察。
2．调节螺旋时，切忌过度下旋,以免压碎盖玻片。
3．用接种环在试管中取材的方法（如图4)：
（1)左手拇指、食、中三指持试管底,右手拇、食、中三指握笔式持接种环，并垂直于火焰上烧灼至发红为止。移至火焰旁待冷。
（2）在火焰附近用右小指夹取试管上的棉塞，移动后轻轻拔出，并持于小指与小鱼际之间,不得将棉塞放置桌上或触及任何物品。
(3)将试管口移至火焰上旋转烧灼，灭菌后移至火焰附近,用冷却后的接种环插入试管内取少许生理盐水（若为液体则沾取一环菌液后退出）,接种环不可与试管壁接触，以免环上生理盐水碰落。取出后立即将管口在火焰上转动灭菌后塞上棉塞。接种环使用后经烧灼灭菌插入试管架上。

图4 接种环在试管中取材的方法
四、油镜的使用和保护
1．光源的采用
（1）使用前必须对所用显微镜进行详细检查，如发现问题应及时向老师报告。
（2）调光:检查未染色标本时，以弱光线为宜，此时可将集光器下降或缩小光栅，检查染色标本时，以光线强为宜，此时应适当升高集光器或将光栅打开.
2．镜检要领
将标本置于载物台上，先用低倍镜观察。用粗螺旋调至看出物象后,再调节微螺旋，使物像更加清晰。在换高倍镜观察前，鉴于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须将被观察内容移至视野中央后再换之.有时显微镜本身存在偏心现象，此时要记住其偏心的方向和距离。
用油浸镜观察前,应先转开低倍镜或高倍镜镜头，在玻片上加一滴镜油，再转换油镜头。眼从侧方看，调节粗螺旋，使镜头浸入镜油中至接近玻片时为止（注意勿压碎玻片）。眼看目镜，调节粗螺旋提升镜筒，至看到物象，再调节细螺旋，至可清楚看到标本为止.观察完毕，应先提高镜筒，并将高倍镜(或油浸镜）头扭向一侧，再取下玻片.
※用油浸镜观察微生物标本时,应将显微镜亮度开关调至最亮，集光器升至最高，光栅打至最大.
3．保护方法
（1）微螺旋是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或下降0。1毫米,只能做往返回转，不要向单一方向转动数周。
(２）镜检完毕后,把镜筒升高，用擦镜纸把油镜头上的镜油擦净，如油已干,或透镜模糊不清,可以用擦镜纸沾少量二甲苯擦净，然后再用干的擦镜纸把二甲苯擦去。最后将物镜头转成“人”字形，降落镜筒或上抬载物台，稍微下降集光器，对号送入镜盒内。
（３）观察滴片标本时，载物台应放平，注意勿将物镜镜头接触粪液.观察封片标本时，勿使镜头与盖玻片接触,以免压坏标本或损伤镜头。观察血涂片标本时,必须按一定顺序，逐个视野检查，以免遗漏。
（４）显微镜应放置于干燥的地方，以防止镜头发霉，但也要避免阳光曝晒。
（５）酸、碱、酒精、乙醚等物对镜头均有损坏作用，禁用于擦拭镜头。

注意事项
1．显微镜使用时应小心爱护,不得随意拆卸.
2．搬动显微镜时，用一手持镜臂，一手托镜座平端.
3．载物台要放平，以防滴加的香柏油流出玻片。
4．玻片干后才能加香柏油,滴时要避免气泡形成,香柏油要适量，不宜过多或过少。
5．调节粗调节器时,动作要轻，侧面观察镜头和玻片的距离，注意使镜头与玻片不相碰。
6．用擦镜纸擦拭油镜头时，注意手法轻柔,并按同一方向拖拭，防止旋转擦拭，以免损伤贵重的油镜光学系统
五、电镜观察细菌的菌毛
1．将变形杆菌幼龄肉汤培养物制备成一定浓度的悬浮液。
2．滴于带有支持膜的铜网上，数分钟后吸去多余液体.
3．滴上染液,负染色1～2分钟。
4．吸去多余染液，干燥后即可电镜观察.
【思考题】
一、据实验体会,你认为制备染色标本时应注意哪些事项？为什么制片要完全干燥后，才能用油镜观察？油镜的使用和保护方法注意那些事项？
二、细菌的形态检查法的基本程序是什么？细菌经革兰染色后,为什么有的呈紫色,有的呈红色？能否根据细菌在显微镜下的形态来鉴别细菌.
三、书写牙垢涂片革兰氏染色的实验报告并记录细菌的基本形态与特殊结构.
【附录一】
染色液及染色法
一、吕氏减性美兰染色液配制及染色法
1、染液配制：
美兰乙醇饱和溶液（95％乙醇100ml，美兰2克）30ml
10％氢氧化钾溶液 0。1ml
蒸馏水 100ml
将上述各液混合摇匀，以滤纸过滤后备用.
2、梁色方法：
于已固定好的涂片标本上,滴加染液1～2滴，梁色1～3分钟水洗,待干或吸水纸吸干后镜检。
注：菌体呈兰色。
二、革兰氏梁色液配制
1、第一液:结晶紫染液
（1）结晶紫乙醇饱和液(95％乙醇100ml，结晶紫4～8克）20.0ml
（2)1％草酸铵溶液80。0ml。
上述二液分别配制后，按上量比例混合，滤纸过滤后备用。
2、第二液：戈（lugol）氏碘液。
碘 1.0克
碘化钾 2。0克
蒸馏水 300.0ml
将碘与碘化钾先行混合，加蒸馏水少许,充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
3、第三液：95%乙醇液
4、第四液：沙黄水溶液
（1)原液:2。5％沙黄水溶液。
（2)应用液:原液10ml加蒸馏水90ml即成。
三、奈瑟（Neisser)氏染液配制及染色法
1、染液配制：
第一液：美兰0。01克。
95％酒精5ml。
冰醋酸5ml
蒸馏水100ml
将美兰研碎溶于酒精内，将冰醋酸加于蒸馏水内,再将冰醋酸液加于美兰液中混合，24小时后用滤纸过滤备用.
第二液：结晶紫 1克。
95%酒精 10ml。
蒸馏水 300ml。
以上三种成分混合溶解后过滤备用。
染色前将第一液二份与第二液一份混合，用此混全液染色。
第三液：黄叱精2克
蒸馏水 300ml
将黄叱精溶于蒸馏水中,趁热过滤备用.
2、染色方法:
于已因定的涂片标本上滴加第一、二液的混合液，梁1~２分钟，水洗。再用第三液染半分钟，倾去染液,吸干镜检。
注：白喉杆菌菌体染成黄褐色,异染颗粒则呈兰黑色。
四、阿尔培脱（Albert）氏染色液配制及染色法
1、染液配制：
第一液:甲笨胺兰 0。15克
孔雀绿 0.2克
95％酒精 2ml
　　　 冰醋酸 1ml
　　　蒸馏水 100ml
将甲笨胺兰和孔雀绿置于研钵中,加酒精研磨使溶,再加入蒸馏水和冰醋酸，混合后贮入瓶中，置室温过液，以滤纸过滤后备用。
第二液：碘 2克
　　 碘化钾 3克
　　 蒸馏水 300ml
先将碘和碘化钾溶入少量水内，充分振摇，待完全溶解后再加水至300ml。
2、梁色方法：
于已固定的涂片标本上，滴加第一液染3~５分钟，水洗，再加第二液染1分钟水洗，干后镜检。
注:白喉杆菌体呈绿色，异颗粒染成兰黑色.
五、冯他那(Fontana）镀银染色液配制及染色法
1、染液配制：
（1）固定液：
冰醋酸1毫升
福尔马林2毫升。
蒸馏水100毫升。
（2）媒染液：
鞣酸5克
石炭酸1克 蒸馏水100毫升
(3)硝酸银液：硝酸银5克 蒸馏水100毫升
临用前取此种硝银液20毫升,逐滴慢慢滴入10%氨水，初生成褐色沉淀，再继续滴加氨水至沉淀溶解微现乳白色为适度。若加氨水过多，则液体转清，可加入硝酸银液,至溶液仍现微白色为度。
2、染色法：
（1）将标本涂于清洁的玻片上工作一薄片,于空气中自然干燥。
（2)滴加固定液，作用1～２分钟，用无水乙醇冲洗。
（3)滴加媒染液，并略加温至有蒸气发出，作用半分钟,用水冲洗。
（4）滴加硝酸银液,轻微加热至有蒸气出现，染半分钟，水洗,待干后镜检。
注：螺旋体呈棕褐色，背景淡黄色.
六、鞭毛染色法（魏曦染色）
1．染液配制：2 ml饱和钾明矾液，5 ml 50 g/L石炭酸液和2 ml 200 g/L鞣酸液混合.临用时加1 ml碱性复红乙醇饱和液混合后过夜,次日过滤后使用,3 d内使用效果最好.
2．染色方法：先将鞭毛菌在肉汤培养基中传代6~7次。取琼脂斜面培养基吸出凝渗水，加入2 ml无菌蒸馏水，然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处,再从该交界处向上划一直线，放入温箱中培养16 h。用接种环从交界处取一环菌液,轻轻放入盛有3～4 ml蒸馏水的小碟液体表面，使细菌自由弥散，浮在液体表面,静置于孵箱内4~5 min后,用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上，切勿研磨和摇动。置35℃或室温下让其自然干燥，切勿火焰固定，加数滴染液染色0。5 ～1 min，水洗，干后镜检,可见菌体和鞭毛均呈红色.
七、荚膜染色法
1．染液:结晶紫乙醇饱和液5 ml加蒸馏水95 ml,混匀；20 %（200 g/L)硫酸铜水溶液。
2．染色方法:将经小白鼠传代培养的肺炎链球菌进行涂片,在空气中自然干燥，无需加热固定，先滴加结晶紫染液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止。不要水洗，用硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干后油镜观察，结果菌体及背景呈紫色，菌体周围有一圈淡紫色或无色的荚膜。
八、芽胞染色法
1．染液：石炭酸复红染液、95%乙醇、碱性美蓝染液.
2．方法：用芽胞菌制成涂片，干燥后加热固定，加数滴石炭酸复红液，微加热染色5 min，冷却后用流水冲洗，用95％乙醇脱色2 min，水洗，再加数滴碱性美蓝30 sec,水洗,吸水纸吸干后镜检。其结果为菌体呈蓝色，芽胞呈红色。
【附录二】各种显微镜
暗视野显微镜
细菌形体微小半透明，未经染色时与同围对比不明显，在普通光学显微镜下不易看清，如换装上暗视野集光器，此集光器中央不透光，光线只能从周边斜射出来，故背景视野黑暗无光，但斜射到菌体上的光线由于散射作用而进人物镜，到达观察者之眼，因而在黑暗的视野中可看到明亮的被俭物体.
用暗视野显微镜检查也叫暗现野照明法，这种方法是利用被检物体表面的反射光线和衍射光线观察物体的，所以只能看到物体的存在和运动，不能认清其构造.在暗视野照明下，虽看不清结构，但可以分辨巳0。004μm以上的微粒子的存在。在普通光学显微镜明视野照明下不能看到0.2×0.004μm的微粒，在暗视野照明下可以看到，故暗视野显微镜的分辩率远较明视野照明为高,提高了观察效果，暗视野照明法多用于活细菌和螺旋体不染色标本的检查。
荧光显微镜
是以紫外光或蓝紫光为光源，使经荧光素染色的被检标本激发出波长较长的可见光-荧光,在暗视野中显现出荧光闪烁的被检物体，清晰可见,因紫外光或蓝紫光的波长较短(约为0.2lμm)其分辩率得到进一步提高。
荧光显微镜与普通光学显微镜不同之处有以下三个方面，(1)光源，荧光显微镜通常采用功率为，156-200W的高压汞灯为光源，它能发射丰富的紫外光和蓝紫光。(2）滤光片:包括激发滤片和吸收滤片，前者最常用的型号为BG12,国产型为QB24，能产生4950A的蓝紫光。后者与激发滤片配合使用,与BG12配合使用的吸收滤片是OG1,吸收掉不需要的激发光，使所需荧光通过，同时能保护眼睛不受激发光的影响。（3)暗视野集光器。由于背景暗反差大，观察荧光清晰；对放大倍故高荧光弱的标本也能进行观察。
相差显微镜
人的肉眼,只在光波的波长（颜色)和振幅（亮度)有变化时才能看到被检物体。因活的生物体多为无色透明，光波通过时，波长和振幅均不发生变化，故普通显微镜检查很难观察清楚;用暗视野检查也只能看到发光的菌体外形，看不清内部结构。相差显微镜能弥补这两种拉法的不足.其原理是利用被俭物体的光程(折射率与厚度的乘积）之差进行镜检方法.如被检物体与媒质之间，或被俭物体各部分的折射率或厚度不同，或双方都不同，光线通过时引起光相的差异;相差显微镜通过相差板的光栅作用,改变了直接光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强弱的差异使细胞某些结构比其它部分深暗，衬托出鲜明的对此。因此，这种方法不仅不需要标本的染色，还能充分利用物镜的镜日率，是做活体标本检查最好的方法。
电子显微镜
电子显微镜与光学显微镜不同，电镜是利用电子流代替光线，用电子源代替光源，用磁性线固代替放大透镜，即电子流为电子透镜所折射，经过两次放大造成最后的像。电子流波良极短,约为0.05nm，故其放大倍数极高，电镜观察的形象可以投射在荧光屏上显示，也可照相拍摄，还可明磷钨酸负染色，或金属喷涂投影，增加对比度,使图象更具立体感.电镜的电子速度越快，即电压越高，分辩率越小.如在电子流的通路上有游离气体分子,就好象光镜上有尘埃一样，与电子碰撞使其改变通路引起象的散乱，因之，镜简要保持干燥真空状态。故电镜不能观察活的微生物。

实验二 细菌的生长繁殖与消毒灭菌(综合性实验）
【实验内容】
一、培养基制备、种类、用途。
二、细菌的分离接种技术及生长情况的观察.
三、消毒灭菌的方法。
【目的要求】
一、了解培养基的制备过程及常用培养基的种类，初步学会细菌的接种方法及无菌操作法.
二、观察细菌在各种培养基中生长现象.
三、认识常用的物理和化学消毒灭菌法。
四、观察药物敏感试验的结果并了解其临床意义。
【实验原理】
一、培养基是指在人工培养细菌时，提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制品。基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源和无机盐等。在基础培养基的基础上添加一些特殊成分(如糖类、血液、抑制剂等）则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等.此外，还需具备一定的酸碱度(pH）、温度、渗透压、必要的气体、无菌等要求，用于人工培养各类细菌.
二、固体培养基的平板是从混杂的材料中分离出所需的细菌，以获得纯种;琼脂斜面培养基一般供细菌繁殖，用作纯培养;某些特殊斜面培养基可作观察生化反应等特殊用途；普通液体培养基一般作增菌用；半固体培养基可用来检测细菌是否具有动力；按用途分为：
1、基础培养基：含有细菌所需要的最基本营养成份，可供大多数细菌生长。最常用的是肉汤培养基与普通琼脂养基.
2、营养培养基：在基础培养基中加入一些血液、血清等营养物质,可供营养要求较高的细菌生长，如血琼脂平板。
3、鉴别培养基：利用各种细菌分解的作用物及其代谢产物的不同，可应用含有一定作用物和指示剂的培养基来培养细菌，作鉴别细菌之用，如糖发酵培养基。
4、选择培养基：是利用细菌对各种化学物质的敏感性不同,在培养基中加入一定的化学物质，抑制非目的的细菌生长,有利于需要分离细菌的生长，如SS琼脂平板.
5、厌氧培养基：厌氧菌必须在无氧的环境中才能生长。造成厌氧环境的方法较多,如在培养基中加入动物组织（如肉渣)或还原性化学物质（如巯基乙酸钠、半胱氨酸等)，并在培养基表面用凡士林或石蜡封住，使与外界空气隔绝。常用的厌氧培养基有肉渣（疱肉)培养基。
三、不同细菌的新陈代谢特点不同,在各种培养基中的生长现象不同，有利于鉴别与利用细菌;不同细菌对不同抗生素的敏感性不同，药物敏感试验帮助我们了解细菌对抗生素的敏感性，指导临床用药。
四、消毒（Disinfection）:杀灭病原微生物的方法.用以消毒的药物称为消毒剂（Disinfectants）一般消毒剂在常用浓度下,只对细菌繁殖体有效。对于芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间；灭菌（Sterilization）：杀灭物体上所有的微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞)的方法.无菌(Asepsis)指物体上或容器内无活菌存在的意思.无菌操作是防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。例如,进行外科手术或微生物学实验时，须注意无菌操作;防腐（Antisepsis）指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。用于防腐的化学药物称为防腐剂，许多药物在低浓度时只有抑菌作用，浓度增高或延长作用时间，则有杀菌作用。
物理消毒灭菌法即利用温度、辐射、超声波等物理条件的改变，使得蛋白质变性;核酸断裂或变构,从而抑制细菌代谢和生长或损害细胞膜的结构，破坏其生理功能等,从而起到消毒灭菌作用的方法.
化学消毒灭菌法：利用化学药物渗透细菌的体内,使菌体蛋白凝固变性，干扰细菌酶的活性，抑制细菌代谢和生长或破坏细胞壁、损害细胞膜的结构，改变其渗透性,破坏其生理功能等，从而起到消毒灭菌作用.所用的药物称化学消毒剂。有的药物杀灭微生物的能力较强，可以达到灭菌，又称为灭菌剂.凡不适于物理消毒灭菌而耐潮湿的物品，如锐利的金属、刀、剪、缝针和光学仪器(胃镜、膀胱镜等）及皮肤、粘膜，病人的分泌物、排泄物、病室空气等均可采用此法.
【实验材料与仪器】
一、各种培养基成品、血液 (脱纤维羊血或兔血) 约10 ~20 ml。
二、枯草杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌等菌种。
三、接种环（针）、培养皿、试管等.
四、 药物纸片、酒精 、镊子。
【实验方法与步骤】
一、培养基的制备原则：
①适当的营养成分。②合适的酸碱度.③配制后经灭菌后方可使用。
二、培养基配制的基本程序
按一定配方称了各种物质→溶解→测定及调整PH→滤过→分装→灭菌、备用。
三、细菌的分离接种技术及生长情况的观察
（一）细菌的分离接种法:
1．平板划线分离培养法
细菌在自然界中分布广、种类多，而被检材料又常含有一种以上的细菌,为了对特定细菌进行研究或鉴定,必须从混杂的材料中分离出所需的细菌,以获得纯种。分离的方法有多种.常用平板分区划线法.
① 烧灼灭菌接种环，以接种环取一环混合菌液。
② 左手立即持起平板，五指固定平皿盖边缘，向外反转手掌使平皿盖向上，则平板落于手掌内,用拇指和中指固定平皿边缘，再向内反转手掌，使平皿盖向下放于桌面上，但此时手指仍持住平皿边缘,并稍微提起，作好备用状态(如图1)。

图1 平板划线的手法

③ 左手斜持(45°角）平板，右手持已取材的接种环,两肘固定于实验台边缘使双手等高,平板在煤气灯或酒精灯火焰前上方5~6 cm距离，