miR-101对乳腺癌患者的诊断及对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响.pdf

10 Verma A,Singh A,Singh MP,et al.EZH2-H3K27me3 me-diated KRT14 upregulation promotes TNBC peritoneal me-tastasisJ.Nat Commun,2022,13(1):7344.11 郭 红 艳,徐 亚 茹,李 耕 慧,等.长 链 非 编 码 RNA Linc00673 过表达对胃癌 MGC-803 细胞增殖与凋亡的影响J.中国应用生理学杂志,2022,38(1):53-58.12 Xue P,Huang S,Han X,et al.Exosomal miR-101-3p and miR-423-5p inhibit medulloblastoma tumorigenesis through targeting FOXP4 and EZH2J.Cell Death Differ,2022,29(1):82-95.13 Zhang Y,Li R,Ding X,et al.Long noncoding RNA SNHG6 promotes oesophageal squamous cell carcinoma by downreg-ulating the miR-101-3p/EZH2 pathwayJ.Biochem Mol Toxicol,2022,36(2):22959.【文章编号】1006-6233(2023)08-1240-06miR-101 对乳腺癌患者的诊断及对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响宋雅琪,张志生,孔令霞,刘进宇(河北北方学院附属第一医院乳腺外科,河北张家口 075000)【摘要】目的:探讨血清 miR-101 在乳腺癌患者中的表达和临床特征,以及对 MCF-7 细胞自噬和凋亡的影响。方法:选择 2021 年 6 月至 2022 年 10 月收治的 96 名乳腺癌患者作为观察组,41 例乳腺良性增生患者作为良性组,35 名健康体检者作为正常对照组。qRT-PCR 检测 3 组血清 miR-101 的表达水平;比较乳腺癌患者不同临床病理特征血清 miRNA-101 表达水平;ROC 曲线分析 miR-101 的诊断价值。应用 miR-101 mimic 试剂对乳腺癌细胞株(MCF-7)进行转染,qPCR 法检测 MCF-7 和正常乳腺细胞株(HBL-100)miR-101 的表达;CCK-8 法检测各组细胞的增殖;qPCR 法和 Western blot 法检测细胞自噬和凋亡基因和蛋白的表达;流式细胞术检测各组凋亡率。结果:观察组 miRNA-145 相对表达量(n=96,0.27)显著低于良性组(n=41,0.63)和对照组(n=35,1.00),差异有统计学意义(P0.01)。血清 miRNA-101 的表达在淋巴结转移、分化程度、肿瘤直径和 TNM 分期差异具有显著性(P 0.01)。ROC 曲线分析显示,在 3 组对比中,曲线下面积分别为 0.723(95%CI:0.813-0.924)和 0.875(95%CI:0.8350.981)。CCK-8、qPCR 和 Western blot 结果显示,miR-101 过表达可抑制 MCF-7 细胞增殖,显著增加 MCF-7 细胞 BAX 的基因和蛋白表达(P0.01),降低 BCL-2、LC3B 和 Beclin-1 基因和蛋白的表达(P0.01),增加 MCF-7 细胞凋亡率。结论:在乳腺癌患者中,血清 miR-101 的表达水平显著降低,可能成为潜在的乳腺癌的诊断指标。此外,miR-101 过表达具有抑制 MCF-7 乳腺癌细胞增殖、抑制自噬,并促进细胞凋亡的作用。这些结果为进一步研究 miR-101 在乳腺癌发生和发展中的机制提供了重要线索,为乳腺癌的早期诊断和治疗提供了新的策略。【关键词】乳腺癌;自噬;凋亡【文献标识码】A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2023.08.02The Effect of miR-101 on the Diagnosis of Breast Cancer Patients and Autophagy and Apoptosis of Breast Cancer CellsSONG Yaqi,ZHANG Zhisheng,KONG Lingxia,et al(The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Hebei Zhangjiakou 075000,China)【Abstract】Objective:To investigate the expression and clinical characteristics of serum miR-101 in patients with breast cancer and its effects on autophagy and apoptosis of MCF-7 cells.Methods:A total of 96 patients with breast cancer treated from June 2021 to October 2022 were selected as the observation group,41 patients with benign breast hyperplasia were selected as the benign group,and 35 healthy subjects were select-ed as the normal control group.The expression level of miR-101 in serum of the 3 groups was detected by 0421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】河北省医学科学研究课题,(编号:20231418)【通讯作者】张志生qRT-PCR.The expression levels of serum miRNA-101 in different clinicopathological features of breast canc-er patients were compared.The diagnostic value of miR-101 was analyzed by ROC curve.Breast cancer cell line(MCF-7)was transfected with miR-101 mimic reagent.The expression of miR-101 in MCF-7 and nor-mal breast cell line(HBL-100)was detected by qPCR.The cell proliferation was detected by CCK-8 meth-od.The expressions of autophagy and apoptosis genes and proteins were detected by qPCR and Western blot.The apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry.Results:The relative expression of miRNA-145 in observation group(n=96,0.27)was significantly lower than that in benign group(n=41,0.63)and control group(n=35,1.00),the difference was statistically significant(P0.01).The expression of serum miRNA-101 was significantly different in lymph node metastasis,differentiation degree,tumor diameter and TNM stage(P0.01).ROC curve analysis showed that the area under the curve was 0.723(95%CI:0.813-0.924)and 0.875(95%CI:0.835-0.981)in the three groups of comparison,respectively.The results of CCK-8,qPCR and Western blot showed that over-expression of miR-101 inhibited the proliferation of MCF-7 cells,significantly increased the gene and protein expression of BAX in MCF-7 cells(P0.01),and de-creased the gene and protein expression of BCL-2,LC3B and Beclin-1 in McF-7 cells(P0.05)。纳入标准:全部患者均签署了知情同意书;所有观察组乳腺癌患者经组织病理学诊断;全部病例为首次确诊,未接受过手术、放化疗和生物学治疗,未合并其它原位肿瘤;良性组均经彩超或组织病理学证实;正常对照组无乳腺相关疾病。排除标准:妊娠及哺乳妇女;自身免疫疾病;临床资料不完整的研究对象。1.2 实验材料:清晨收集 3 组外周静脉血中抽取 5mL到试管中,在 4 离心机中进行离心,提取上层血清,将血清放入无 RNA 酶的 EP 管中,EP 管放入-80的冰箱中进行保存。乳腺癌细胞株 MCF-7 及正常乳腺细胞株 HBL-100,购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。1640 培养基和青链霉素购于美国 Sigma公司;胎牛血清购于 GIBCO 公司;Trizol 购于中国上海翌圣生物有限公司;miR-101 mimics、mimics control 购自上海吉玛制药公司;Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒购于江苏凯基生物公司;CCK-8 试剂盒购于日本同1421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 仁化学研究所;2RealStar Fast SYBR qPCR Mix 和反转录试剂盒购于北京康润公司;BAX、BCL-2、LC3B、Beclin-1 一抗兔抗购于美国 Sigma 公司。1.3 方 法1.3.1 细胞培养及分组:快速解冻 MCF-和 HBL-100细胞,离心去除上清,然后在含有 1%青霉素/链霉素/庆大霉素的 90%培养基和 10%血清中重悬。将细胞以 1105 cells/mL 的浓度接种于 25cm2的烧瓶中,在37、5%CO2的培养箱中培养至细胞融合度达到 80%。用 0.25%胰蛋白酶-edta 传代,1500rpm 离心;每 2 天更换一次培养基。细胞分组为空白对照组,miR-101 空载组(阴性对照组),miR-101 转染组。1.3.2 荧光定量(qRT-PCR):总 RNA 用 Trizol 提取,将提取的 RNA 提取物反转录为 cDNA。进行实时定量 PCR。用于实时定量 PCR 的具体 miR-101 引物序列如下:R-5-TACAGTACTGTGATAACTGAA-3,F-5-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3。引物由上海生工生物有限公司合成。使用 2-Ct方法测量 miRNA-101 相对于 U6 的表达。U6 引物序列如下:R-5-CGCTTCG-GCAGCACATATAC-3,F-5-TTCACGAATTTGCGT-GTCAT-3。1.3.3CCK-8 检测细胞增殖:根据使用说明,使用CCK-8 试剂测定细胞增殖,将细胞以 5104个细胞/孔接种到 96 孔板中。在 24h、48h、72h 和 96h 后,用CCK-8 试剂处理细胞并孵育 2h。使用 Bio-Rad 酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在 450nm 波长下测量吸光度。1.3.4miR-has-miRNA-145 表达载体构建及转染:将 MCF-7 和 HBL-100 细胞接种在 6 孔板中,根据制造商提供的说明,使用 Lipofectamine 2000 转染试剂将miR-101mimics 和 miR-101minics control 转染到细胞中,培养 48h 后,收集细胞用于分析。1.3.5流式细胞术检测细胞凋亡:使用 Annexin-V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞。获取处理后的 1105细胞,在避光下用 Annexin-V-FITC/PI 孵育5min 用 FACSCalibur 流式细胞仪分析凋亡细胞。1.3.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot):使用 RIPA 裂解液提取总蛋白。BCA 测定蛋白浓度,进行凝胶电泳,凝胶随后转移到 PVDF 膜上,一抗 4 过夜,二抗孵育 2h。采用 ECL 测量信号。1.3.7 数据分析:所有数据分析均使用 SPSS24.0 软件。数据采用(xs)表示,使用单因素方差分析,LSD检验确认各组数据之间的差异性,计数资料以百分率表示,血清 miR-101 在鉴别观察组与良性组及健康对照组的临床效能采用 ROC 曲线评估,P0.05 表示差异有统计学意义。2 结 果2.1 3 组患者血清 miRNA-101 表达比较:PCR 结果显示 96 例观察组和 41 例良性组 miRNA-101 的相对表达量分别为 0.63 和 0.27,与 35 例对照组(1.00)相比,差异具有统计学意义。(P0.05),血清 miRNA-101 的表达在淋巴结转移、分化程度、肿瘤直径和 TNM 分期差异具有显著性(P0.01),见表 1。表 1 乳腺癌患者血清 miRNA-101 表达与临床病理特征的关系(xs)项目临床病理特征例数(n=96)miR-101 表达水平tP年龄50440.340.050.390.48850520.330.06绝经是570.350.070.340.539否390.340.08病理类型浸润性导管癌280.310.060.360.365浸润性小叶癌300.330.07髓样癌380.320.06肿瘤直径(cm)2650.290.078.9902310.370.062421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 淋巴结转移有630.210.0610.230无330.370.07分化程度高分化680.230.089.570中低分化280.380.07TNM 分期/期310.390.069.880/期650.240.08图 1 健康对照组、良性组和观察组血清 miRNA-101 的表达注:与对照组相比,P0.05;P0.012.3 血清 miRNA-101 评估乳腺癌的受试者工作特征(ROC)曲线分析显示:血清 miRNA-101 鉴别观察组和良性组的曲线下面积为 0.723(95%CI:0.813-0.924),截断值为 0.375 时,敏感度和特异度分别为 90.24%和 89.25%(图 2A)。血清中 miRNA-101 表达水平观察组和对照组的曲线下面积为 0.875(95%CI:0.8350.981),截断值为 0.325 时,敏感度和特异度分别为 94.55%和 96.88%(图 2B)。图 2 血清 miRNA-101 的诊断效能A.血清 miRNA-101 表达水平在鉴别观察组和良性组的临床效能;B.血清 miRNA-101 表达水平在鉴别观察组和对照组的临床效能2.4 miRNA-101 的表达与过表达载体稳定细胞系的构建:与人乳腺细胞(HBL-100)相比,乳腺癌细胞(MCF-7)miRNA-101 的表达显着降低(P0.01)(图3A)。构建 miRNA-101 过表达载体,qPCR 数据结果显示(图 3B),稳定过表达 miRNA-101 的 MCF-7 细胞中,与空白对照组和 miR-101 空载组相比,miR-101转染组 miR-101 的表达量显著升高(P0.05)。图 3miRNA-101 在 MCF-7 和 HBL-100 细胞表达及miRNA-101 过表达载体稳定 MCF-7 细胞系的构建A:MCF-7 和 HBL-100 细胞中 miRNA-101 的表达;B:过表达 miRNA-101 质粒的 MCF-7 细胞系的构建注:与对照组相比,P0.05;P0.012.5 CCK-8 法检测不同组之间细胞增殖:通过 CCK-8 试验检测 MCF-7 细胞增殖能力的改变。如图 4 所示,同 miR-101 空白对照组和 miR-145 空载组细胞相比,miR-145 转染组细胞增殖能力明显受到抑制(P0.05)。3421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 图 4 miR-101 转染对 MCF-7 细胞增殖能力的影响2.6miRNA-101 对 MCF-7 细胞自噬和凋亡相关mRNA 的影响:由图 5A 可知,与对照组相比,miRNA-101 转染组促凋亡基因 BAX 极显著上升(P0.01),抗凋亡基因 BCL-2 表达极显著降低(P0.05)。由图 5B 可知,与对照组相比,miRNA-101 转染组自噬相关基因LC3B 和 Beclin-1 表达极显著降低(P0.05)。图 5 miRNA-101 对 MCF-7 细胞自噬和凋亡相关 mRNA的影响A:miRNA-101 过表达对凋亡相关基因的表达;B:miRNA-101 过表达对自噬相关基因的表达注:与对照组相比,P0.05;P0.012.7 miRNA-101 对 MCF-7 细胞自噬和凋亡相关蛋白及凋亡率的影响:miR-101 过表达对 MCF-7 细胞自噬和凋亡影响,与对照组相比,miR-101 转染组BAX 蛋白的表达极显著增加(P0.01),BCL-2 蛋白的表达极显著降低(P0.05),同时细胞凋亡率极显著上升(图6A,C)。与对照组相比,miR-101 转染组 LC3B 和 Be-clin-1 蛋白表达极显著下降(P0.05)。图 6 miRNA-101 对 MCF-7 自噬和凋亡相关蛋白及细胞凋亡影响A:miRNA-101 过表达对 MCF-7 细胞凋亡相关蛋白表达的影响;B:miRNA-101 过表达对 MCF-7 细胞自噬相关蛋白表达的影响;C:miRNA-101 过表达对 MCF-7 细胞凋亡率的影响注:与对照组相比,P0.05;P0.013 讨 论乳腺癌已成为严重危害人类生命的恶性肿瘤之一,其发生与患者年龄、职业和遗传等因素密切相关5。miRNA 血清中的表达较为稳定,其不同种类的miRNA 在乳腺癌患者血清中的表达存在差异,这种miRNA 表达水平的差异使得 miRNA 成为诊断乳腺癌的血清学标志物的基础。miR-101 属于肿瘤抑制因子,在喉部鳞状细胞癌、神经胶质瘤和骨肉瘤等显著降低68。本研究发现 miR-101 在乳腺癌中同样行使抑癌基因的功能,观察组患者血清 miRNA-101 的表达量显著高于良性增生组和健康对照组。ROC 曲线分析表明,miRNA-101 可作为乳腺癌早期诊断标志物,对其临床应用有较高的价值。且 miRNA-101 在乳腺癌患者血清中的表达水平与淋巴结转移、分化程度、肿瘤直径和 TNM 分期有关。表明 miRNA 具有高度的可检测性及稳定的特点,miRNAs 与疾病的早期诊断密切相关。自噬通常被称为巨自噬,是真核细胞降解底物的主要机制。细胞自噬在演化过程中表现出高度的保守性,其发生和发展受许多与自噬相关的基因控制。miR-101 在自噬调节中作为一种抑癌 miRNA,可抑制肿瘤的形成。Frankel 等研究发现 miR-101 能显著降低 MCF-7 乳腺癌细胞的基础自噬通量,同时还可抑制由依托泊苷(etoposide)和雷帕霉素介导的细胞自噬9。本研究结果显示,miR-101 过表达可显著降低自噬相关 LC3B 和 Beclin-1 基因和蛋白的表达,表明miR-101 可抑制 MCF-7 细胞自噬的发生,符合前人研究结果。4421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 细胞的增殖是生物最主要的生命特征,而细胞的增殖是通过分裂来完成,通过细胞分裂而形成单细胞个体10。细胞凋亡,又叫程序性细胞死亡。在器官组织的生长发育、新陈代谢、免疫和异常细胞消除过程发挥着重要的作用11。miRNA 与细胞增殖和凋亡关系密切,例如过表达 miRNA-30b 可靶向 ITGB3 抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭,并促使其凋亡12。过表达miR-558 可靶向 CD155 促进乳腺癌细胞的凋亡13。在本研究中 miR-101 在 MCF-7 细胞中的表达明显低于 HBL-100 细胞,且细胞增殖实验表明过表达 miR-101 随着时间的推移可显著抑制 MCF-7 细胞的增殖,过表达 miR-101 可显著增加 MCF-7 细胞 BAX/BCL-2 蛋白和基因的表达,细胞凋亡率增加。上述结果表明 miR-101 过表达可显著抑制 MCF-7 细胞的生长并诱导细胞凋亡。综上所述,在乳腺癌 MCF-7 细胞中,过表达 miR-101 可显著抑制 MCF-7 细胞增殖,抑制细胞自噬,促进其凋亡。但有关 miRNA-101 在乳腺癌临床治疗的价值和抗肿瘤机制仍需更深入研究。【参考文献】1 Guo F,Kuo YF,Shih YCT,Giordano SH,Berenson AB.Trends in breast cancer mortality by stage at diagnosis a-mong young women in the United StatesJ.Cancer,2018,124(17):3500-3509.2 Zheng WB,Zou Y,He JJ,et al.Global profiling of lncRNAs-miRNAs-mRNAs reveals differential expression of coding genes and non-coding RNAs in the lung of beagle dogs at different stages of Toxocara canis infectionJ.Int Parasitol,2021,51(1):49-61.3 Hussen BM,Salihi A,Abdullah ST,et al.Signaling pathways modulated by miRNAs in breast cancer angiogenesis and new therapeuticsJ.Pathol Res Pract,2022,230:153764.4 Iorio MV,Ferracin M,Liu CG,et al.MicroRNA gene expres-sion deregulation in human breast cancerJ.Cancer Res,2005,65(16):7065-7070.5Coughlin SS.Epidemiology of breast cancer in womenJ.Adv Exp Med Biol,2019,1152:9-29.6 Wu K,Jiang Y,Zhou W,et al.Long Noncoding RNA RC3H2 facilitates cell proliferation and invasion by targeting microR-NA-101-3p/EZH2 axis in OSCCJ.Mol Ther Nucleic Acids,2020,20:97-110.7 Wang Z,He R,Xia H,Wei Y,Wu S.MicroRNA-101 has a suppressive role in osteosarcoma cells through the targeting of c-FOSJ.Retraction of Exp Ther Med,2016,11(4):1293-1299.8 Xue P,Huang S,Han X,et al.Exosomal miR-101-3p and miR-423-5p inhibit medulloblastoma tumorigenesis through targeting FOXP4 and EZH2J.Cell Death Differ,2022,29(1):82-95.9 Frankel LB,Wen J,Lees M,et al.microRNA-101 is a potent inhibitor of autophagyJ.EMBO,2011,30(22):4628-4641.10 Jia H,Wu D,Zhang Z,Li S.TCF3-activated FAM201A en-hances cell proliferation and invasion via miR-186-5p/TNKS1BP1 axis in triple-negative breast cancerJ.Pub-lished correction appears in Bioorg Chem,2021,110:104726.11 Wu Q,Li Q,Zhu W,Zhang X,Li H.Epsin 3 potentiates the NF-B signaling pathway to regulate apoptosis in breast cancerJ.Mol Med Rep,2022,25(1):15.12钟科,邓天芝,黄大翠.miRNA-30b 调控 ITGB3 表达促进乳腺癌细胞凋亡J.中国肿瘤临床,2021,48(15):761-766.13 李冰,邹晓明,董长城,等.miR-558 靶向 CD155 调控乳腺癌细胞 MCF7 的凋亡研究J.中国现代普通外科进展,2021,24(7):510-513.【文章编号】1006-6233(2023)08-1245-08CircITGB6 调节 miR-542-3p/PCNA 轴对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响及其机制廖圣银,蔡丽芳,游梦星,肖琳琳,谢雪花,黄伟明,林栖,黄丽斌,何丽梅(福建省莆田市第一医院肿瘤内科,福建莆田 351100)【摘要】目的:探讨环状 RNA(Circ)ITGB6 调节微小 RNA(miR)-542-3p/增殖细胞核抗原(PC-NA)轴对卵巢癌(OC)细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及其机制。方法:qRT-PCR 检测 OC 组织及正常卵巢组织、SKOV3、SKOV3/DDP、正常卵巢上皮细胞系(IOSE-80)中 CircITGB6、miR-542-3p、PCNA mRNA 表达水平;SKOV3/DDP 设置为对照组(不作处理)、干扰(si CircITGB6)组(转染 si CircITGB6)、5421 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】福建省莆田市科技计划项目,(编号:2020SY006)