第六章动物人工繁殖.ppt

第六章动物人工繁殖生物科学与技术学院动物人工繁殖动物人工繁殖动物人工繁殖技术包括有性生殖和无性生殖两条途径。动物人工繁殖技术包括有性生殖和无性生殖两条途径。前者的关键技术是人工受精与体外受精，后者的关键技前者的关键技术是人工受精与体外受精，后者的关键技术是核移植，两者都涉及胚胎培养与移植。动物人工繁术是核移植，两者都涉及胚胎培养与移植。动物人工繁殖的基础是殖的基础是胚胎工程胚胎工程。胚胎工程是通过在生殖细胞、胚胎细胞水平上的显微操胚胎工程是通过在生殖细胞、胚胎细胞水平上的显微操作技术，来定向控制、改造和创造新遗传性状的技术，作技术，来定向控制、改造和创造新遗传性状的技术，是动物细胞工程的拓展和延伸，又称发育工程是动物细胞工程的拓展和延伸，又称发育工程（revelopmental technology）。）。胚胎工程的发展历史胚胎工程的发展历史1891年，英国人希普首次在兔子身上成功的进行了核移植。20世纪30年代，陆续在鼠、兔、羊、猪、牛和马进行胚胎移植实验，相继获得成功。20世纪60年代以来，随着胚胎移植技术的不断成熟和规范化，以及一系列新方法的建立，胚胎工程进展迅速，以日本、澳大利亚和加拿大发展最快。1987年，美国用家猫做代理母亲，移植了一只濒临灭绝的珍贵猫的受精卵，成功获得试管猫。我国自20世纪70年代开始发展该技术，进展也较迅速，但与世界先进国家相比，还存在较大差距。1977年，英国科学家首次创造了世界上第一个试管婴儿。体外受精和胚胎移植技术胚胎移植的发育胚胎移植的发育早期胚胎发育的三个阶段：1）桑椹胚：卵裂球分裂到16-32细胞时，成为一紧密的细胞团，称为桑椹胚。在2-8个细胞时，每个细胞均具有全能性。2）囊胚：在胚胎内形成空腔，逐渐变大成为囊胚腔，此时一端细胞个体较大，形成密集（三层）的内细胞团（ICM），将来发育成胚体。另一端只有环透明带一层细胞，称滋养层，将来发育成胚膜。3）原肠胚：囊胚进一步发育，内细胞团外的滋养层退化，内细胞团裸出形成胚盘，在胚盘下方衍生出内胚层，此时胚胎称原肠胚。胚胎工程胚胎工程-体外受精（体外受精（IVFIVF）（第一步骤）（第一步骤）精子获能精子获能是精子获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段。精子获能分为体内获能与体外获能体内获能：体内获能：精子在附睾内已经获得了受精能力，但由附睾分泌的一种物质附于精子表面，抑制了他的受精能力，这种物质被称为去能因子。去能因子是顶体酶的抑制剂。体外获能：体外获能：精子通过用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能的过程。2、卵子回收及成熟培养3、卵子和精子的体外受精（in vitro fertilization IVF）受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至囊胚期阶段4、受精卵的体外发育及体外培养荷尔蒙FSH(促卵泡激素)人工环境下通过药物（FSH）刺激卵巢分泌产生卵细胞超数排卵：超数排卵：在母畜发情周期的适当时间用人工方法促使其有更多的卵泡发育、成熟、排卵的一项技术。方法是注射促性腺激素，如孕酮、雌二醇、促卵泡激素、促黄体激素、促性腺激素释放激素等。LH是黄体生成素，HCG是促绒毛性腺激素超排卵处理的母体在停药后24-48小时后可进行人工受精，以后约在3-7天从母体采集受精卵或胚胎。体外受精生殖核胚囊胚胎的采集、鉴别胚胎的采集、鉴别 正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。精子获能胚胎移植同步发情同步发情 指使供体和受体同步发情，即处于相同的生殖周期。胚胎移植胚胎移植 外科手术法或非手术法胚胎冷冻保存技术：胚胎冷冻保存技术：在冷冻细胞的基础上发展起来的，包括精子、卵母细胞和早期胚体的冷冻保存。1、短期临时保存：指将暂时不使用的胚胎在37培养液中保存，或在活体同种或异种动物的输卵管内保存1-2天。也可将胚胎置0-4低温下保存2-3天。2、长期冷冻保存：有仪器程序逐步降温冷冻和徒手操作的快速玻璃化冷冻。前者利用冷冻仪按编程由室温逐步降温至零下196（液氮）保存。所用冷冻剂一般为二甲基亚砜、氨基酸、甘油等。后者是直接加入高浓度的抗冻液（玻璃化冷冻保护液）急速冷冻，有液体转化为透明胶状固体。试管婴儿 1977年7月25号世界上第一例试管婴儿路易丝.布朗在英国呱呱坠地；1978年，印度创造了世界上第二例试管婴儿。至1987年，有6000多个，19961997年间美国就有42463个。我国大陆也于1988年3月10号，在北京医科大学附属第一医院妇产科手术室诞生了第一个试管婴儿郑萌珠。培育试管婴儿，包括体外受精（invitro fertiliztion）和胚胎移植（embryo transfer，ET）两个步骤。即在试管中将精子与卵结合受精，25天后，把发育到8细胞期的胚胎移植到子宫中去，发育成长，直至足月分娩。（胚胎发育的第712天，即原肠化阶段，是人生最关键的时刻）。此项技术主要适用于各种女性原因的不孕、免疫性不孕、轻度少精症等。试管婴儿的三个阶段：试管婴儿的三个阶段：第一代试管婴儿：最早成功的常规技术。第二代试管婴儿：采用显微受精技术将单个精子注射进卵细胞内使其受精。适用于男性原因的不孕，如少精、弱精等。1996年，我国第二代试管婴儿（ICSI）在中山医科大学获得成功。第三代试管婴儿：对体外受精的胚胎取出细胞进行遗传学诊断后再行胚胎移植。我国第三代试管婴儿（PGD）在中山医科大学获得成功。2000年3月，我国首例超快速冷冻胚胎移植的试管婴儿在湖南医科大学人类生殖工程研究室诞生，标志着我国在该领域的研究已进入世界先进行列。进一步，美国、日本、台湾正研制多胞胎和“人造子宫”以完成怀孕全过程。（一）克隆概念的由来（二）克隆研究的主要内容（三）克隆的理论基础及发展史（四）克隆的技术方法及制备程序（五）克隆技术的应用及意义（六）克隆技术存在的问题（七）惊世骇俗的计划“克隆人”生物克隆技术生物克隆技术克隆概念的由来克隆概念的由来“一个细菌一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗；人们剪下植物枝条，扦插到土里，不久就会发芽，长出新的植株，这些植株是遗传物质组成完全相同的植株，这就是克隆克隆”。凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖，无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”。在动物界也有无性繁殖，不过多见于非脊椎动物，如原生动物的分裂繁殖、尾索类动物的出芽生殖等。但对于高级动物，在自然条件下，一般只能进行有性繁殖，要使其进行无性繁殖，科学家必须经过一系列复杂的操作程序。如用未分化的胚胎细胞进行核移植称为胚胎细胞克隆（embryonic-cell-cloning）；用已分化的体细胞（即非生殖细胞）。进行核移植称之体细胞克隆（somatic-cell-cloning）。克隆研究的主要内容克隆研究的主要内容 1 供体细胞的来源和特性供体细胞的来源和特性胚胎细胞发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞；胚胎干细胞来自胚胎内细胞团；成年动物体细胞 2 细胞质受体的来源和特性细胞质受体的来源和特性具有全能性的细胞核是否具有重编程的能力，主要取决于胞质的性质。成熟卵母细胞是目前公认的成功受体。3 重构胚核质适应机理重构胚核质适应机理核质间细胞周期是否同期化、核重编程的能力如何和核质相适应的机制等。4 克隆技术支持体系的研究克隆技术支持体系的研究包括供核细胞和胞质受体的采集技术和培养体系的研究；核移植操作技术及有关设备的研究。5 重构胚胎的体内和体外培养技术重构胚胎的体内和体外培养技术6 克隆技术的使用化研究克隆技术的使用化研究克隆的理论基础及发展史克隆的理论基础及发展史1932年，英国作家赫胥黎的小说美丽新世界中预言人类科技发展到足以复制自身之时，便是世界陷入混乱之日。1938年，德国胚胎学家提出动物克隆的设想：即从发育后期的胚胎中取出细胞核，将其移植到一个卵子中去，使其繁殖。1950年，首次成功地冷藏牛的精于，稍后与母牛的卵子进行了人工授精。1951年，科学家培育出第一个人体肿瘤细胞系。1952年，皮科克医生宣称他找到了370多种不用精子生殖海胆的方法。1952年，第一次进行动物克隆，罗伯特布瑞格和托马斯金对小蝌蚪的细胞核进行无性繁殖。1953年，沃森和克里克发表了震惊世界的千字论文，揭开了生命遗传物质即DNA的双螺旋结构。1970年，英国科学家约翰戈德和同事利用经过培养的成年青蛙表皮细胞核克隆成功成年青蛙。1976年，美国设立“重组DNA管理委员会”，负责管理人体基因工程。1977年，数百名美国人来到美国国家科学院举行示威，其口号是：“我们不要克隆”，“不要碰我的基因”!这是第一次对生物技术提出抗议。1978年，由英国科学家史德彼逑和爱德华兹共同培育出第一个试管婴儿-路易斯。1981年，日内瓦大学的研究人员利用胚胎移植技术培育出正常的老鼠。1983年，第一次成功地进行了人类胚胎由一个母体向另一个母体的转移。1986年，作为人工授精试验的志愿者怀特海德怀胎十月产下一女婴，但当她提出要抚养“自己的孩子”时，遭到了拒绝。1986年，英国科学家首次利用胚胎细胞细胞核移植技术克隆出一头羊。1988年，格雷纳德生物公司成功地利用改进型的细胞核移植技术来克隆奶牛。1991年，美国国家卫生与医学博物馆宣布，打算复制林肯身体组织样本。1991年，文特尔提出要对人体大脑中发现的337个基因拥有专利保护权和所有权。1993年，电影株罗纪公园“克隆”了一大堆恐龙。1994年，美国利用牛胚胎细胞核移植技术克隆牛成功。1994年，中国利用山羊胚胎细胞核移植技术克隆山羊成功。1996年，一部令人迷惑的电视动画片蜘蛛人创造了一个克隆蜘蛛人的英雄形象。1997年，英国胚胎学家维尔穆特和他的同事宣称用母羊的乳腺细胞克隆成功了第一只克隆羊。开创了成年哺乳动物克隆的先河。1998年，克隆羊“多利”当上了妈妈，生下了一只名叫“邦尼”的小羊。动物克隆研究的三个阶段动物克隆研究的三个阶段 1、胚胎细胞克隆阶段1981年，IIImensee和Hoppe报道他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为供核体，直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中，重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫，获得了克隆小鼠，这是在哺乳类第一次用胚胎细胞进行核移植获得成功。1983年，美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986年，英国的Willadsen用绵羊的816个细胞阶段的胚胎细胞作供体进行核移植，首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。以上这些克隆实验中所用供核细胞均属发育至不同阶段的胚胎细胞。2、同种体细胞体细胞克隆阶段1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。1998年5月，美国科学家Robl的研究组利用胎儿成纤维细胞克隆出了3头牛，而且携带了转移的基因。1998年7月，日本科学家Dato等用牛的输卵管细胞克隆出了8头小牛。1998年7月，美国夏威夷大学Yanagimachi领导的研究小组获得小鼠卵丘细胞进行克隆再克隆小鼠成功的结果。1999年6月，Yanagimachi的研究小组又利用成年雄性小鼠尾尖的成纤维细胞为供核体细胞成功地克隆出了一只雄性小鼠，这也是第一只供体细胞不是来源于雌性动物被克隆的动物。此后，同种体细胞克隆山羊、猪、猫和兔也都相继诞生。我国体细胞克隆山羊和克隆牛不论雌的还是雄的也都已获得成功。在同种体细胞克隆研究中。所用供核体细胞为高度分化的体细胞。3、异种体细胞体细胞克隆阶段异种体细胞克隆是将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。由于濒危物种的个体数量少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，这就促使科学家提出了异种克隆的设想。异种克隆研究面临着许多问题，如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育？异种核质能否相容？异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。1999年，中科院动物所实验室将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞移植到去核（遗传生物）日本大耳白兔卵母细胞中成功地构建异种重构胚，体外培养获得孵化囊胚。2001年将重构胚移植寄母子宫，获得了着床的重大进展。2002年，不仅异种重构胚能够在异种寄母子宫中着床，而且还能发育，这是异种克隆大熊猫研究中攻克的最后一个难题中的最新进展。美国（美国（1952年前）年前）英国（英国（1963年）年）中国（中国（1970年前后）年前后）英国英国 第一阶段第一阶段 第二阶段第二阶段 第三阶段第三阶段芬多席特白面羊（芬多席特白面羊（6岁）岁）苏格兰黑面羊苏格兰黑面羊乳腺上皮细胞（冻存乳腺上皮细胞（冻存3个月）个月）卵细胞卵细胞细胞核细胞核 取出细胞核取出细胞核去核卵去核卵 换核卵细胞换核卵细胞 体外培养体外培养代孕母羊代孕母羊“多莉多莉”（白面羊的复制品）（白面羊的复制品）动物克隆史上的丰碑动物克隆史上的丰碑“多莉多莉”的诞生（体细胞的克隆）的诞生（体细胞的克隆）Wilmut克隆克隆“多莉多莉”的生物学意义的生物学意义n具有丰富的保存卵细胞和其它细胞的经验具有丰富的保存卵细胞和其它细胞的经验n掌握了熟练的核移植等关键性技术掌握了熟练的核移植等关键性技术n对受精卵进行了电刺激处理，起激活作用对受精卵进行了电刺激处理，起激活作用n采用细胞同步化技术，使受体和供体细胞均处在细胞周期的采用细胞同步化技术，使受体和供体细胞均处在细胞周期的G0期期n已经成功的进行了先期克隆实验已经成功的进行了先期克隆实验克隆的技术方法克隆的技术方法主要指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖技术。细胞核移植技术：是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细操作技术。包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植两种。通过此技术可获得核质杂种。（1）受体细胞的去核：受体为成熟的卵细胞。盲吸去核法：用细胞骨架松弛剂（细胞松弛素或秋水仙素）处理卵母细胞，固定卵母细胞，吸管刺入透明带，吸取核轻轻拉出透明带，完成卵母细胞去核。功能去核法：通过紫外照射或者激光照射使染色体失活而达到去核的目的。化学诱导去核法：用脱羰秋水仙素处理减数分裂2期的卵母细胞使其排放第二极体。细胞核移植的技术要点细胞核移植的技术要点第二极体：动物的卵原细胞减数第一次分裂结束形成的两个子细胞中的大细胞叫次级卵母细胞，小的叫第一极体（1个）；减数第二次分裂完形成的4个子细胞中那1个大细胞叫卵细胞，3个小的叫第二极体（3个）。（2）供体细胞的准备：供体细胞的准备：供体通常选用胚胎细胞（发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞）和胚胎干细胞（来自胚胎内细胞团）以及成年动物体细胞。供体细胞通常采用处于G0期的细胞。G0期细胞又称为“静止细胞”，“休止细胞”，其适合在适宜的条件下刺激进入增殖状态。血清“饥饿”法能够获得G0期的细胞。血清血清“饥饿饥饿”法法如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？血清血清“饥饿法饥饿法”使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段，使结合在基因使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段，使结合在基因（DNADNA）上的调控蛋白脱落下来，细胞进入重新编程过程（）上的调控蛋白脱落下来，细胞进入重新编程过程（reprogram,remodel ）。）。（3）细胞移核：）细胞移核：选择合适的微吸管穿过透明带注入去核卵母细胞中，避免移入过多的细胞质、控制温度，短时间内完成。还可用供核细胞和卵母细胞的融合实现核转移。直接注射法透明带注射法直接注射法（4）重组胚激活）重组胚激活激活是通过某种刺激使卵子内钙离子浓度升高，给卵一个启动信号，促使细胞周期的恢复。电激活：通过电流刺激，使重组胚的核和质进行融合，从而激活重组胚。化学激活：使用化学物质（7%乙醇，离子霉素，钙离子载体等）刺激重组胚。（5）重组胚的培养和移植重组胚可以采用体外培养和体内培养两种方式。体外培养是将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚移植入同期的受体中继续发育的过程。（6）核移植后代的鉴定常用分子生物学方法根据细胞核的来源不同，一般分为胚胎细胞核移植法、胚胎干细胞移植法、胎根据细胞核的来源不同，一般分为胚胎细胞核移植法、胚胎干细胞移植法、胎儿成纤维细胞移植法和体细胞核移植法，其基本程序大体一致。儿成纤维细胞移植法和体细胞核移植法，其基本程序大体一致。克隆动物的制备程序1）胚胎细胞核移植法：将未着床的早期胚胎分散成单个细胞，然后分别取核进行核移植，发育成胚胎后再行胚胎移植、发育分娩。也可通过细胞融合法将供体核移入去核卵的方法。2）胚胎干细胞移植：首先制作胚胎干细胞系，再进行细胞核移植，可克隆出更多的动物个体。此法在小鼠较为成熟。3）胎儿成纤维细胞核移植：从早期胎儿分离成纤维细胞进行核移植。4）体细胞克隆技术：1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。荣登Science杂志评出的1997年世界十大科技成就之首。核供体动物的选择与细胞核的获得核受体动物的选择与细胞核的移出供体核的移入及原核的取出胚泡的体外试管培养代母的选择与胚泡移入子宫克隆动物的体内发育与出生动物克隆的过程动物克隆的过程爪爪蟾蟾的的核核移移植植实实验验1958年年年年John GurdonJohn Gurdon和和和和MachineerMachineer克隆技术的实践应用及意义遗传素质完全一致的克隆动物将有利于开展对动物（人）生长发育、衰老和疾病健康等机理的研究拯救濒临灭绝的动物（异种克隆、借腹怀胎），保护基因资源大量快速扩大和繁殖高经济性状（品质优良）的牲畜（禽）克隆转基因动物，创建活的药厂，提供廉价的药品和保健品提高临床医学的治疗手段（提供易被接受的移植器官）解决不育症，作为生育的辅助措施“克隆人”DNA大量拷贝（DNA 克隆）克隆技术最重要的用途体现在两方面：一是大规模繁殖良种动物，包括转基因动物；二是克隆濒危动物。克隆技术存在的问题技术尚不成熟，成本高、效率及成活率低移植434只成体绵羊的乳腺上皮细胞核至相同数量的绵羊卵子中，产生了277个融合细胞（成功率为63.8%）。将此融合细胞移入母羊输卵管成功247个（89.2%），只获得29个发育到桑椹期或囊胚期的胚胎11.7%）。移植到13只代孕母羊的子宫中，仅有一头羊怀胎（7.7%）最后产下一只小羊“多莉”(总成功率为0.23%)。存在严重的生理或免疫缺陷克隆动物的寿命问题，克隆动物存在严重的早衰问题，夭折率高达75%。（多莉DNA遭损伤，明显衰老，端粒比同龄羊缩短约20%，与6岁供体核母羊相似）惊世骇俗的计划“克隆人”自从2003年邪教组织雷尔教派的科学家布里吉特布瓦瑟利耶声称已“培育出世界第一个克隆婴儿”后，国际舆论一直沸沸扬扬，科学界则始终持质疑的态度。多数西方国家政府，领袖以及宗教界人士纷纷发表声明反对克隆人，也有不少国家制定了禁止克隆人的法令。在这种情况下，依然在国际社会还有人要进行克隆人。1998年新年伊始，美国一位物理学家公开向新闻媒体宣布了他自己辉煌的“克隆人”计划。此人名叫理查德.锡德，70岁，哈佛大学教授。意大利胚胎学家安蒂诺里和美国一女科学家，已经征集了200多位女性在公海的一只游船上进行克隆人的试验。英国和韩国已于1998年用人的体细胞克隆成功人的胚胎，由于法律约束又销毁了。维尔穆特1999年月初在英国宣布他领导的科研小组正着手实施克隆人体胚胎的计划。1999年6月，美国马萨诸州成功克隆出人的胚胎。2001年11月25日美国先进细胞技术公司（ACT）报道了利用克隆技术培育出人类早期胚胎（4、6细胞期），这个消息一瞬间就传遍了世界，在全球引发轩然大波，激起了各国争议，因为它离克隆人只有一步之遥。三位“疯子科学家”执意要开始克隆人美国“克隆基金”主任布瓦瑟利耶、肯塔基州列克星顿大学激素学院院长扎沃斯和意大利科学家安提诺里。是克隆人的坚定推崇者，因此被学术界称为“科学疯子”。三位“疯子科学家”最近在美国科学院的研讨会上暗示，他们最近几周将开始实施克隆人的计划，克隆人可能明年就会问世。由于三人大肆鼓吹其克隆人计划，结果招致了美国国家科学院大厅内的一场对骂。克隆人的问题谁生他？鉴于这个孩子是人类试验品的现实，这位母亲起到的也仅仅是一个生育机或孵化器的作用。这对母子之间的感情，在孩子出生前就被异化了。这位母亲自然也就被剥夺了享受正常亲情的权利，更谈不到亲自抚育这个孩子了。因此，母爱将是克隆人终生享受不到的奢侈品。谁养他？科学创造了他，那么养育他的权利自然落到了科学家以及用金钱支持这些科学实验的人身上。他大部分的生命将在实验室里度过，他将要面对的是无数未知的凶险和危机以及比这些还要可怕的归属感的天然缺失。谁爱他？谁对他投注真诚的情感？当然，克隆人的生命将比地球上任何一个生命都要值钱，所有科学家都会竭尽全力挽救他的生命，心理学家们会对他的任何情绪异常趋之若鹜。至于他心中的恐惧和孤独，注定了无人能分享。谁嫁他？哪个异性会发自内心地爱上一个整天被人摆布的实验品？肯定会有些人借机扬名作把秀，或者由科学家做主为克隆人成双配对。这样的婚姻先天地也就具备了实验性质，于是，对于克隆人来说，爱情比母爱更没有保证。大量转基因动物、植物和微生物的出现，有可能破坏大自然的生态平衡造成新的难以控制的环境污染；胚胎修饰、借腹怀胎、器官移植将打破传统的习俗，是对社会伦理提出的严重挑战，是人类面临的精神方面的难题；由于政治、经济和某些心理上的因素，世界上有可能出现战争狂人，要防止他们用生物技术去制造灭绝人寰的生物战争。胚胎分割技术胚胎分割l胚胎分割:（Embryo bisection）借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。受精卵的发育过程受精卵的发育过程囊胚囊胚桑椹胚桑椹胚卵裂球卵裂球内细胞团主要仪器设备胚胎分割所需要的仪器设备为实体显微镜和显微操作仪。胚胎分割所需要的仪器设备为实体显微镜和显微操作仪。胚胎分割所需要的仪器设备为实体显微镜和显微操作仪。胚胎分割所需要的仪器设备为实体显微镜和显微操作仪。胚胎分割基本操作程序1、胚胎预处理：为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短期处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。2、胚胎的选择胚胎分割的理论基础：胚胎分割的理论基础：细胞具有全能性细胞具有全能性发育良好的发育良好的,形态正常的形态正常的桑椹胚或囊胚桑椹胚或囊胚3、胚胎分割方法机械分割法：在显微操作仪下，一个臂固定吸附住胚胎，另一个臂用显微玻璃针摘除透明带，然后对裸露的胚胎进行切割，或者用显微手术刀直接将胚胎分割为2分胚胎、4分胚胎等。分割时要注意：要将分割时要注意：要将分割时要注意：要将分割时要注意：要将内细胞团均等分割内细胞团均等分割内细胞团均等分割内细胞团均等分割，若，若，若，若不均等分割会影响分割后胚胎的恢复和进一不均等分割会影响分割后胚胎的恢复和进一不均等分割会影响分割后胚胎的恢复和进一不均等分割会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。步发育。步发育。步发育。性别鉴定及胚胎分割性别鉴定及胚胎分割A：准备拟分割胚和空的透明带；B：用分割针拨开小孔；C：扩展开口；D：用吸管插入开口吸取卵囊球团；E：吸出胚胎F：用分割针等分切割胚胎G：切为二分胚H：将二分胚分别放入空透明带中二分胚胎分割二分胚胎分割4、分割胚的培养为提高分割胚移植的成功率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体并且在体内或直接在体外培养。早期胚胎切割后发育能力低，一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚，再从输卵管中回收胚胎，最后移植给受体。5、分割胚胎的保存胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存的基本概念：胚胎冷冻保存的基本概念：将胚胎贮存在将胚胎贮存在196196超低温下长期保存的方法。这是超低温下长期保存的方法。这是2020世记世记7070年代试验成功年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。胚胎冷冻保存的意义：u胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率；胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率；u长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；u便于国际间交流；便于国际间交流；u替代种畜引种。替代种畜引种。胚胎冷冻保存方法 常常规规冷冷冻冻法法：控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；同时避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。超超速速冷冷冻冻法法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。玻玻璃璃化化冷冷冻冻法法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。