第六章动物体外受精技术.ppt

第六章第六章 动物体外受精技术动物体外受精技术河南农业大学河南农业大学 韩雪蕾韩雪蕾目录目录第一节第一节体外受精技术概述体外受精技术概述第二节第二节卵母细胞的体外成熟卵母细胞的体外成熟第三节第三节体外受精方法体外受精方法试管婴儿试管婴儿1978年年7月月26日，世界日，世界首例试管婴儿首例试管婴儿“路易路易斯布朗斯布朗”在英国诞在英国诞生，现已成为母亲。生，现已成为母亲。转基因试管牛转基因试管牛我国首例转基因试管我国首例转基因试管牛牛“滔滔滔滔”于于1999年年2月月19日在上海诞生日在上海诞生19881988年年3 3月月1010日我国首例试管婴儿日我国首例试管婴儿根据资料回答下列问题：根据资料回答下列问题：1.1.资料上用到了什么生物技术？资料上用到了什么生物技术？试管婴儿技术试管婴儿技术（包括体外受精、早期胚胎（包括体外受精、早期胚胎培养）和培养）和胚胎移植技术胚胎移植技术。2.2.试管婴儿和母亲正常怀孕，生产的过程有何试管婴儿和母亲正常怀孕，生产的过程有何异同？异同？相同之处：相同之处：都通过有性生殖产生，在母体子宫都通过有性生殖产生，在母体子宫内发育形成胎儿内发育形成胎儿。不同之处：不同之处：受精作用在体外，并在体外发育成受精作用在体外，并在体外发育成早期胚胎进行胚胎移植早期胚胎进行胚胎移植。第一节第一节 体外受精技术概述体外受精技术概述l从狭义上讲，体外受精是指将动物受精过程中从狭义上讲，体外受精是指将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的一种现象，包括的精卵结合在体外环境下完成的一种现象，包括自然条件下的体外受精和人为培养条件下的体外自然条件下的体外受精和人为培养条件下的体外受精。受精。l通常所指的体外受精技术，即为将哺乳动物的通常所指的体外受精技术，即为将哺乳动物的精子和卵子置于体外适宜的培养条件下使之完成精子和卵子置于体外适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。受精的一种技术。l在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物得的动物称试管动物(test-tube animal)l从广义上讲，体外受精又包含卵母细胞的体外从广义上讲，体外受精又包含卵母细胞的体外成熟培养和受精卵的体外培养两项密切相关的技成熟培养和受精卵的体外培养两项密切相关的技术。术。一、体外受精技术的概念体外受精技术的概念二、体外受精技术的发展概况体外受精技术的发展概况l哺乳动物体外受精的研究已有哺乳动物体外受精的研究已有120多年的历史。多年的历史。l1878年，德国科学家年，德国科学家Schenk首先开始哺乳动物体外受精首先开始哺乳动物体外受精的尝试。的尝试。l1944年，年，Pock和和Menkin进行了人卵的体外受精研究。进行了人卵的体外受精研究。l精子获能现象的发现，是哺乳动物体外受精发展史上的精子获能现象的发现，是哺乳动物体外受精发展史上的里程碑。里程碑。l1959年，美籍华人张明觉获得了世界上第一批体外受精年，美籍华人张明觉获得了世界上第一批体外受精的试管小兔。此时，体外受精技术才真正得到承认并为人的试管小兔。此时，体外受精技术才真正得到承认并为人们所接受。们所接受。l先后在近先后在近20余种动物进行了体外受精的研究，有余种动物进行了体外受精的研究，有10余种余种动物获得了体外受精的试管动物。动物获得了体外受精的试管动物。l目前，一套高效的牛胚胎体外生产程序已建立起来。目前，一套高效的牛胚胎体外生产程序已建立起来。l我国体外受精技术的研究起步于我国体外受精技术的研究起步于80年代后期，年代后期，但进展很快，已先后在人和牛等但进展很快，已先后在人和牛等8种动物取得成种动物取得成功。功。l目前，人和牛的体外受精技术已达到国际先进目前，人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平，每年约有近千例试管婴儿诞生，数百头水平，每年约有近千例试管婴儿诞生，数百头试管牛出生。试管牛出生。l1990年我国钱菊芬获得首例试管山羊年我国钱菊芬获得首例试管山羊l旭日干、范必勤等获得试管牛犊旭日干、范必勤等获得试管牛犊l三、体外受精的意义三、体外受精的意义l体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义；学和濒危动物保护等具有重要意义；l在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值；值；l是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分；现代生物技术不可缺少的组成部分；四、体外受精技术环节四、体外受精技术环节l卵母细胞的获得和体外成熟卵母细胞的获得和体外成熟l精子的体外获能精子的体外获能l成熟卵母细胞与获能精子的体外受精成熟卵母细胞与获能精子的体外受精l受精卵的体外培养受精卵的体外培养l受精卵的移植受精卵的移植五、体外受精技术的应用范围五、体外受精技术的应用范围（一）、基础研究（一）、基础研究 1.再现体内受精过程再现体内受精过程 2.研究珍稀动物的早期胚胎发育研究珍稀动物的早期胚胎发育 3.研究细胞膜融合现象和机理研究细胞膜融合现象和机理（二）、应用研究（二）、应用研究 1.治疗人类不孕症治疗人类不孕症 2.为胚胎移植产业开辟大量胚胎来源为胚胎移植产业开辟大量胚胎来源 3.家畜品种改良家畜品种改良 4.保种保种 5.其他用途其他用途第二节第二节 卵母细胞的获得与体外成熟卵母细胞的获得与体外成熟一、卵母细胞的采集方法一、卵母细胞的采集方法获得足够数量的卵母细胞是生产试管动物的获得足够数量的卵母细胞是生产试管动物的前提。前提。1.卵母细胞的离体采集卵母细胞的离体采集（1）卵泡抽吸法：用注射器套上）卵泡抽吸法：用注射器套上1216号针头号针头穿刺卵泡而将卵母细胞抽吸出来。注射器保穿刺卵泡而将卵母细胞抽吸出来。注射器保持一定负压，针头从卵泡侧面刺入，一次进持一定负压，针头从卵泡侧面刺入，一次进针抽吸卵巢皮质多个卵泡，避免污染。针抽吸卵巢皮质多个卵泡，避免污染。优缺点：回收速度快，不易造成污染；容易优缺点：回收速度快，不易造成污染；容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞损伤卵母细胞周围的卵丘细胞（2）卵泡剥离法：用无菌眼科剪刀或刀片，）卵泡剥离法：用无菌眼科剪刀或刀片，自卵泡周围，将周围组织分离，取下完整的自卵泡周围，将周围组织分离，取下完整的圆形卵泡，放到加油培养液的平皿中，切开圆形卵泡，放到加油培养液的平皿中，切开卵泡，卵泡液带着卵母细胞流出。卵泡，卵泡液带着卵母细胞流出。优缺点：程序较为复杂，但是对卵丘优缺点：程序较为复杂，但是对卵丘-卵母细卵母细胞复合体的损伤小。胞复合体的损伤小。（3）切剖法：用平行排列成组的剃须刀片纵）切剖法：用平行排列成组的剃须刀片纵横切割卵巢，回收液体放在捡胚皿中，横切割卵巢，回收液体放在捡胚皿中，37度度培养箱静止培养箱静止10min，用注射器吸取上清，镜，用注射器吸取上清，镜检卵母细胞。检卵母细胞。优点：回收效率较高。优点：回收效率较高。（4）卵巢解剖法：）卵巢解剖法：用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间髓质用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间髓质部分，露出卵泡，然后用刀片划破卵泡，在部分，露出卵泡，然后用刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗，采集其中的卵母细胞。培养液中反复冲洗，采集其中的卵母细胞。优缺点：回收速度相对较慢，容易造成污染；优缺点：回收速度相对较慢，容易造成污染；能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率相对比较高。收率相对比较高。2.卵母细胞的活体采集卵母细胞的活体采集（1）腹腔镜法：在腹壁切开一个小口，插入腹）腹腔镜法：在腹壁切开一个小口，插入腹腔镜、操作杆和穿刺针，通过操作杆和穿刺针的腔镜、操作杆和穿刺针，通过操作杆和穿刺针的配合将卵母细胞吸出。配合将卵母细胞吸出。优缺点：比较直观，容易掌握；工作量大，对母优缺点：比较直观，容易掌握；工作量大，对母牛的损伤较大，不能频繁手术。牛的损伤较大，不能频繁手术。（2）B超超声波法：将供体母畜牢牢固定在保定超超声波法：将供体母畜牢牢固定在保定架内，普鲁卡因麻醉，将带有超声波探头和采卵架内，普鲁卡因麻醉，将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到阴道子宫颈一侧穹窿处。而后针的采卵器插入到阴道子宫颈一侧穹窿处。而后术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕超屏幕上显示的卵泡位置进行穿刺，而将卵母细胞取出。上显示的卵泡位置进行穿刺，而将卵母细胞取出。优缺点：不用进行手术，操作速度较快，对母牛优缺点：不用进行手术，操作速度较快，对母牛损伤小，可频繁反复采卵，也可对妊娠母牛进行损伤小，可频繁反复采卵，也可对妊娠母牛进行采卵；操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设采卵；操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。备。牛卵巢牛卵巢牛卵巢中采卵牛卵巢中采卵B B超活采仪超活采仪活活体体采采集集的的牛牛卵卵母母细细胞胞合格卵母细胞标准：放射合格卵母细胞标准：放射冠细胞扩散良好，质地均冠细胞扩散良好，质地均一，放射冠细胞间透明；一，放射冠细胞间透明；透明带清晰；卵母细胞圆透明带清晰；卵母细胞圆形，直径大小适中，细胞形，直径大小适中，细胞质质地均匀，色泽柔和，质质地均匀，色泽柔和，透明度适中。透明度适中。l2、体外成熟的卵母细胞、体外成熟的卵母细胞l1）卵母细胞来源）卵母细胞来源l（1）卵巢来源）卵巢来源：从屠宰从屠宰 场宰杀的母畜获得卵巢，场宰杀的母畜获得卵巢，38 C生理盐水中保温，生理盐水中保温，宰杀后宰杀后 2 小时内运回实小时内运回实 验室。验室。图1 成熟卵母细胞图二、卵母细胞的分类二、卵母细胞的分类l（2）采集卵母细胞卵丘细胞复合物：用）采集卵母细胞卵丘细胞复合物：用 38 生理盐水洗涤卵巢生理盐水洗涤卵巢 2 次，左手持卵巢，右手持注次，左手持卵巢，右手持注射器，如图所示，抽取射器，如图所示，抽取 35mm 卵泡的卵泡液及卵泡的卵泡液及卵母细胞卵丘细胞复合物，置于卵母细胞卵丘细胞复合物，置于20ml试管内，试管内，静置待检。静置待检。选择选择 35 mm卵泡的原卵泡的原因是：更大卵泡的闭锁因是：更大卵泡的闭锁比例可能较高，更小卵比例可能较高，更小卵泡的发育程度可能低。泡的发育程度可能低。镜检卵母细胞卵丘复合物：镜检卵母细胞卵丘复合物：用吸管吸取经静置后试管底部的混合物于平用吸管吸取经静置后试管底部的混合物于平皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞卵丘复合物，置于另一平皿检出卵母细胞卵丘复合物，置于另一平皿中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次，在洗次，在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞卵丘复涤过程中要剔除不合格的卵母细胞卵丘复合物。选择合格的卵母细胞卵丘复合物非合物。选择合格的卵母细胞卵丘复合物非常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。卵母细胞卵丘复合物分类标准卵母细胞卵丘复合物分类标准a、分类依据：卵母细胞的直径、形状、质分类依据：卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。度、色泽。一般分为一般分为4级，级，1、2级为合格；级为合格；3、4级为不级为不合格。合格。l一级：卵母细胞：直径一级：卵母细胞：直径120m，圆形，质地均匀。圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整，卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整，质地均匀。质地均匀。l二级：卵母细胞：直径二级：卵母细胞：直径120m，圆形，质地均匀。圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完 整，质地均匀。整，质地均匀。l三级：卵母细胞：直径太大或太小三级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地均匀。椭圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地均匀。不完整，质地均匀。l四级：卵母细胞：直径太大或太小四级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地不均匀。椭圆形，质地不均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地不均匀。不完整，质地不均匀。退化的卵母细胞退化的卵母细胞可用卵母细胞可用卵母细胞三、卵母细胞的体外成熟三、卵母细胞的体外成熟未成熟的卵母细胞的核在细胞中央，成熟过程未成熟的卵母细胞的核在细胞中央，成熟过程中迁移到动物极质膜下，核变得膨大，改称发中迁移到动物极质膜下，核变得膨大，改称发生泡，接着进行第一次成熟分裂，减数分裂的生泡，接着进行第一次成熟分裂，减数分裂的完成标志着卵母细胞核的成熟完成标志着卵母细胞核的成熟（1）细细胞核成熟胞核成熟（2）细胞质的成熟细胞质的成熟显著的蛋白质合成发生在生发泡破裂前后，显著的蛋白质合成发生在生发泡破裂前后，这些新合成的蛋白质不仅与卵细胞自身成熟有这些新合成的蛋白质不仅与卵细胞自身成熟有关（激活成熟促进因子），而且与卵母细胞输关（激活成熟促进因子），而且与卵母细胞输精后的发育能力直接有关，所以细胞质成熟的精后的发育能力直接有关，所以细胞质成熟的质量如何直接影响到早期胚胎的发育能力质量如何直接影响到早期胚胎的发育能力胞质成熟主要表现为细胞器变化和纺锤体的胞质成熟主要表现为细胞器变化和纺锤体的形成形成卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，如卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，如高尔基体消失，线粒体分布核的周围，胞质内高尔基体消失，线粒体分布核的周围，胞质内有有PAS阳性的囊膜和脂滴阳性的囊膜和脂滴（3）细胞膜和透明带的成熟）细胞膜和透明带的成熟细胞膜稳定性发生改变，膜微绒毛发生重细胞膜稳定性发生改变，膜微绒毛发生重排，表现密集而有弯曲，并从透明带内退排，表现密集而有弯曲，并从透明带内退出或断裂出或断裂透明带外层呈网状，变软透明带外层呈网状，变软三、卵母三、卵母细细胞的体外成熟方法胞的体外成熟方法1.成熟培养液的成熟培养液的选择选择 用用于于卵卵母母细细胞胞体体外外成成熟熟的的基基础础培培养养液液有有TCM199、Hams F-10等等，添添加加胎胎犊犊血血清清（FCS）和和犊犊牛牛血血清清（NCS）比比添添加加牛牛血血清清蛋蛋白白（BSA）效效果果较较高高。可可添添加加hCG和和PMSG，促，促进进卵母卵母细细胞的体外成熟。胞的体外成熟。2.成熟培养的成熟培养的时间时间 对对于于大大多多数数家家畜畜来来说说，卵卵母母细细胞胞的的成成熟熟培培养养时时间间一一般般采用采用2224h，但猪的卵母但猪的卵母细细胞多采用胞多采用4044h，马马的卵母的卵母细细胞多采用胞多采用3036h。兔兔仅仅需需1215h。3.成熟培养的温度和气相环境成熟培养的温度和气相环境（1）温度）温度 牛、猪、羊、马的卵母细胞成熟培养温度均牛、猪、羊、马的卵母细胞成熟培养温度均采用采用3839。（2）气相环境）气相环境 一般都采用一般都采用5CO2，来维持培养液的酸碱度；，来维持培养液的酸碱度；4.成熟培养系统成熟培养系统（1）开放培养系统）开放培养系统体积：将体积：将12ml成熟培养液置于平皿或五孔成熟培养液置于平皿或五孔培养板中培养板中，然后放入然后放入50200枚卵母细胞。枚卵母细胞。优点：简单；同时培养大量的卵母细胞；培优点：简单；同时培养大量的卵母细胞；培 养结果不受石蜡油质量的影响养结果不受石蜡油质量的影响缺点：渗透压的变化较大；容易污染缺点：渗透压的变化较大；容易污染（2）微滴培养系）微滴培养系统统体体积积：将成熟培养液在培养皿中做成：将成熟培养液在培养皿中做成50500l的微滴的微滴，覆石蜡油。，覆石蜡油。优优点：渗透点：渗透压压比比较稳较稳定；不易定；不易污污染染缺点：缺点：对对培养液中的脂溶性物培养液中的脂溶性物质质有稀有稀释释作用；作用；成本成本较较高；培养高；培养结结果易受石蜡油果易受石蜡油质质量的影响，量的影响，目前很少用。目前很少用。（3）密闭培养系统）密闭培养系统体积：将卵母细胞置于体积：将卵母细胞置于12ml成熟培养液成熟培养液的试管中，加盖胶塞。的试管中，加盖胶塞。优点：不需要优点：不需要CO2培养箱，可用恒温水浴；培养箱，可用恒温水浴；方便运输方便运输缺点：缺点：pH值不如前者稳定值不如前者稳定适合需要再卵母细胞的运输途中进行成熟适合需要再卵母细胞的运输途中进行成熟时应用。时应用。卵母细胞的成熟培养：卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱培养箱卵母细胞的成熟培养：卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱培养箱三、卵母细胞体外成熟质量的评定三、卵母细胞体外成熟质量的评定1.形形态态观观察察法法：主主要要通通过过显显微微镜镜下下观观察察卵卵母母细细胞胞的形的形态态来判断是否成熟。来判断是否成熟。2.固固定定染染色色法法：将将卵卵母母细细胞胞周周围围的的卵卵丘丘细细胞胞用用0.1%的的透透明明质质酸酸酶酶去去掉掉，然然后后在在醋醋酸酸酒酒精精的的固固定定液液中中固固定定2428h，最最后后用用含含1%间间苯苯二二酚酚兰兰染色染色观观察。分察。分为为7个个阶阶段：段：（1）生发泡期（生发泡期（GV期）期）卵卵母母细细胞胞的的胞胞质质中中可可见见到到一一个个大大而而圆圆的的细细胞胞核（俗称生发泡），核膜清晰，界限明显核（俗称生发泡），核膜清晰，界限明显。生生发发泡泡：生生长长期期的的卵卵母母细细胞胞核核内内核核仁仁增增大大增增多多、合成活跃，细胞核膨大，称为合成活跃，细胞核膨大，称为生发泡生发泡。（2）生发泡破裂期（）生发泡破裂期（GVBD）核膜变得模糊，核膜的一侧出现缺口，染色质核膜变得模糊，核膜的一侧出现缺口，染色质隐约可见。隐约可见。(3)终变期（终变期（DK期）期）染色质变短、变粗，随即分布在细胞核区。染色质变短、变粗，随即分布在细胞核区。（4）中期）中期(MI期期)染色体成染色体成对对排列在赤道板上，并可排列在赤道板上，并可隐约见隐约见到到纺纺锤锤体。体。（5）后期）后期（AnaI期）期）同源染色体开始分开，但两同源染色体开始分开，但两组组染色体分开的距离染色体分开的距离不大。不大。（6）末期）末期(TelI期期)同源染色体分开的距离加大，形成极体的一同源染色体分开的距离加大，形成极体的一组染色体向质膜靠近，但此时极体尚未排出。组染色体向质膜靠近，但此时极体尚未排出。(7)中期中期(M期期)卵周隙中可见到极体，与相邻的胞质中可见卵周隙中可见到极体，与相邻的胞质中可见到整齐排列的染色体。与到整齐排列的染色体。与M期的染色体相比，期的染色体相比，M期的染色体小而致密。期的染色体小而致密。3.受精和胚胎发育潜能的评定：是评定卵母细受精和胚胎发育潜能的评定：是评定卵母细胞体外成熟方法最为重要的一项指标。胞体外成熟方法最为重要的一项指标。体外受精后的受精卵（分）裂率体外受精后的受精卵（分）裂率体外培养的胚胎发育率体外培养的胚胎发育率可用卵母细胞可用卵母细胞成熟卵母细胞成熟卵母细胞第三节第三节 体外受精的方法体外受精的方法1.配子的来源配子的来源（1）卵子）卵子l输卵管卵输卵管卵l卵泡卵卵泡卵（2）精子）精子l体内获能的精子体内获能的精子l体外获能的精子体外获能的精子2.精子制备的方法：精子制备的方法：（1）悬浮法：是根据精子运动上游的特性而将）悬浮法：是根据精子运动上游的特性而将高活力的精子与死精子以及其他精浆成分分开。高活力的精子与死精子以及其他精浆成分分开。将精液置于含有将精液置于含有11.5ml获能液或受精液的试管获能液或受精液的试管底部，在培养箱中孵育底部，在培养箱中孵育1030min，吸取上层液，吸取上层液体，然后离心洗涤体，然后离心洗涤12次，即可获得高活力的洁次，即可获得高活力的洁净精子。净精子。优缺点：适用于精子活力较差的精液，但是精子优缺点：适用于精子活力较差的精液，但是精子的可利用率则大大降低。的可利用率则大大降低。（2）玻璃棉过滤：采用玻璃柱层过滤分离，可）玻璃棉过滤：采用玻璃柱层过滤分离，可有效的出去品质较差精液中的死精子。有效的出去品质较差精液中的死精子。优缺点：制备时间较短，但是器材来源和成本较优缺点：制备时间较短，但是器材来源和成本较高，未广泛应用。高，未广泛应用。（3）哌可密度梯度离心：根据形态正常的精子密）哌可密度梯度离心：根据形态正常的精子密度高于异常，经平衡离心后，形态正常的精子将度高于异常，经平衡离心后，形态正常的精子将聚集于高密度的哌可区域，从而分离得到高收精聚集于高密度的哌可区域，从而分离得到高收精力的正常精子。常用哌可密度梯度为力的正常精子。常用哌可密度梯度为30%和和45%，平衡离心，平衡离心10min(300g)。优缺点：可分离高质量的精子，且精子的利用率优缺点：可分离高质量的精子，且精子的利用率较高，但是精子体外受精结果受哌可质量的影响较高，但是精子体外受精结果受哌可质量的影响（4）离心洗涤法：取）离心洗涤法：取0.10.2ml的精液置于离心的精液置于离心管中，然后加入管中，然后加入510ml的获能液或受精液，离心的获能液或受精液，离心5min(300g)，去掉上清液后，再加入，去掉上清液后，再加入510ml的获的获能液或受精液离心洗涤一次，即可用于受精能液或受精液离心洗涤一次，即可用于受精优缺点：简单，精子利用率高，但对精子没有分优缺点：简单，精子利用率高，但对精子没有分选作用，不宜用于精子活力差和受精力较低的精选作用，不宜用于精子活力差和受精力较低的精液。液。3.精子获能处理精子获能处理精子获能过程：在雌性生殖道分泌的某些物质精子获能过程：在雌性生殖道分泌的某些物质（如淀粉酶）以及雌激素的作用下，使与精子（如淀粉酶）以及雌激素的作用下，使与精子顶体结合的去能因子失去或失活而使精子得以顶体结合的去能因子失去或失活而使精子得以获能。其结果可以引起膜的通透性增加，钙离获能。其结果可以引起膜的通透性增加，钙离子进入精子内部，激活腺苷酸环化酶，抑制磷子进入精子内部，激活腺苷酸环化酶，抑制磷酸二酯酶，诱发酸二酯酶，诱发cAMF的浓度升高，进而导致的浓度升高，进而导致膜蛋白重新分布，使膜的稳定性进一步下降。膜蛋白重新分布，使膜的稳定性进一步下降。常用方法：常用方法：（1）与血清白蛋白的溶液长时间孵育：可除）与血清白蛋白的溶液长时间孵育：可除去精子质膜中的部分胆固醇和锌离子，降低去精子质膜中的部分胆固醇和锌离子，降低胆固醇在精子质膜中的比例，进而改变精子胆固醇在精子质膜中的比例，进而改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。质膜的稳定性，导致精子获能。优缺点：时间较长，且诱发精子获能的作用优缺点：时间较长，且诱发精子获能的作用不强，目前只作为精子获能的一种辅助手段。不强，目前只作为精子获能的一种辅助手段。（2）与含有卵泡液的培养液进行孵育：卵泡）与含有卵泡液的培养液进行孵育：卵泡液中含有血清的大分子物质，且含有诱发精子液中含有血清的大分子物质，且含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故可用此方法进行获获能和顶体反应的因子，故可用此方法进行获能处理。能处理。（3）使用钙离子载体：其能直接诱发钙离子）使用钙离子载体：其能直接诱发钙离子进入精子细胞内，提高细胞内的钙离子浓度，进入精子细胞内，提高细胞内的钙离子浓度，从而导致精子的获能。常用的载体为从而导致精子的获能。常用的载体为A23187。（啮齿动物、家兔和猪）（啮齿动物、家兔和猪）（4）使用肝素：肝素是一种高度硫酸化的氨）使用肝素：肝素是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，与精子结合后，引起钙离子基多糖类化合物，与精子结合后，引起钙离子进入精子细胞内部而导致精子获能。进入精子细胞内部而导致精子获能。（牛、羊）（牛、羊）4.体外受精的方式体外受精的方式有四种组合：有四种组合：（1）输卵管卵子体内获能精子）输卵管卵子体内获能精子（2）输卵管卵子体外获能精子）输卵管卵子体外获能精子（3）体外培养的卵泡卵体内获能精子）体外培养的卵泡卵体内获能精子（4）体外培养的卵泡卵体外获能精子）体外培养的卵泡卵体外获能精子5.体外受精的培养系统体外受精的培养系统（1）.微滴法：在塑料培养皿中用受精液做微滴法：在塑料培养皿中用受精液做成成2040 l的微滴，上覆盖石蜡油的微滴，上覆盖石蜡油，每滴放入，每滴放入体外成熟的卵母细胞体外成熟的卵母细胞1020枚及获能精子（枚及获能精子（1.01.5 l）*106个个/ml，在培养箱中孵育，在培养箱中孵育624h。优点：受精液及精液的用量均较少，体外受优点：受精液及精液的用量均较少，体外受精效果好；精效果好；缺点：受精结果易受石蜡油影响，操作相对缺点：受精结果易受石蜡油影响，操作相对繁琐，成本较高。繁琐，成本较高。（2）四孔培养板法：没空加入）四孔培养板法：没空加入500 l受精液受精液和和100150枚体外成熟卵母细胞，然后加入获枚体外成熟卵母细胞，然后加入获能处理的精子能处理的精子1.01.5 l）*106个个/ml，在培，在培养箱中孵育养箱中孵育624h。优点：操作简单，不受石蜡油的影响优点：操作简单，不受石蜡油的影响缺点：精子的利用率相对较低，体外受精结缺点：精子的利用率相对较低，体外受精结果不稳定。果不稳定。二、辅助受精技术二、辅助受精技术1.概念概念 是是借借助助于于显显微微操操作作仪仪使使精精子子和和卵卵子子在在体体外外完完成成受受精过程的技术，又称显微受精。精过程的技术，又称显微受精。2.方法方法 （1）透明带修饰法）透明带修饰法 是是指指运运用用物物理理或或化化学学方方法法对对卵卵母母细细胞胞的的透透明明带带进进行行打打孔孔、部部分分切切除除或或撕撕开开缺缺口口，为为精精子子进进入入卵卵黄黄周周隙隙打打开开通通道道，然然后后把把卵卵子子与与一一定定浓浓度度的的精精子子共共培培养养以完成受精过程。目前，仅在小鼠上取得成功。以完成受精过程。目前，仅在小鼠上取得成功。优点：对卵子损伤小优点：对卵子损伤小 缺缺点点：对对于于靠靠透透明明带带反反应应阻阻止止多多精精入入卵卵的的动动物物易易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。造成多精子受精，影响胚胎继续发育。（2）精子注入法）精子注入法 是指利用显微操作仪直接把精子注入卵黄是指利用显微操作仪直接把精子注入卵黄周隙或卵母细胞的胞质中，前者称为透明带周隙或卵母细胞的胞质中，前者称为透明带下授精（下授精（SUZI），），后者称为胞质内精子注射后者称为胞质内精子注射（ICSI）。）。l透明带下授精（透明带下授精（SUZI）优点：对卵母细胞损伤小优点：对卵母细胞损伤小 缺点：多精入卵制约其发展缺点：多精入卵制约其发展SUZI对注入的精子有严格要求：对注入的精子有严格要求：具有活力且已发生顶体反应的精子只能注具有活力且已发生顶体反应的精子只能注入入1个，没有发生顶体反应的精子，注入数目个，没有发生顶体反应的精子，注入数目可加大。可加大。l胞质内精子注射（胞质内精子注射（ICSI）优点：对精子活力、形态和顶体反应没有特殊要优点：对精子活力、形态和顶体反应没有特殊要求，只需注入求，只需注入1个精子。个精子。缺点：对卵母细胞损伤大。缺点：对卵母细胞损伤大。三、体外受精效果的判断方法三、体外受精效果的判断方法1.固定染色法：将体外受精的卵母细胞，用固定染色法：将体外受精的卵母细胞，用0.1%的透明质酸酶去掉周围的卵丘细胞，然后的透明质酸酶去掉周围的卵丘细胞，然后在醋酸酒精中固定在醋酸酒精中固定2428h，用含，用含0.1%间苯酚兰间苯酚兰溶液染色观察，有原核形成或发生卵裂者可初溶液染色观察，有原核形成或发生卵裂者可初步判断为培养成功；步判断为培养成功；2.体外培养：受精正常与否，主要体现在其随体外培养：受精正常与否，主要体现在其随后的胚胎发育能力，因此可通过胚胎发育潜力后的胚胎发育能力，因此可通过胚胎发育潜力进行评定。牛卵母细胞：受精后进行评定。牛卵母细胞：受精后48h可检查分可检查分裂到裂到28细胞的比例；体外培养细胞的比例；体外培养7d后检查囊胚后检查囊胚发育率；发育率；9d后检查囊胚孵化率。后检查囊胚孵化率。四、我国体外受精的成功举例四、我国体外受精的成功举例1.内蒙古大学旭日干院士在留学期间，于内蒙古大学旭日干院士在留学期间，于1984年年3月月9日培育出世界上第一例日培育出世界上第一例“试管试管山羊山羊”。2.内蒙古大学实验动物研究中心于内蒙古大学实验动物研究中心于1989年年3月月10日生产出国内首例日生产出国内首例“试管绵羊试管绵羊”。五、体外受精技术存在的问题五、体外受精技术存在的问题 1.体外受精技术的效率有待提高。体外受精技术的效率有待提高。（1）体外受精卵培养至桑椹胚及囊胚的发育率）体外受精卵培养至桑椹胚及囊胚的发育率 较低较低（2）胚胎移植后产仔率很低）胚胎移植后产仔率很低 2.体外培养系统有待进一步完善。体外培养系统有待进一步完善。3.基础理论研究有待加强。基础理论研究有待加强。采集良种母牛的卵母细胞采集良种母牛的卵母细胞卵母细胞的体外培养卵母细胞的体外培养采集良种公牛精子采集良种公牛精子精子体外获能精子体外获能体外受精体外受精良种牛体外受精胚胎良种牛体外受精胚胎胚胎移植胚胎移植受体牛受体牛良种犊牛良种犊牛成熟期牛成熟期牛屠宰加工厂屠宰加工厂市场市场采集卵巢中的卵母细胞采集卵巢中的卵母细胞“试试管管牛牛”工工厂厂化化生生产产的的技技术术流流程程图图谢谢！谢谢！The end