质粒的碱裂解法提取及定量分析.ppt

质粒的碱裂解法提取及定量质粒的碱裂解法提取及定量分析分析 分组：两人一组分组：两人一组实验报告：周一交给熊云霞实验报告：周一交给熊云霞老师老师 608室室v掌握碱裂解法小量提取质粒掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理和的原理和方法方法 目的质粒：目的质粒：EGFP/Pet-28a重组质粒重组质粒 v掌握质粒掌握质粒DNA的定量及纯度检测方法的定量及纯度检测方法一、实验目的一、实验目的v质粒是染色体外的质粒是染色体外的DNA分子，大小可为分子，大小可为1kb到到200kb。v大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。因子。v其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。赖于宿主编码的蛋白和酶。二、实验原理二、实验原理二、实验原理二、实验原理v质粒质粒DNA提取的关键是提取的关键是要与细菌染色质要与细菌染色质DNA分分开开。v常用的提取方法有常用的提取方法有:煮沸法、碱裂解法、去污剂煮沸法、碱裂解法、去污剂法、有机溶剂法和溶菌酶法法、有机溶剂法和溶菌酶法等等v不同方法各有利弊，应根据不同质粒的性质、不不同方法各有利弊，应根据不同质粒的性质、不同宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综同宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合加以选择。合加以选择。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒v最为常用的质粒提取方法，因为它对细菌的最为常用的质粒提取方法，因为它对细菌的裂解完全，对染色质裂解完全，对染色质DNA和蛋白质的变性充和蛋白质的变性充分，因而所提取的质粒分，因而所提取的质粒DNA产量高、纯度高产量高、纯度高。v但如果碱变性时间过长，有可能会导致质粒但如果碱变性时间过长，有可能会导致质粒DNA变性，导致随后的内切酶酶切困难。变性，导致随后的内切酶酶切困难。碱裂解法的主要原理碱裂解法的主要原理 基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的的变性与复性的 差异而达到分离目的。差异而达到分离目的。染色体染色体DNA：氢键断裂，氢键断裂，变变性。性。质粒质粒DNA：大部分氢键断裂，大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离条互补链不会完全分离。（不完全变性）（不完全变性）质粒质粒DNA：复性，复性，溶于溶液中溶于溶液中染色体染色体DNA：不能复性；不能复性；形成形成缠连的网状结构。缠连的网状结构。pH=12.6（碱性）（碱性）NaAc溶液溶液（pH4.8）pH=中性中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质、蛋白质-SDS复合物等一复合物等一起沉淀下来起沉淀下来离心离心质粒质粒DNA定量测定原理定量测定原理利用核酸在利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性处有紫外吸收的特性紫外分光光度计紫外分光光度计三、实验材料三、实验材料1、实验器材：、实验器材：v冷冻离心机、水浴锅、恒温摇床、紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、恒温摇床、紫外分光光度计、石英杯、广口瓶、盐水瓶、已灭菌的微量移液器、石英杯、广口瓶、盐水瓶、已灭菌的微量移液器、玻璃仪器以及塑料离心管、玻璃仪器以及塑料离心管、EP管、枪头等。管、枪头等。u溶液溶液P1（细菌悬浮液）（细菌悬浮液）u溶液溶液P2（裂解液）（裂解液）u溶液溶液P3（中和液）（中和液）u去蛋白液去蛋白液PDu漂洗液漂洗液PWu洗脱液洗脱液EBuRNase A(10mg/ml)uDNA吸附柱吸附柱u平衡液平衡液BLu收集管收集管2、质粒小量提取试剂盒的组成：、质粒小量提取试剂盒的组成：溶液溶液P1：50 mmol/L葡萄糖葡萄糖10 mmol/LEDTA25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克毫克/毫升溶菌酶毫升溶菌酶溶液溶液P2：200 mmol/L NaOH 1%SDS溶液溶液P3：3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液溶液四、实验步骤四、实验步骤1.取菌液于取菌液于1.5 mL的的EP管中，管中，10000 rpm离心离心1 min，弃上清，弃上清，重复操作重复操作3次，收集菌体沉淀。（次，收集菌体沉淀。（菌液体积菌液体积 4mL每组，每班每组，每班100mL）2.用用250 L溶液溶液P1重悬菌体沉淀，枪头吹打重悬菌体，室温静重悬菌体沉淀，枪头吹打重悬菌体，室温静置置2-3 min。3.轻柔加入轻柔加入250 L溶液溶液P2，轻轻上下颠倒混匀，轻轻上下颠倒混匀4-6次，使菌体次，使菌体充分裂解，室温放置充分裂解，室温放置3 min，直至溶液呈清亮，并有黏性。，直至溶液呈清亮，并有黏性。注：注：切勿在涡旋仪上剧烈震荡。切勿在涡旋仪上剧烈震荡。4.加入溶液加入溶液P3 350 L，温和颠倒混匀，温和颠倒混匀4-6次。室温放置次。室温放置5 min，12000 rpm离心离心10 min，小心吸取上清至吸附柱中。，小心吸取上清至吸附柱中。注：注：切勿吸到蛋白沉淀。切勿吸到蛋白沉淀。四、实验步骤四、实验步骤5.室温，室温，10000 rpm离心离心1 min，弃收集管中滤过液。加入，弃收集管中滤过液。加入500 L 去蛋去蛋白液于吸附柱中，白液于吸附柱中，10000 rpm离心离心1 min，弃收集管中废液。，弃收集管中废液。6.加入加入750 L 漂洗液于吸附柱中，静置漂洗液于吸附柱中，静置1 min，10000 rpm离心离心1 min，弃收集管中废液。，弃收集管中废液。7.重复步骤重复步骤6一次。一次。8.10000 rpm空离心空离心5 min，尽量除去乙醇。，尽量除去乙醇。9.取出吸附柱，将其套入一个干净的取出吸附柱，将其套入一个干净的1.5 mL EP管中，在硅基脂膜中管中，在硅基脂膜中央部位加入央部位加入60 L，70 C预热的洗脱液，室温放置预热的洗脱液，室温放置2 min，12000 rpm离心离心1 min。10.丢弃吸附柱，丢弃吸附柱，EP管溶液中含有目的的质粒管溶液中含有目的的质粒DNA，置于，置于4 C或或-20 C保存。保存。11.紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定DNA含量。含量。吸附柱平衡：吸附柱平衡：在使用吸附柱前，先将吸附柱放入收集管中，加在使用吸附柱前，先将吸附柱放入收集管中，加500L平平衡液衡液BL，12000 rpm离心离心1 min，弃收集管中废液。，弃收集管中废液。1.质粒浓度测定：取质粒浓度测定：取50L，蒸馏水稀释到，蒸馏水稀释到2 mL，混合均匀，混合均匀2.检测检测260 nm和和280 nm的紫外吸光度。的紫外吸光度。紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定DNA含量含量DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0DNA或或RNA的纯度判定的纯度判定dsDNA含量（含量（g/mL)=50A260稀释倍数稀释倍数 五、注意事项五、注意事项v所有器具必须严格清洗，最后用双蒸水冲洗所有器具必须严格清洗，最后用双蒸水冲洗3次，凡可次，凡可以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌，防以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌，防止外源性核酸酶对止外源性核酸酶对DNA的降解以及其它杂质的污染。的降解以及其它杂质的污染。v收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。体在悬浮液中充分悬浮。v溶液溶液1 在用前加入在用前加入RNase A（实验室已加入实验室已加入），并置于），并置于4 C保存，现用现取。保存，现用现取。五、注意事项五、注意事项v在在碱碱裂裂解解提提质质粒粒的的方方法法中中，关关键键之之一一是是加加入入溶溶液液2的的时时机机，这这决决定定了了DNA变变性性与与复复性性的的时时间间。既既要要使使溶溶液液2与与染染色色体体DNA充充分分作作用用使使之之变变性性，又又要要保保证证质质粒粒DNA不会因作用时间过久而发生不可逆的变性。不会因作用时间过久而发生不可逆的变性。v若若质质粒粒变变性性过过度度，将将引引起起提提取取效效率率下下降降、内内切切酶酶切切割割困困难难等等一一系系列列问问题题。因因此此，加加入入溶溶液液2切切忌忌剧剧烈烈震震荡荡，时间不应超过时间不应超过5min。v加加溶溶液液3离离心心后后，倘倘若若上上清清中中还还有有微微小小白白色色沉沉淀淀，可可再次离心后取上清。再次离心后取上清。问题与讨论问题与讨论1.质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？质粒的质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？质粒的基本性质有哪些？基本性质有哪些？2.抽提质粒的基本原理是什么？抽提质粒的基本原理是什么？3.质粒抽提实验中溶液质粒抽提实验中溶液1、2、3各有什么作用？各有什么作用？4.比较本实验和实验六（细胞中总比较本实验和实验六（细胞中总DNA的提取）的提取）的主要原理和操作步骤差异，并分析操作差异的主要原理和操作步骤差异，并分析操作差异的主要原因。的主要原因。1.溶液溶液1:50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L TrisHCl(pH=8.0)n葡萄糖葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，：使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作受机械剪切力作用而降解。用而降解。nEDTA：是：是Ca2+和和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制螯合掉，从而起到抑制DNase对对DNA的降解和抑制微生物的降解和抑制微生物生长的作用。生长的作用。附：试剂介绍附：试剂介绍2.溶液溶液2：0.2mmol/L NaOH，1%SDS。nNaOH：是是最最佳佳溶溶解解细细胞胞的的试试剂剂。不不管管大大肠肠杆杆菌菌还还是是哺哺乳乳动动物物，碰碰到到了了碱碱都都会会在在瞬瞬间间溶溶解解，这这是是由由于于细细胞胞膜膜发发生生了了从从双双层层膜膜结结构构向向微微囊囊结结构构的的相相变变化化。用用不不新新鲜鲜的的NaOH，即即使使有有SDS也也无无法法有有效效溶溶解大肠杆菌。解大肠杆菌。nSDS：是是离离子子表表面面活活性性剂剂。它它主主要要作作用用是是：A 溶溶解解细细胞胞膜膜上上的的脂脂质质与与蛋蛋白白，从从而而破破坏坏细细胞胞膜膜。B 解解聚聚细细胞胞中中的的核核蛋蛋白白。C 能能与与蛋蛋白白质质结结合合，是是蛋蛋白白质质变变性性而而沉沉淀淀下下来来。SDS能能抑抑制制核核糖糖核核酸酸酶酶的的作作用用，所所以以在在接接下下来来的的提提取取过过程程中中必必须须把把它它去去除除干干净净，以以便便下下一一步实验更好的进行。步实验更好的进行。3.溶液溶液3：0.5mol/L乙酸钾溶液乙酸钾溶液60mL,11.5mL冰乙酸，冰乙酸，28.5mLH2O n乙乙酸酸钾钾溶溶液液：为为了了把把抽抽提提液液的的pH调调至至中中性性，从从而而使使变变性性的的质质粒粒DNA复性，且稳定存在。复性，且稳定存在。