食品微生物学实验指导(新国标).doc

实验一 光学显微镜（油镜）的使用 。1实验二 微生物培养基的配制及灭菌 。4实验三 酵母菌形态观察及微生物液体接种技术 。8实验四 微生物的死活鉴别及固体培养接种技术 。10实验五 利用血球计数板的微生物技术法 。11实验六 微生物的大小测量 。15实验七 霉菌的湿室载片培养及根霉、曲霉、毛霉、青霉的形态观察 。16实验八 放线菌的插片培养及形态观察 。19实验九 细菌的简单染色及显微镜油镜的使用、保养、细菌的革兰氏染色 。21实验十 利用毛霉有氧发酵生产豆制品 。23实验十二 食品安全国家标准 食品微生物检验。25实验十一 微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏 。3537 / 38实验一 光学显微镜（油镜）的使用一、实验目的和要求：1）了解显微镜的构造及成像原理。2）掌握显微镜的使用方法和保养方法。二、显微镜的构造及原理：普通的光学显微镜由机械裝置和光学系统两大部分组成，如下图所示：1.镜座 2.载物台 3.镜臂 4.棱镜套 5.镜筒 6.接目镜 7.转换器 8.接物镜 9.聚光镜 10.彩虹光圈 11.光圈固定器 12.聚光器升降螺旋 13.光源 14.细调旋纽 15.粗调旋纽 16.标本夹显微镜构造示意图（一）机械裝置部分： 1）镜座：是显微镜的支架，由底座和镜臂组成。 2）载物台：又称镜台，用于安放载玻片，其上安有玻片夹和玻片移动器，调节移动器上的螺旋可使载玻片前后左右移动。镜台中央有一孔，称通光孔，可使反光镜上的光反射到物镜中来。 3）镜筒：是空心的园筒，长度为160mm，用于调整显微镜的长度和总的放大倍数，其上端连接目镜，下端连接转换器。 4）转换器：其上安装三个物镜，镜检时旋转转换器即可换物镜头。注意转换物镜时。必须用手按住园盘旋转，勿用手指直接推动物镜，以免使物镜与转换器之间的螺纹松脱而损坏显微镜。 5）调焦裝置：包括粗细调焦旋钮，是调节镜筒上下移动的裝置。（二）光学系统部分：1）物镜：又称为镜头。有三个物镜头，二个干燥系物镜，一个油系物镜。物镜上标有主要参数，其含意是：例如：上排100/1.25是放大倍数为100倍，数值口径为1.25，下排160/0.17是指镜筒长为160mm，盖玻片的厚度小于0.17mm。它是显微镜的最重要的部分。普通显微镜接物镜的工作原理 2）目镜：供眼睛观察物像用的，它将物镜放大的物像再放大，配有三个目镜，其上标有放大倍数。显微镜的总放大倍数是目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积.3）聚光器：起聚集光线的作用，它可上下移动以调节最适光度。其下方安装有可变光圈,用以调节光的强度。4）反光镜：安装在镜座上。它是一个有平凹两个面的双面镜。其作用是采集外来光线，并且送入聚光器，一般采集自然光时用平面镜，采集人工光源时用凹面镜。 三、实验仪器及试剂： 双目显微镜、二甲苯、苯酚、擦镜纸、固定片等四、实验方法及步骤：一）显微镜的使用方法：1、准备工作：取出显微镜时，应一手握镜臂,一手托镜座，轻拿轻放，切忌碰撞和猛震。显微镜应放在离桌边60mm左右的位置。再将登子的高低调节好，不得将显微镜倾斜。 2、采光：将低倍镜与镜筒调节成一条直线，用双眼向下看，同时调节电光源。直至全视野有均匀的明亮度，效果最佳为至。也可同时调节聚光镜和光圈。 3、放置标本：下降载物台，将标本片放在载物台上，用玻片夹夹住，把标本移动至中央孔的位置。 4、调焦：眼睛看着低倍镜头，缓慢转动粗调旋钮，使低倍物镜头下端接近于玻片。再用左眼看目镜，慢慢调节粗调旋钮载物台下降（此时切勿向上调节，以防损坏物镜头），当看到模糊物像时，再转动细调旋钮，直至看到清晰图像为止。 5、转高倍镜观察：用手按住转换器，慢慢地旋转，当听到“咔嚓”一声即表明物镜已转到正确位置上，再稍微调节一下细调旋钮就可看到清晰图像。这是因为显微镜的成套物镜设计为共焦点。 二）显微镜的保养：1、下降载物台，取下玻片。2、清洁镜筒，用擦镜纸擦净用过的物镜和目镜，如发现擦不净时，用擦镜纸沾少许二甲苯擦净，最后用干净的擦镜纸擦去残余的二甲苯，放入镜头盒内收好。 3、清洁：擦净显微镜的其它部位。4、将显微镜的物镜转成八字形，缓慢下降载物台，聚光镜降至最低位置、关闭光圈及将调压开关至最低后关闭电源，拔下插座，盖上防尘罩，做好使用登记。 五、实验结果记录：绘出你所看到的标本图，并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 六、实验结果分析及问题讨论： 实验二 微生物培养基的配制及灭菌一、实验目的和要求：1、学习培养基的配制方法。 2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法。二、培养基的配制：培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。其中含有碳源，氮源，无机盐，生长因子和水等。并且要根据微生物的需求调节其酸碱度及培养基的状态。所以学习培养基的配制是很重要的环节。三、实验仪器及培养基：1、培养基及试剂：营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、马铃薯、蔗糖、葡萄糖、琼脂粉、苯酚等2、器材及耗材：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温干燥箱、电炉、电子天平、250 mL、100 mL烧杯、试管、250 mL三角瓶、漏斗、棉花、量筒、玻棒、10 mL移液管、粗棉线、园塑料篓，产气管等四、实验方法及步骤：一）其主要步骤是：玻璃仪器的清洗及干燥制做棉塞配制液体培养基（加凝固剂配制成固态培养基）调节酸碱度过滤、灌装及包扎灭菌检验。下面介绍重要的几步操作。1、制做棉塞：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器内。所用的棉花应是透气性很好的新鲜衣棉。制做棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有邹纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉塞的长度约为管口直径的23倍，棉塞应有2/3塞进管内（见下图）。2、配制液体培养基：培养基应先配制成液态的。按配方准确称出各种原料，用总量的1/21/3的水将原料溶解，难溶的可稍加热溶解。 3、配制固态培养基：按配方称好凝固剂，用少量水调成糊状，待液态培养基煮沸后，离开电炉将糊状的凝固剂倒入内混匀，并且补足配方所需的水，再加热煮沸。4、调节酸碱度：培养基的酸碱度可用精密试纸或酸度计来测量。调节时可用5氢氧化钠或5盐酸进行调节酸碱度，调节时要特别注意避免过头再回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。最后检查总体积是否足量，少了补充水份，多了稍加热蒸发水份。5、过滤分裝：若有杂质或固形物，用两层纱布趁热过滤（气温低要保温过滤）。分裝时加入试管的量为试管长度的1/51/4.锥形瓶约为容积的1/31/2。分裝时不得使培养基沾污瓶口及试管口，以免浸湿棉塞，造成污染。（见下图） 6、加棉塞：培养基分装后，将做好的棉塞塞好，再包上一层防潮纸，用绵绳系好。在防潮纸上标明培养基的名称、制备组和姓名、日期等。准备灭菌。 7、灭菌：采用高压蒸汽灭菌：灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物。高压蒸汽灭菌是湿热灭菌的一种。其原理是通过加热使微生物体内的蛋白质凝固变性，达到杀菌的目的。蒸汽灭菌的优点是蒸汽穿透力强，使蛋白质易于凝固变性，另外灭菌过程中产生的蒸汽凝固在物体的表面，同时放出大量的潜热，这种潜热能迅速提高灭菌物体的温度，缩短灭菌的全过程。是灭菌效果最好的一种方法。其操作过程如下： （1）在灭菌锅内加适量的水，再把用灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺栓，以防漏气。 （2）灭菌锅开始加热，同时打开排气阀，待将锅内冷空气完全排净后排气阀内有热气排出35分钟后将排气阀关闭。至压力表升至压力为0.1 MPa或温度为121时开始计时。通过调节电源或调节排气阀维持一定的压力（温度）。达到灭菌时间后（20分钟）停止加热。(在灭菌过程中应保持恒温恒压) （3）待压力表降至0位后，再打开排气阀，打开锅取出灭菌物品。如试管要制成斜面时，待试管温度降到5060时再摆成斜面，过早会产生较多的冷凝水。（4）最后将锅内的水倒出，以防生锈。8、检验：检验的目的是检查配制的培养基灭菌是否彻底。将灭菌后的培养基置于37恒温箱中保养2448小时，若无菌生长，证明灭菌彻底，可保存备用。 二）实验步骤： 1）营养琼脂（用于一般细菌培养）： 确定所需配制营养琼脂的体积Y mL，然后确定称取X g营养琼脂。用量筒量取80蒸馏水于烧杯中，在电炉上煮沸，将烧杯拿下。其余的20蒸馏水，先将少量蒸馏水将营养琼脂搅成糊状后转入煮沸的蒸馏水中，然后继续加热至煮沸（加入营养琼脂后一定要搅拌至煮沸），然后补足至Y mL，调好pH后。分装至试管（锥形瓶）塞好棉塞包扎后于12120分钟高压灭菌。如是试管,待培养基温度降至5060后摆成斜面.冷却后取23支置于37恒温培养12天，确定无菌后方可使用。(具体要求见试剂标签)2）马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（用于霉菌，酵母菌培养计数）称取Xg马铃薯葡萄糖琼脂。其余操作同上。 3）配制马铃薯液体培养基： 马铃薯200 g 蔗糖20 g 水 1000 mL 自然pH，121，灭菌20分钟 制法：马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后纱布过滤，再加糖，熔化后补充至1000 mL。吸取10 mL装入带有产气管的18180 mm的试管中。121，灭菌20分钟五、实验结果记录：1、所配制培养基的名称及灭菌参数。2、将冷却的培养基于37恒温培养2448小时后，检验所配培养基是否灭菌彻底。六、实验结果分析及问题讨论：实验三 酵母菌形态观察及微生物液体接种技术一、实验目的和要求： 1、通过观察了解酵母菌的形态结构。2、掌握微生物液体接种培养技术。3、掌握无菌操作技术及学会观察接种培养的结果。二、实验原理： 酵母菌是单细胞的真菌,细胞较大,不必染色即可用显微镜观察其形态.特别是出芽生殖时的芽体形态. 在微生物的研究工作中,为了使微生物不断延续其生命需一次次地将接种到新的培养基中让其繁殖.接种操作决不允许不需要的微生物进入培养基造成污染.将污染降低到最低限度的接种技术称为无菌操作技术.这次实验学习在无菌操作条件下,用接种环或滴管等工具将菌种接到液体培养基中,再进行培养的操作技术。三、实验材料及器材： 1、菌种：马铃薯琼脂斜面培养1824小时的酵母菌 2、培养基及试剂:马铃薯液体培养基、马铃薯固体培养基、二甲苯、95乙醇、苯酚等 3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、产气管、滴瓶、圆塑料篓、塑料篓、浆糊等四、实验方法及步骤： 1、微生物液体产气培养实验前的准备：做好试管棉塞，于试管内放入小产气管(发酵管)，小产气管管口朝下，再加入10毫升麦芽汁液体培养基，贴上标签，写好班次和学号，于121下高压蒸汽灭菌20分钟，冷却后备用 (每人二支)。2、由固体斜面菌种接到液体培养基的无菌接种技术 点燃酒精灯，在酒精灯的上方将试管棉塞旋松(切勿将棉塞拔出)，以便接种时易入拔出。 左手握二支试管，外则为固体斜面菌种管，内则为液体待接种试管，液体管的管口向上倾斜，以防液体培养基流出。 右手拿接种环，在火焰中将接种环烧红灭菌；再用右手小拇指和无名指夹住棉塞(绝对不许将棉塞放在桌上)，将试管上半部在火焰上方通过两三次后，停在火焰上方；把烧红的接种环伸入菌种试管内，先与试管壁接触一会使之冷却，再移至斜面挑取一环酵母菌，接入液体培养基中，搅拌一下取出。 接种完后将试管口在火焰中通过几次，在塞上棉塞放于试管架上。 将接种环在火焰上烧红，以杀死残余的菌。培养：检查试管的棉塞是否塞紧，标签上的字是否清楚。然后置于28恒温箱中培养2448小时。3、酵母菌产气结果观察：观察小试管中是否有气泡产生及感官检验。 4、酵母菌形态的观察： 制片：取洁净的玻片一块，在其中央滴一小滴无菌水，用接种环以无菌操作的方式从固体斜面上挑取少量的酵母菌，与载玻片上的水滴混匀，涂成一薄层；取干净盖玻片一块，小心地将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，用手轻轻地压一下将气泡压去，再用滤纸吸去多余的菌液。 显微镜观察:将制好的酵母菌片置于显微镜下，先用低倍镜找到酵母菌，再转入高倍镜下仔细观察酵母菌的整体形态，出芽酵母菌的形态，菌体内的液泡及内含物.将光圈调小还可看到酵母菌体外的荚膜物质。绘制出你所看到的酵母菌形态结构图，要注明放大倍数及各部分的名称。五、实验结果记录： 1、酵母菌形态的观察结果记录：绘出你所看到的标本图，并注明菌名、各部位名称及放大倍数。2、记录酵母菌液体接种结果及结论。六、实验结果分析及问题讨论：实验四 微生物的死活鉴别及固体培养接种技术一、实验目的和要求： 1、掌握鉴别酵母菌死活的染色原理和操作方法。 2、掌握无菌操作技术及微生物固体接种培养技术。3、学会观察接种培养的结果。二、实验原理： 用稀释美兰染液可进行酵母菌死活的鉴别。美兰是一种弱氧化剂，氧化态时为兰色，还原态时呈无色。被染成兰色的为死菌，无色的为活菌。这是因为活细胞新陈代谢旺盛，具有还原能力，染液进入细胞后即被还原成无色，而死细胞无还原能力。但染液浓度过高或染色时间过久，超出了活细胞的承受能力，会使菌体死亡，从而影响实验结果的。三、实验材料和器材：1、菌种：马铃薯琼脂斜面培养1824小时的酵母菌 2、培养基及试剂：马铃薯液体培养基、马铃薯固体培养基、二甲苯、95乙醇、0.1%美兰染液、苯酚等 3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、浆糊等四、实验方法及步骤：1、固体斜面接种方法（见下图）：在酒精灯下无菌操作，将接种环伸入待接试管斜面的基部，缓慢地走之字图形地接种，然后放入28恒温培养箱中培养2448小时。2、酵母菌固体接种培养结果观察:：（包括菌落形状,色泽，质地，气味，透明度等）。3、酵母菌的死活鉴别：先滴一滴0.1%美兰染液于干净的载玻片中央，无菌操作取一环酵母菌与0.1%美兰染液混合均匀，染色30秒1分钟盖上盖玻片，用滤纸吸掉多余的染色液，镜检。五、实验结果记录： 1、记录酵母菌死活鉴别结果并解释原因。 2、记录酵母菌固体接种结果。六、实验结果分析及问题讨论：实验五利用血球计数板的微生物计数法一、实验目的和要求： 学习利用血球计数板对微生物进行计数的原理和方法。二、实验原理： 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法是将单细胞微生物的菌悬液或孢子悬液，注入血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下在进行计数的。由于计数室的容积是一定的，所以可根据显微镜下观察的微生物的数量计算出单位体积内的微生物总数。 血球计数扳的构造a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙)血球计数板计数网的分区和分格血球计数板的计数室如下图所示，其中央为计数室，通常有两种规格2516型或1625型.常用的为2516型，其长和宽各为1mm，盖上盖玻片后，其间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1立方毫米。细胞数（CFU/mL）=50000AB式中：A5个中方格中细胞总数B菌液的稀释倍数三、实验材料和器材: 1、菌种: 固体斜面培养1824小时酵母菌 2、培养基及试剂:马铃薯固体培养基、二甲苯、95乙醇、苯酚等 3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、血球计数板、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、圆塑料篓、长塑料篓、血红蛋白吸管、10mL塑料离心管等四、实验方法及步骤: 1、酵母菌菌悬液的计数和酵母菌菌悬液中出芽率的计数:取一块干净的血球计数板,在显微镜下用低倍镜找到中央计数室。上升镜筒,将盖玻片盖在计数室上。 用吸管吸取酵母菌菌悬液(先将菌液摇匀一下),将滴管在血球计数板和盖玻片之间的缝隙间靠一下,菌悬液即被吸入计数室内,用手轻压盖玻片,以免溶液过多而改变了计数室的体积,用滤纸吸取多余的菌液,静止一会,让菌体自然沉降并且稳定下来。 计数:分别统计五个中方格的酵母菌的数量和出芽的酵母菌数量.应取计数室对角线上的五个中方格或取计数室右上,右下,左上,左下,中央的五个中方格.压线的菌以取上不取下,取左不取右的菌计数. 计完后取下盖玻片,用蒸馏水洗净血球计数板,用滤纸吸干净水份后,盖上干净的盖玻片,再滴菌液,于显微镜下重复计数三次。五、实验结果记录及计算: 1、计数。 测定次数中 方 菌格编 数号第一次第二次1酵母菌出 芽2酵母菌出 芽 3酵母菌出 芽 4酵母菌出 芽 5酵母菌出 芽 五个中方格的总菌数酵母菌出 芽2、计算:每毫升菌液中含酵母菌的CFU（采用两位有效数字，及10的指数表示）。4、计算:每毫升菌液中含出芽的酵母菌的个数（同上）及出芽率。六、实验结果分析及问题讨论： 实验六 微生物大小的测量一、实验目的和要求： 了解测微尺的构造和原理，学习接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定。二、实验原理： 微生物细胞的大小是微生物形态特征之一。也是分类鉴定的依据之一。其大小的测量是在显微镜下用接目测微尺来测量。由于在目镜中观测到的是显微镜放大后的物像，又因为放大倍数不同时，目镜测微尺每格实际代表的长度也随之变化，因此目镜测微尺在使用前必须用标准物镜尺进行校正。 接目测微尺是一块圆形玻璃片,其中央尺等分成100格。 物镜测微尺又称标准尺，是一块中央刻有精确刻度的载玻片，放在载物台上使用的，专用于校正接目测微尺。常用的是0.01mm物镜测微尺。是将长1毫米的直线等分成100个小格，每格长度即为0.01mm(10微米)。三、实验材料和器皿： 1、菌种：固体斜面培养1824小时酵母菌。 2、培养基及试剂:马铃薯固体培养基、二甲苯、95乙醇等3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、物镜物镜测微尺、目镜测微尺、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓等四、实验方法及步骤： 1、校正目镜测微尺：将目镜头上的透镜旋下，把目镜测微尺裝入镜筒内，在显微镜里看到目镜测微尺的刻度。将物镜测微尺放在载物台上，有盖玻片的一面朝上，切勿放反了。调整光线后，先在低倍镜下找到物镜测微尺的尺子。然后转高倍镜观察到两把尺子，调节目镜测微尺，使两把尺的刻度线平行。再调节物镜测微尺，使目镜测微尺的一条刻度线与物镜测微尺上的一条刻度线重合，再寻找另一重合线，分别数出物镜测微尺及目镜测微尺的格数。以此计算在此放大倍数下目镜测微尺每一小格所代表的实际长度。例如：物镜测微尺的10格内含有目镜测微尺共45格，此物镜测微尺内有10小格，所以目镜测微尺每小格代表的实际长度10格10微米45格2.2微米。 2、测量微生物菌体的大小：将物镜测微尺取下，把自制的酵母菌水浸片放于载物台上，通过旋转目镜筒的方法测出酵母菌菌体的长和宽，测量5个酵母菌菌体（先数格数，后计算）。五、实验结果记录及计算： 1、校正目镜测微尺数据记录： 放大倍数：目镜测微尺的格数： 物镜测微尺的格数： 目镜测微尺每小格代表的实际长度（微米）2、结果记录：放大倍数：酵母菌编号酵母菌占目镜测微尺的格数计 算（微米）1长宽2长宽3长宽4长宽5长宽 3、总结：酵母菌的平均长度为 （微米）。平均宽度为 （微米）。 最大的酵母菌的长为 （微米）。其宽度为 （微米）。 最小的酵母菌的长为 （微米）。其宽度为 （微米）。六、实验结果分析及问题讨论：实验七 霉菌的湿室载片培养及根霉、曲霉、毛霉、青霉的形态观察一、实验目的和要求： 1、学习湿室载片培养的操作方法。 2、掌握根霉、毛霉、曲霉、青霉的形态结构及制片方法。3、观察根霉、毛霉、曲霉、青霉的细胞结构二、实验原理： 霉菌的结构在制片过程中易被破坏，因而影响观察，所以采用湿室载片培养法进行培养，此法便于将生长完好的霉菌菌落载片直接置于显微镜的低倍镜下观察。 霉菌的菌丝较粗大，细胞容易收缩变形，因此采用乳酸石炭酸美兰溶液作为介质进行制片。此溶液具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能保持较长时间，又有一定的染色能力。 通过观察掌握根霉的菌丝是无隔膜的，并且生有特殊的匍匐菌丝和假根，气生菌丝成簇生长，一般不分枝，顶端长有孢子囊。在高倍镜下仔细观察孢子囊的结构分为孢子囊梗，囊托，囊轴，囊衣，和孢子。根霉主要用于酿酒和生产各种有机酸。毛霉采用湿室载片培养法。其菌丝比根霉要细些，也是无隔膜的。菌丝的分枝有两个类型：一种为单轴式，即无分枝。另一种为假轴状分枝。菌丝顶端都生有球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸钙结晶，囊壁很薄，孢子成熟飞出后留下的残迹称为囊领。囊内有囊轴，形状不一。囊轴与孢子梗之间无囊托。毛霉的营养菌丝生长到一定时期能形成厚垣孢子，是一种休眠体。青霉的菌丝是有隔膜，为多细胞多核的霉菌。菌丝的首端形成扫帚状分枝，顶部着生分生孢子，分生孢子的结构由孢子梗、副枝、梗基、小梗、和孢子组成。青霉除用于食品工业外，还主要用于医药工业中。曲霉的菌丝与根霉、毛霉不同。营养菌丝具有隔膜，是多核多细胞的。营养菌丝的足细胞向上长出成束的气生菌丝，其顶端生有的孢子称为分生孢子。分生孢子的结构为：无隔膜的分生孢子梗、顶囊、初生梗、次生梗和孢子。幼年的分生孢子结构在高倍镜下可清楚地看见。三、实验材料和器皿： 1、菌种：根霉、毛霉、青霉、曲霉斜面培养菌种。 2、培养基及试剂：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、大米麦麸固体培养基、葡萄糖豆芽汁固体培养基、二甲苯、95乙醇、苯酚、乳酸石碳酸美蓝染液、琼脂粉等。 3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、湿室载片培养装置、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓等四、实验方法及步骤： 1、湿式载片培养准备工作（5套/人）： （1）准备：在培养皿底部先放一张滤纸，滤纸上放二块载玻片，盖好盖，用纸包扎好，经160干热灭菌3小时后。冷却后备用。 干热灭菌法：主要是指热空气灭菌，即把待灭菌的物体均匀地放在恒温干燥箱内，加热至160-170维持2小时即可达到灭菌目的（有水的物质，不可用此法）。 将包扎好的待灭菌物（培养皿，吸管，试管）放入干燥箱内，（注意不能放得太挤，以免妨碍空气流通，不得使器皿于与烘箱的内层地板直接接触）。关上门，接通电源，待温度上升至160-170时（注意勿使温度过高,超过170，器皿外的包扎纸、棉花会被烤焦燃烧），借调节器的自动控制，保持此温度2个小时，灭菌结束后，关闭电源，待温度降至60以下方可开门(否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂和包扎材料起火燃烧)，取出无菌器皿，待用。 如果是为了烘干玻璃器皿，温度为120持续30min即可。 用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。 （2）接种：在无菌操作条件下，先用滴管取加热溶解了的培养基滴加在载玻片上，冷却片刻使培养基凝固后，再用滴管吸取霉菌悬液滴至培养基上，然后用无菌水把培养皿内的滤纸打湿，以保持培养皿内有一定的湿度，盖上盖子，在培养皿的底座侧面贴上标签，写好班次和学号。 （3）培养：将接种的培养皿置于培养箱中于28恒温培养23天。 2、观察： （1）肉眼观察：打开培养皿盖，观察霉菌的菌落形态，气味，质地如何。、 （2）低倍镜观察：取出载玻片，用滤纸将载玻片底部的水擦拭干净，直接放在载物台上，用低倍镜仔细观察霉菌的整体形态绘图如下（并注明放大倍数）： （3）高倍镜观察：另取一块干净的载玻片，于其中央滴一滴乳酸石炭酸美兰染液，从菌落的边缘取少量带有孢子的菌丝放入染液中，轻轻挑开菌丝，盖上盖玻片，轻压一下除去气泡，用滤纸吸去多余的染液，用高倍镜观察根霉的菌丝结构和孢子结构绘图如下（并注明放大倍数）：五、实验结果记录： 一）根霉菌 1、肉眼观察结果： 2、绘出低倍镜观察根霉的整体形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 3、绘出高倍镜观察根霉的菌丝结构和孢子结构图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 二）毛霉菌1、肉眼观察毛霉的菌丝呈 色。特征是 。2、绘出低倍镜观察毛霉的整体形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。3、绘出高倍镜观察毛霉的形态结构图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 三）青霉菌1、肉眼观察青霉的菌落形态：菌丝为 。孢子为 。2、绘出低倍镜观察青霉的整体形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。3绘出高倍镜观察青霉的形态结构图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 四）曲霉菌1、肉眼观察曲霉的菌落：生长初期为 。生长后期为 。2、绘出低倍镜观察曲霉的整体形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。3、绘出高倍镜观察曲霉的形态结构图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。六、实验结果分析及问题讨论：实验八 放线菌的插片培养及形态观察一、实验目的和要求：1、学习放线菌的湿室插片培养的方法。2、熟悉放线菌的形态结构及应用。二、实验原理：放线菌是一类单细胞丝状的原核微生物。由菌丝和孢子组成。菌丝分为营养菌丝和气生菌丝两部分。气生菌丝的顶端分化成孢子丝。孢子丝和孢子随随种属不同而呈不同的形状和色泽，以此作为放线菌的分类依据。放线菌的菌丝很细，直径为0.21.2微米之间，无隔膜、分枝繁茂、成熟后呈不同的色泽。放线菌生长缓慢，菌丝分枝相互交错缠绕，形成的菌落有的质地致密干燥，有的粘着力不强为粉质结构。所以通常采用湿室插片培养方法，使放线菌的菌丝沿着培养基与盖玻片的交界处向盖玻片上生长蔓延并且附着在盖玻片上。待其生长成熟后取出盖玻片，经染色即可看到完整结构的放线菌菌落形态和菌丝、孢子丝、孢子的形态。三、实验材料和器材：1、菌种：放线菌斜面菌种。2、培养基及试剂：马铃薯琼脂固体培养基、二甲苯、95乙醇、苯酚、琼脂粉、高氏一号琼脂培养基、吕氏美兰染色液、香柏油等。3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布等四、实验方法及步骤：1、准备工作：准备一套培养皿，包扎好后于160灭菌2小时，灭菌后冷却后备用。2、接种培养：在无菌操作条件下，将经加热溶解后的培养基冷至50后倒入培养皿中（大约2030mL/每皿），等至完全冷却后的培养基，在将放线菌的菌悬液加至培养基上，然后将盖玻片斜插培养基中（如下图所示），置于28恒温培育箱中培养3天左右。3、肉眼观察放线菌的菌落。4、低倍镜观察放线菌的菌落形态。5、高倍镜观察放线菌的的气生菌丝、孢子丝和孢子形态。五、实验结果记录：1、肉眼观察：放线菌的菌落呈 色， 气味， 质地为 。2、绘出高倍镜观察放线菌的菌落形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。3、绘出油倍镜观察放线菌的气生菌丝、孢子丝和孢子形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。六、实验结果分析及问题讨论：实验九 细菌的简单染色及显微镜油镜的使用、保养、细菌的革兰氏染色一、实验目的与要求：1、掌握油镜的使用保养方法。2、掌握细菌的涂片和简单染色技术。3、掌握细菌的革兰氏染色的原理和方法。二、实验原理：细菌个体很小，在高倍镜下也看不清楚，需放大一千倍以上才能观察其形态，故要使用油镜头观察。油镜头是在使用时，在物镜与标本之间加一种折射率与玻璃折射率几乎相等的香柏油作为介质，以达到所需的放大倍数。细菌细胞小而透明，含水量较高，在油镜下观察细胞几乎与背景无反差，所以观察细菌的形态结构，必须对它们进行染色，以便于刚观察。因细菌的蛋白质等电点较低，其生长在碱性和中性溶液中细胞带负电荷，所以通常用碱性染料（如美兰、结晶紫、复红、孔雀绿）使其细胞着色。革兰氏染色法可将细菌氏分别革兰氏阳性菌（G）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色是使用几种不同的染料对细菌进行染色。先进草酸结晶紫初染，次经碘液媒染，再用95%酒精脱色处理，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持结晶紫碘复合物的颜色而不被酒精脱色，则菌体呈兰紫色，为革兰氏阳性菌。如果细菌体内的结晶紫碘复合物的颜色被酒精脱去，而复染上蕃红的颜色，则菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。此染色法之所以能将细菌区为G和G两类，是由于这两类菌的细胞壁成分不同所决定的。G菌的细胞壁较薄，含有的脂类物质较高，肽聚糖的含量较低，酒精处理时溶解了脂类物质，使细胞壁穿孔，通透性增大，在水洗时将细胞内原有的结晶紫碘复合物冲走而脱色，再用蕃红复染就被染成了红色。G菌由于细胞壁厚，其中含有肽聚糖的量高，脂类含量低，用酒精处理时，使细胞壁脱水，肽聚糖层的孔眼缩小，通透性降低，结晶紫碘复合物被色在细胞内，而不会在水洗时被冲走，所以在复染时蕃红染液进不去，菌体最终仍呈兰紫色。三、实验材料和器材：1、菌种：白葡萄球菌斜面菌种、枯草杆菌斜面菌种、大肠杆菌斜面菌种均为培养18-24小时。2、培养基及试剂：营养琼脂培养基、二甲苯、95乙醇、苯酚、琼脂粉、香柏油、吕氏美兰染色液、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球等四、实验方法及步骤：一）细菌的简单染色及显微镜油镜的使用、保养1、涂片：于干净的载玻片中央滴一小滴无菌水，在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌与无菌水充分混匀，涂成极薄的菌膜。（菌要挑少些，涂片要薄些，否则不易观察）2、干燥：涂片后置室温自然干燥。3、固定：手持载玻片的一端，有菌膜的一面朝上，通过酒精灯火焰上方34次。（用手背皮肤接触涂片反面，以不烫手为宜）以使细菌粘附在载玻片上更牢固。4、染色：于菌膜上滴加吕氏美兰染液（以盖满菌膜为准），染色12分钟。5、水洗：倾去染色液，用洗瓶中的蒸馏水自玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水无色为止（切勿使水直冲菌膜处。）6、干燥：自然干燥或用滤纸轻轻盖在菌膜部位以吸去水份（切勿擦去菌体）。7、镜检：先在低倍镜下找到菌斑。将显微镜筒向上移，再于菌斑处滴1滴香柏油，再将油镜头轻轻移下与载玻片接触。然后用目镜观察。此时镜筒仅仅稍微向上移动，看到菌斑后，在稍微调节细螺旋，即可看到细菌的形态。8、油镜头的清洁：观察完毕后，取下油镜头，先用擦镜纸擦去香柏油，在用滴有二甲苯的擦镜纸擦净镜头，最后用干净的擦镜纸再擦净镜头。做好仪器使用登记即可。二）细菌的革兰氏染色1、制片：取二块干净的载玻片，各靠一小滴无菌水，以无菌操作规程分别挑取大肠杆菌和枯草杆菌少量，涂布于对应的载玻片上与无菌水混匀，涂成极薄的菌膜。自然干燥后再通过酒精灯进行热固定。2、初染：于菌膜上滴加结晶紫染液，以盖满菌膜为宜，染色1-2 min后倾去染液，用蒸馏水轻轻冲洗至流下无色为止，甩去载玻片上的残余水。3、媒染：滴加碘液染色1-2min，用蒸馏水冲洗干净。4、脱色：滴加95%酒精液脱色30秒钟（准确计时），用蒸馏水冲洗干净。5、复染：滴加蕃红液染色1-2min，用蒸馏水冲洗干净最后自然干燥。6、镜检： 五、实验结果记录：1、简单染色结果记录绘出你所观察到的细菌形态图，并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。2、革兰氏染色结果记录:1、在显微镜油镜头下观察大肠杆菌被染成 色，枯草杆菌被染成 色。2、结论：大肠杆菌属于革兰氏 菌，枯草杆菌属于革兰氏 菌。六、实验结果分析及问题讨论：实验十 利用毛霉有氧发酵生产豆制品一、实验目的与要求：1、学习利用毛霉发酵生产豆制品的原理和工艺过程。2、观察豆制品发酵过程中的变化。二、实验原理：毛霉分布很广，常见的主要有高大毛霉、总状毛霉、鲁氏毛霉等。它们都能产生蛋白质水解酶、淀粉水解酶、脂肪水解酶。也就是分解大豆的能力很强。即在煮熟后冷却的黄豆上接种毛霉，经过前发酵培养和繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，然后在长时间后发酵中与黄豆调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使黄豆蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香的特色。三、实验材料、仪器及试剂：1、菌种：毛霉菌斜面菌种2、培养基及试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、二甲苯、95乙醇、苯酚、琼脂粉、乳酸石碳酸美蓝染色液、黄豆、白酒、食盐、五香粉、姜、辣椒、保鲜