第2章细胞生物学的研究方法.ppt

第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、扫描隧道显微镜光学显微镜技术基本参数分辨率 R=0.61/NA放大率Figure 9-11a Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)肾的尿道横切面，用苏木精-伊红染 色Figure 9-11b Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)植物根横切面，番红番红快绿快绿染 色Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)几种特殊的光学显微镜相差显微镜技术把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1.环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。2.相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。用途：观察未经染色的玻片标本 倒置显微镜倒置显微镜物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。干涉显微镜干涉显微镜（DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。暗视野显微镜暗视野显微镜聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。可观察 4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。荧光显微镜特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)图中图中,DNA 为蓝色为蓝色，微管为绿色，微管为绿色用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Figure 9-15 Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)细胞有丝分裂细胞有丝分裂,DNA 为蓝色为蓝色，微管为绿色，中心体为红色，微管为绿色，中心体为红色2024/11/5 周二18荧光显微镜 Fluorescence Microscopy荧光共振能量转移(FRET)Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)激光共聚焦扫描显微境激光共聚焦扫描显微境 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton(green)and the nucleus(blue)http:/www.itg.uiuc.edu/2024/11/5 周二22Slide 40 x活细胞图像4维分析激光共焦显微镜LSCM2024/11/5 周二23活细胞内分子图像追踪电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜透射电子显微镜以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（小于0.2m）。20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。扫描电子显微镜扫描电子显微镜人类红细胞人类红细胞扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET FRET技术是检测活体中生物大分子纳技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可以检测某一细胞中两个蛋白是具，可以检测某一细胞中两个蛋白是否存在直接的相互作用否存在直接的相互作用 Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP 荧光漂白恢复原理荧光漂白恢复原理:利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞浆中运动至光漂白区来完成的淬灭，通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞浆中运动至光漂白区来完成光漂白区荧光的恢复。光漂白区荧光的恢复。FRAP可以用于解决活细胞内包括蛋白定位，动力可以用于解决活细胞内包括蛋白定位，动力学以及与其他成分相互作用等一系列问题。学以及与其他成分相互作用等一系列问题。vFreezeEtchingFracture冷冻蚀刻冷冻蚀刻FreezeFracture andEtching Replication冷冻断裂蚀刻复型冷冻断裂蚀刻复型第二节第二节细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分 子及其复合物二、细胞内生物大分子的示踪技术、原位杂交三、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态四、流式细胞技术、技术进展和功能离心技术差速离心密度梯度离心 速度密度梯度离心 等密度梯度离心SubsequentpurificationbyDensity-GradientEquilibriumCentrifugationIsolation,purification,andfractionationofproteinsvSelectivePrecipitationv(ammonium sulfate)vLiquidColumnChromatography（柱层析）（柱层析）vIon-exchange Chromatographyv Gel Filtration Chromatography 又称排阻层析或分子筛方法：交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)v Affinity ChromatographyvPolyacrylamideGelElectrophoresis细胞内生物大分子的示踪技术、细胞内生物大分子的示踪技术、原位杂交原位杂交（一）细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类（一）细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法与脂质等的显示方法1、DNA的细胞分布的细胞分布-Feulgen法法 2、RNA的细胞分布的细胞分布-Brachet法法 原位杂交 应用放射自显影技术研究生物大应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态分子在细胞内的合成动态 流式细胞技术流式细胞分选仪工作原理。流式细胞分选仪工作原理。（A）当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷或不被充电。因带有不同表面标志的细胞所带的电荷的不同，当液滴通过高压偏转板时，液滴发生偏转，从而达到将细胞分选的目的。（B）显示流式细胞仪分析处在不同时相的Hela细胞的实验结果（2N：G1期，2N4N：S期，4N：G2/M期）2024/11/5 周二41流式细胞术 Flow Cytometry第三节第三节细胞培养、细胞工程与组细胞培养、细胞工程与组学研究技术学研究技术 CHO细胞的培养细胞的培养细胞的培养 动物细胞培养动物细胞培养 类型：类型：原代培养细胞（primary culture cell）继代培养细胞（sub-culture cell）细胞株细胞株（cell strain）细胞系细胞系（cell line）植物细胞植物细胞 原生质体培养（体细胞培养）类型类型：单倍体细胞培养（花药培养）非细胞体系非细胞体系（cell-free system）细胞工程细胞工程细胞融合细胞融合（cell fusion）与细胞杂交与细胞杂交（cell hybridization）技术技术单克隆抗体单克隆抗体（monoclone antibody）技术技术 图细胞拆合与显微操作技术细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术(图1、图2)化学法结合离心技术制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈瓶颈2024/11/5 周二46Monoclonal antibody technology小鼠脾（B淋巴细胞）X骨髓瘤细胞 细胞融合HAT培养基H：hypoxanthine 次黄嘌呤A:aminopterin 氨基蝶呤：阻断核酸合成主通道T:thymine 胸腺嘧啶（突变肿瘤细胞：无胸腺嘧啶核苷激酶(TK,合成DNA旁路酶)和 磷酸核糖转移酶(HGPRT,合成RNA旁路酶）KnockoutMice The technique used to generateknockout micewasdevelopedinthelate1980sbyMarloCapecchiattheUniversityofUtah.实验分三步分三步 构建重构建重组体；体；转基因敲除；基因敲除；筛选。2024/11/5 周二502024/11/5 周二51Exogenous and Endogenous RNAiLiposome-mediated TransfectionRNA干扰2024/11/5 周二53细胞的系统生物学系统地研究并理解细胞的结构与行为 细胞的所有大分子 在整个机体中研究细胞的效应Cytomics细胞组学 2024/11/5 周二542024/11/5 周二55数字细胞(Digital cell)（E-cell)活细胞的计算机模型，反映细胞内分子的互作网络http:/www.e-cell.org/software/e-cell-systemE-Cell计算机模拟细胞。E-CellProject国际合作研究项目，旨在发展有关 的理论，技术，软件等平台，以获 得完整的细胞模型。E-CellSystem细胞模拟软件系统，用于诸如生物 细胞那样复杂系统的高通量大规模 分析。2024/11/5 周二562024/11/5 周二57基因芯片 Gene Microarray2024/11/5 周二58细胞是生命科学研究的重要模型1.生物体的基本单位2.具有生命的所有特性3.完整的遗传物质 4.完整的基因调控系统5.有关细胞的研究技术合手 段快速发展