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表面增强拉曼散射表面增强拉曼散射SERSSERS目录一、纳米颗粒概述及SERS相关历史二、SERS原理三、SERS仪器四、SERS应用五、SERS前景2一、一、纳纳米米颗颗粒概述及粒概述及SERSSERS相关相关历历史史3一、纳米颗粒概述及SERS相关历史纳米材料:广义上是三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或者由该尺度范围的物质为基本结构单元所构成的材料的总称。纳米材料特性：表面效应小尺寸效应宏观量子隧道效应量子限域效应4表面效应指纳米颗粒表面原子数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后所引起的性质上的变化。5表面效应6小尺寸效应当纳米微粒尺寸与光波波长，传导电子的德布罗意波长等物理特征尺寸相当或更小时，纳米微粒的周期性边界将被破坏。其结果是纳米材料的声、光、电、磁、热、力学等性能将异于普通材料。7小尺寸效应例如，铜颗粒达到纳米尺寸时就变得不能导电；绝缘的二氧化硅颗粒在20纳米时却开始导电。利用这一特性，可以高效率地转变太阳能为热能、电能。8宏观量子隧道效应微观粒子具有的能够贯穿势垒的能力称为隧道效应。纳米粒子可以穿过宏观系统的势垒而产生变化，这被称为纳米粒子的宏观量子隧道效应。9量子限域效应又称量子尺寸效应，当粒子的尺寸达到纳米量级时，费米能级附近的电子能级由连续态分裂成分立能级。当能级间距大于热能、磁能、静电能、静磁能、光子能或超导态的凝聚能时，会出现纳米材料的量子效应。10量子限域效应例如，有种金属纳米粒子吸收光线能力非常强，在1.1365千克水里只要放入千分之一这种粒子，水就会变得完全不透明。11纳米材料分类及应用纳米材料分为：纳米粉末纳米纤维纳米膜纳米块体12纳米材料分类及应用纳米粉末：粒度一般在100nm以下。介于原子、分子与宏观物体间的中间物态的固体颗粒材料。纳米纤维：直径为纳米尺度的线状材料。可用于：微导线、微光纤新型激光或发光二极管材料等。13纳米材料分类及应用纳米膜：颗粒膜、致密膜。颗粒膜是纳米颗粒粘在一起，中间有极为细小的间隙的薄膜。致密膜是膜层致密但晶粒尺寸为纳米级的薄膜。可用于：气体催化、过滤器、高密度磁记录材料、光敏材料、平面显示器、超导材料等。纳米块体：将纳米粉末高压成型或控制金属液体结晶而成。可用于：超高强度材料；智能金属材料等。14拉曼散射历史l1905年，爱因斯坦提出了光电效应的光量子解释。l1922年9月，拉曼在光的分子衍射一书中最后提到，如果散射过程能够被看作光量子和散射分子之间的碰撞，他将有与经典的电磁理论所预期的不同的结果。l1923年A.G.S.斯梅卡尔从理论上预言了频率发生改变的散射。15拉曼散射历史l海森堡在1925年预言，在可见光中可能也会有类似的效应存在。l1923年，拉曼和他的助手发现一种“荧光”效应。以太阳光为光源，观察它穿过蒸馏水的散射线，并在入射光路中加一个紫色滤光镜，未料观察到一种较通常的散射线波长有微弱变化的二次射线，他们将此种微弱射线归结为某种“荧光”现象。16拉曼散射历史 但是但是他们不敢轻易下结论，因为这种现象太弱了。之后，他们找到了将荧光分离出来的一种手段，用屋顶上的定日镜把太阳光送进实验室，经汇聚照到实验样品上，入射光路与出射光路分别放置一对互补滤色镜。17拉曼散射历史结果发现，穿过样品的散射光通过滤光镜后并未完全消失，还能观测到暗淡的光线。当时给出解释为：样品中含有某些杂质，激发出荧光。这这种解种解释释被大多数被大多数实验实验否定。否定。1.在80多种不同的、经过精心提纯的液体样品中无一例外的存在着；2.在甘油样品实验中，这种现象更为明显，并且最后的出射线已被极化，成了偏振光。18拉曼散射历史拉曼和助手把此现象与克拉姆斯海森堡的色散理论相联系，称之为“分子散射”。经过5年的研究，1928年2月16日，向science投稿。之后，改进试验装置，用大孔径聚光器、汞弧灯及滤光片获得了较强的单色光。1928年2月28日下午，观察液体散射光谱时，观察到汞弧灯中没有的若干谱线，在拍摄的光谱照片上还证实了散射光不仅有红移，还有蓝移。19拉曼散射历史然而由于当时还未出现关于激光的应用，因此三十年代至六十年代，拉曼散射的研究处于一个低潮时期，主要的原因来自激发光源太弱的问题。1960年，红宝石激光器的出现，使得拉曼散射的研究进入了一个全新时期。由于激光器的单色性好，方向性强，功率密度高，用它作为激发光源，大大提高了激发效率。20SERS的发现Fleischmann,M.et.Al.,Chem.Phys.Lett.1974,26,163Jeanmaire,D.L.;Van Duyne,R.P.J.Electroanal.Chem.1977,84,1.Albrecht,M.G.;Creighton,J.A.J.Am.Chem.Soc.1977,99,5215.文章中，他们报道了吸附在用电化学方法粗糙化的银电极表面的吡啶分子在不同电位下的拉曼光谱，表明了拉曼光谱能与电化学方法联用而测得吸附在电极表面的分子的信息。由此便开启了拉曼散射这一现象的全新应用：SERS21参考文献1.https:/zh.wikipedia.org/wiki/纳米颗粒2.戈丹,千舒.震惊世界的100个科学发现(下).呼和浩特：内蒙古人民出版社,2007.3.Fleischmann,M.et.Al.,Chem.Phys.Lett.1974,26,1634.Jeanmaire,D.L.,Van Duyne,R.P.J.Electroanal.Chem.1977,84,1.5.Albrecht,M.G.,Creighton,J.A.J.Am.Chem.Soc.1977,99,5215.6.http:/ 拉曼散射原理拉曼散射：定义：指光波在被散射后频率发生变化的现象图片来源：http:/www.raman.de/assets/img/raman-intensities.jpg242.1.1 光的粒子性的角度光子与分子的非弹性碰撞252.1.2 能级跃迁角度拉曼散射的入射光子的能量不等于分子任意两能级之间的能级差。虚能级：分子在这段时间内能保存从入射光子处吸收的能量，此时分子能量比基态高，但又不对应任何一个真实的能级，我们称此时分子处于一个虚能级。虚能级是一种非常短暂的，不可观察的量子态。262.1.2 能级跃迁角度基态基态激发态激发态虚能级虚能级h(v0-v)斯托克斯线斯托克斯线v v0 0-v vhv0hv0瑞利散射瑞利散射v v0 0h(v0+v)反斯托克斯线反斯托克斯线v v0 0+v v散射线的强度散射线的强度如何解释？如何解释？虚能级虚能级hv0hv0272.1.2 能级跃迁角度根据波尔兹曼分布，处于基态的粒子数远大于处于振动激发态的粒子数Anti-Stokes谱线与Stokes谱线的强度比满足公式：282.1.3 诱导偶极矩角度292.2 表面增强原理302.2.1 电磁增强312.2.1 电磁增强322.2.1 电磁增强332.2.1 电磁增强342.2.1 电磁增强352.2.2 化学增强化学增强被定义为样品分子吸附在衬底上时极化率的变化。增强的数量级：10-100电荷转移模型（普遍接受）362.2.2 化学增强电荷转移模型TypeI:样品分子没有与纳米金属粒子共价结合TypeII:样品分子与金属纳米粒子共价结合或通过电解质离子间接结合TypeIII:TypeII的更加复杂的形式包含光驱动的电荷转移的过程37参考文献1.http:/www.raman.de/assets/img/raman-intensities.jpg2.https:/en.wikipedia.org/wiki/Virtual_state3.董炎明,熊晓鹏,郑薇等.高分子研究方法.中国石化出版社,2011,04:222-224.4.Eric C.Le Ru,Pablo G.Etchegoin.Principles of surface enhanced raman spectroscopy and related plasmonic effects.Elsevier Science,2008,11:185-264.5.兰燕娜,周玲.表面增强拉曼光谱J.南通工学院学报(自然科学版),2004,(02):21-23.38三、三、SERSSERS仪仪器器39三、SERS仪器仪器的种类及结构组成1-3纳米基底或探针的制备4-640色散型激光拉曼光谱仪41傅立叶变换拉曼光谱仪42衬底或探针的制备表面增强拉曼散射光谱是需要利用表面具有纳米级粗糙度（贵）金属（或金属纳米粒子）作为分析物衬底来产生SERS效应衬底纳米材料的性质主要是由材料本身的尺寸、形状、材料种类等因素决定某些情况下，衬底纳米材料尺寸结构或形状发生了微小的变化，可能导致SERS增强因子产生几个数量级的变化43衬底或探针的制备金属纳米粒子溶胶溶液纳米光刻法模板法光纤探针44金属纳米粒子溶胶溶液制备方法柠檬酸三钠还原法：取一定量的硝酸银溶液转移至250ml圆底烧瓶中，油浴加热，不断搅拌。待溶液沸腾后将一定量的柠檬酸三钠溶液逐滴加入硝酸银溶液中，滴加完成后，继续加热搅拌60min后，停止加热，自然冷却，得到灰色的银溶胶，倒入棕色的广口瓶中避光保存。45金属纳米粒子溶胶溶液优点：制备简便易行增强效应比较好缺点：适用范围小金属溶胶是一种亚稳态体系,加入分析物后粒子容易聚集,但溶胶的聚集程度难以控制,导致拉曼信号的重现性差46纳米光刻法直接在固体基底上制备的纳米结构SERS衬底最常用的现代光刻技术为聚焦离子束和电子束光刻技术可以精确控制纳米结构的大小和形状47纳米光刻法电子束光刻原理图48纳米光刻法电子束光刻技术：把10-50keV的电子束聚焦在SiOx/Si固体基底上，并在其表面涂上电子束抗蚀剂，电子束选择性的腐蚀掉预定形状区域表面的抗蚀剂，形成预定形貌的纳米粒子阵列49纳米光刻法EBL方法制备的阵列结构SERS衬底的SEM图50纳米光刻法电子束光刻法优点：与一般的光学光刻法相比，成本较低精确控制纳米粒子的形状、大小以及粒子间隔，重现性好缺点：耗时，产量低邻近效应限制分辨率51模板法把可控几何形状的金属纳米粒子沉积在模板上模板的直接合成是一个宽泛的研究领域，常用的模板主要分为硬模板和软模板52模板法硬模板：阳极氧化铝模板（AAO）是一种蜂窝状密集排列的数以万计的纳米级孔结构，常被用来制备高性能的SERS衬底53模板法硬模板法制备Ag纳米棒及其应用示例54模板法不同浓度的R6G溶液在这种SERS衬底上的拉曼光谱55模板法优点：使大规模生产得以实现成本较低硬膜法重现性较好软膜法能制备不同形状的纳米结构缺点：硬膜法所得纳米结构比较单一软膜法重现性相比硬膜法较差56光纤探针利用光纤材料，经过适当地物理或者化学处理使光纤针头表面粗糙化，再利用自组装、激光诱导、真空蒸镀等方法在其表面镀上一层金属纳米粒子锥形、直形、D形、楔形57光纤探针锥柱组合型光纤探针是先经氢氟酸腐蚀出锥柱结构,再通过自组装法把银纳米颗粒修饰到光纤表面58光纤探针光纤表面SERS活性基底的制作:羟基化过程氨基化过程银纳米颗粒自组装59光纤探针锥柱型光纤探针表面上银纳米颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像60光纤探针锥柱形探针灵敏度检测61光纤探针优点：方法简单、可靠且低成本重现性较好，可以满足一般样品检查远程传感功能缺点：不能精确控制纳米粒子镀层的参数62参考文献1.潘铁英,康燕,钱枫.波谱解析法(第三版)M.上海：华东理工大学出版社,2015,07:141.2.周宇超.拉曼光谱仪J.中国医学装备,2004,1(4).3.李淑玲.拉曼光谱仪及其应用进展J.岩矿测试,1998,17(4).4.董前民等.表面增强拉曼散射衬底的研究及应用J.光谱学与光谱分析,2013,33(6).5.Ding H P,Wang M Chen L J,et al.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2011,387,(1-3):1.6.郭旭东等.锥柱型光纤探针在表面增强拉曼散射方面的应用J.物理学报,2017,66(4).63四、SERS应用64四、SERS应用领域分析化学生物医学检测表面吸附和催化反应金属防腐65FOCUSSERS纳米传感器在活细胞中的应用SERS“分子前哨”（SERS-MS）66SERS纳米传感器在活细胞中的应用在活细胞研究中SERS的优势纳米颗粒的选择金纳米探针进入活细胞的过程SERS光谱分析结果对金纳米颗粒的保护吲哚菁绿信号标记的SERS纳米传感器（ICG-SERS）67在活细胞研究中SERS的优势在关于活细胞，组织和微生物的众多研究中，有两个主要参数：1.横向分辨率，影响生物体的大小，数量和异质性（s）信息；2.检测灵敏度：影响测量的持续时间以及样品的完整性，时间分辨率和体内适用性。SERS的优势：1.横向分辨率高；2.检测灵敏度高。68纳米颗粒的选择要求：1.金属纳米结构需要与生物系统相容;2.材料应该是惰性的，如果可能，不影响其周围环境。69金纳米探针进入活细胞的过程在用SERS纳米传感器探测活细胞的过程中，许多细胞本身不需要进一步的诱导就能吸收纳米探针。该方法可用于选择性地探测细胞中囊泡转运中涉及的细胞亚结构。70金纳米探针进入活细胞的过程71SERS光谱分析结果72对金纳米颗粒的保护不同的方法已被提出保护金纳米颗粒，例如使用牛血清白蛋白。在添加胎牛血清（FCS）的培养条件下，可以防止培养基中金纳米颗粒的絮凝，胶体粒子能够稳定数天之久。将纳米颗粒浸入含FCS的培养基中的TEM研究结果表明，除了单个颗粒之外，形成的纳米聚集体的直径大约只有100nm。73（a）浸入细胞培养液（内含胎牛血清）中的金纳米粒子的电子显微镜照片（b）用金纳米颗粒（箭头）孵育2小时后，在内体中显示单个颗粒的上皮细胞的电子显微照片74吲哚菁绿信号标记的SERS纳米传感器（ICG-SERS）利用SERS方法创建具有高灵敏度，特异性和空间定位的光学标签对于细胞内探测是非常有必要的，可以在细胞环境中提供化学分子和结构信息的标签对于细胞研究将更有帮助。生物相容性染料吲哚菁绿（ICG）经常被用作生物医学应用的荧光标记物。因此ICG-SERS纳米传感器在生物医学方面也得到了广泛应用。75（a）使用激发波长786nm获得的银（痕量A）和金（痕量B）胶体溶液中的10-7MICG-SERS光谱。（b）含有与HSA结合的510-6M吲哚菁绿（ICG）的银和金胶体样品溶液（分别为光谱A和B）的消光光谱。插图显示了在水中与HSA结合的510-6MICG的吸收。76ICG-SERS的应用为了研究HSA对SERS光谱的影响，我们测量了在金胶体溶液中与HSA结合的纯ICG和ICG的光谱。两个光谱显示出非常相似的特征。这些发现与最近的观察结果非常一致，即血清白蛋白不会干扰SERS的检测。光谱之间光强的差异非常可能与无HSA样品中染料聚集体的形成有关。这个实验证明了HSA处理的重要性。77SERS“分子前哨”（SERS-MS）SERS“分子前哨”是一种新的诊断方法，其涉及等离子体激元基纳米探针，由一端具有拉曼标记分子的DNA发夹环和另一端的金属纳米颗粒组成。MS纳米探针具有两个基本特征：1.等离子体激元效应的调制以改变标记的SERS光谱强度;2.DNA发夹环序列识别和鉴别各种分子靶序列的特异性。78金属表面存在着大量的价电子，它们自由地运动在费米面内，由于库仑作用的长程性，导致电子系统存在着集体激发，其密度起伏相对于原子核的正电荷背景而言，形成一个正负离子的集体的振荡，如图所示，称为表面等离子体激元。被激发的表面等离子体激元，会在纳米材料附近形成比激发电场强数倍甚至数十倍的电场79当MS探针处于发夹（闭合状态）构象时，SERS信号被检测到，而SERS信号在开放（杂交）状态下降低80当拉曼标记物与纳米颗粒接触或接近时（1nm），诱导相邻的拉曼标记分子产生强的SERS效应。在正常条件下，当用激光激发拉曼标签时，发夹环配置与强的SERS信号一致。然而，当与互补靶DNA进行杂交时，发夹环开放并物理分离拉曼标记物与纳米颗粒。由于SERS的光谱信号强烈依赖于拉曼标记和金属纳米颗粒之间的距离d，杂交过程导致SERS效应的强烈降低。等离子体激元纳米探针起到分子前哨的作用，巡视样品溶液，当没有显着事件发生时，其警告灯“开启”。每当识别和检测到目标DNA时，分子哨兵就会熄灭它们的光，从而提供可测量的光学信号变化。81使用SERS“分子前哨”探针检测HIV1序列：没有靶DNA序列的HIV1SERS-MS纳米探针的SERS光谱（上曲线：空白）和存在非互补DNA靶序列（中间曲线：阴性诊断）和互补的HIV1DNA靶标（下曲线：阳性诊断）。来自SERMS纳米探针的SERS信号的阈值电平用虚线表示82参考文献1.韩晓霞.基于表面增强拉曼散射的蛋白质检测方法研究D.吉林大学,2009,5.2.兰燕娜,周玲.表面增强拉曼光谱J.南通工学院学报(自然科学版),2004,(02):21-23.3.Kneipp,Katrin,Moskovits,Martin,Kneipp,Harald.Surface-Enhanced Raman Scattering:Physics and ApplicationsM.Springer,2006:335-349,409-426.83五、SERS前景841、新兴应用非标记的组织SERS检测临床肿瘤病理的分子水平SERS尚未开展活体研究TERS技术TERS&内窥镜851、新兴应用861、新兴应用871、新兴应用免疫检测以标记DTNB的金纳米粒子作为探针，首次开展SERS技术原位检测人前列腺组织切片中PSA抗原的表达研究发现上皮细胞中有很强的SERS信号，而间质或腺腔中未探测到SERS信号881、新兴应用免疫检测磁珠复合物+外周血检测法组织切片中蛋白质表达的分析循环肿瘤细胞的检测；活体肿瘤的靶向检测探针的特异性提高后可广泛应用于临床892、优点可用于固、气、液相检测条件温和，对温度和压强等不敏感短时程可用于水溶剂体系检出限低，甚至可用于单个分子不需要太强的光强，漂白效应很低902、优点退偏度拉曼散射条带的退偏度值取决于分子的对称性以及标准的振动模式退偏度取值区间为00.75当取值为0时，称为完全偏振带；取值00.75之间时，称为部分偏振带；取值为0.75时，称为退偏带对称性结构/基团91SERS VS 红外光谱拉曼光谱的样品处理过程较简单水溶液的拉曼散射效应十分微弱SERS的高空间分辨能力923、仍存在的缺陷无法用于金属/合金基底导致的较低重现性存在争议的原理：分子本身对电场存在影响933、仍存在的缺陷一些材料的荧光会对其造成干扰其中高分子的荧光干扰最为明显荧光可能覆盖整个频率范围，甚至将信号完全淹没解决办法：测定前先用强激光曝光样品几分钟甚至数小时，使荧光大大衰减；或者改变入射光的波长以降低荧光的发光率943、仍存在的缺陷SERS基底的产业化不同位点的增强效应差别可达几个数量级产业化的过程中实现均匀性的高度可控民用手持拉曼光谱仪的普及95参考文献1.陈燕坪.表面增强拉曼光谱技术在肿瘤病理中的应用J.激光生物学报,2012,21(2).2.任斌.定量是表面增强拉曼光谱的绝对挑战.http:/ C.Le Ru,Pablo G.Etchegoin.Principles of surface enhanced raman spectroscopy and related plasmonic effectsM.Elsevier Science,2008,11:185-264.4.兰燕娜,周玲.表面增强拉曼光谱J.南通工学院学报(自然科学版),2004,(02):21-23.96THANKS