lncRNA H19靶向miR-4735-3p激活NF-κB信号通路调控宫颈癌顺铂耐药.pdf

第5 2卷第4期第4 9 6页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.4 9 6A u g.2 0 2 3*青海省科技计划项目(N o.2 0 2 1-Z J-7 6 4)王烈宏,男,1 9 7 2年生,主任医师,E-m a i l:d o c t o r w l h 1 2 6.c o ml n c R NA H 1 9靶向m i R-4 7 3 5-3 p激活N F-B信号通路调控宫颈癌顺铂耐药*王烈宏,祁青玲,王乾印,高文君,王爱敏,曾 慧青海红十字医院妇科,西宁 8 1 0 0 9 9摘要:目的 揭示l n c R NA H 1 9调控宫颈癌细胞顺铂(D D P)耐药的作用及分子机制。方法 体外建立顺铂耐药的宫颈癌细胞株H e L a/D D P。q R T-P C R检测H 1 9和m i R-4 7 3 5-3 p的表达。C C K-8实验检测不同浓度D D P作用下细胞的增殖抑制率,计算I C5 0值。克隆形成实验评估细胞增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡率。W e s t e r nb l o t实验检测凋亡相关蛋白B c l-2、B a x和c-C a s p a s e 3(c-C a s p 3)及N F-B信号通路蛋白(p-I B/I B 和p-p 6 5/p 6 5)的表达。双荧光素酶报告基因实验和R NA交互沉降实验验证H 1 9和m i R-4 7 3 5-3 p之间的靶向关系。结果 H 1 9在H e L a/D D P细胞中高表达。敲低H 1 9增强H e L a/D D P对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。H 1 9能够与m i R-4 7 3 5-3 p靶向结合,敲低H 1 9上调H e L a/D D P细胞中m i R-4 7 3 5-3 p的表达。过表达m i R-4 7 3 5-3 p增强H e L a/D D P对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。抑制m i R-4 7 3 5-3 p能够逆转H 1 9敲低对H e L a/D D P顺铂敏感性的增强作用。敲低H 1 9通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p抑制p-I B 和p-p 6 5蛋白表达。结论 H 1 9通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p,抑制N F-B通路活性,增强H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性。关键词:宫颈癌;顺铂;l n c R NA H 1 9;m i R-4 7 3 5-3 p;N F-B信号通路中图分类号:R 7 3 7.3 3 D O I:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 1 0l n c R N AH 1 9A c t i v a t e sN F-BS i g n a l i n gP a t h w a yb yT a r g e t i n gm i R-4 7 3 5-3 pt oR e g u l a t eC i s p l a t i nR e s i s t a n c e i nC e r v i c a lC a n c e rW a n gL i e h o n g,Q iQ i n g l i n g,W a n gQ i a n y i ne t a lD e p a r t m e n t o fG y n e c o l o g y,Q i n g h a iR e dC r o s sH o s p i t a l,X i n i n g8 1 0 0 9 9,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T or e v e a l t h er o l ea n dm o l e c u l a rm e c h a n i s mo f l n c R NA H 1 9 i nr e g u l a t i n gc i s p l a t i nr e s i s t a n c e i nc e r-v i c a l c a n c e r c e l l s.M e t h o d s C i s p l a t i n-r e s i s t a n t c e r v i c a l c a n c e r c e l l l i n eH e L a/D D Pc e l l sw e r e e s t a b l i s h e di n v i t r o.T h e i n h i b i t i o nr a t eo f c e l l p r o l i f e r a t i o nu n d e r d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fD D Pw a sd e t e c t e db yC C K-8,a n d I C5 0v a l u ew a s c a l c u l a t e d.C e l l p r o l i f-e r a t i v ec a p a c i t yw a sa s s e s s e db yc o l o n y f o r m a t i o na s s a y.C e l l a p o p t o s i s r a t ew a sd e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r y.W e s t e r nb l o t a s s a yw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n so fa p o p t o s i s-r e l a t e dp r o t e i n sB-c e l l l y m p h o m a-2(B c l-2),B c l-2r e l a t e dXp r o t e i n(B a x),c-C a s p a s e 3(c-C a s p 3),a n dN F-Bs i g n a l i n gp a t h w a yp r o t e i n s(p-I B/I B a n dp-p 6 5/p 6 5).R e s u l t s l n c R NAH 1 9w a sh i g h l ye x-p r e s s e d i n H e L a/D D Pc e l l s.K n o c k d o w no fH 1 9e n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oc i s p l a t i na n dp r o m o t e da p o p t o-s i s.H 1 9 c o u l d t a r g e t m i R-4 7 3 5-3 p,k n o c k d o w n o f H 1 9 u p r e g u l a t e d t h e e x p r e s s i o n o f m i R-4 7 3 5-3 p i n H e L a/D D Pc e l l s.O v e r e x p r e s s i o no fm i R-4 7 3 5-3 pe n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oc i s p l a t i na n dp r o m o t e da p o p t o s i s.I n h i b i t i o no fm i R-4 7 3 5-3 pr e v e r s e dt h ep r o m o t i n ge f f e c t so fH 1 9k n o c k d o w no nH e L a/D D Pc i s p l a t i ns e n s i t i v i t y.K n o c k d o w no fH 1 9 i n h i b i-t e dp-I B a n dp-p 6 5p r o t e i ne x p r e s s i o nb yt a r g e t i n gm i R-4 7 3 5-3 p.C o n c l u s i o n H 1 9e n h a n c e dc i s p l a t i ns e n s i t i v i t yi n H e L a/D D Pc e l l sb yt a r g e t i n gm i R-4 7 3 5-3 pa n d i n h i b i t i n gN F-Bp a t h w a ya c t i v i t y.K e yw o r d s c e r v i c a l c a n c e r;c i s p l a t i n;l n c R NA H 1 9;m i R-4 7 3 5-5 p;N F-Bs i g n a l i n gp a t h w a y 宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一,尤其在发展中国家,宫颈癌的健康负担较为严重1。目前,宫颈癌的治疗主要有手术、化疗、放疗等综合性治疗手段,其中化疗是晚期或复发转移患者的常用治疗方法,但由于化疗耐药,往往导致化疗效果不佳2-3。因此,本研究拟从细胞水平探索宫颈癌的耐药机制,旨在为宫颈癌化疗耐药提供新思路。长链非编码R N A(l o n gn o n-c o d i n gR N A s,l n c R-N A s)是一类长度超过2 0 0n t的无蛋白编码能力的R N A分子4。多项证据已经阐明了l n c R N A s在肿瘤发生、进展和放化疗耐药中发挥重要调控作用5-6。l n c R N A A D AMT S 9-A S 2通 过m i R-2 2 3-3 p/N L R P 3轴调控胃癌的进 展和顺铂(D D P)耐药7;l n c R N AT L R 8-A S 1通过增强T L R 8m R N A的稳定性来促进卵巢癌的转移和化疗耐药8;l n c R N A M S T 1 P 2通过影响S I R T 1/p 5 3信号通路影响膀胱癌对顺铂治疗的耐药9。也有研究报道,l n c R N A H 1 9可能参与了肿瘤化疗耐药过程,如C a i等1 0发现,l n c R N A H 1 9是乳腺癌紫杉醇耐药的调控因子;T i a n等1 1报道,l n-c R N AH 1 9通过m i R-2 9 b-3 p/S T AT 3通路调控上皮性卵巢癌对顺铂的耐药。但目前关于H 1 9与宫颈癌化疗耐药的关系尚不明确。因此,本研究拟从细胞水平初步探索H 1 9对宫颈癌顺铂耐药的调控作用,并揭示调控潜在的分子机制,为解决转移性和复发性宫颈癌的化疗耐药问题提供参考。1 材料与方法1.1 顺铂耐药宫颈癌细胞(H e L a/D D P)培养H e L a细胞在含胎牛血清和双抗的R I P A 1 6 4 0完全培养液 中培养,培养 箱 条 件 设 置5%C O2和3 7。H e L a细胞经传代后,取生长密度在7 0%的细胞,使用含不同浓度顺铂(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1g/m L)的培养液进行耐药培养,约34d递增一个浓度,直至细胞稳定在含1g/m LD D P的培养液中,进行传代培养。1.2 细胞转染靶向H 1 9的s i R NA序列(s i-H 1 9)及无意 义s i R NA对照(s i-N C)、m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s及对照m i m i c sN C、m i R-4 7 3 5-3 p i n h i b i t o r及对照i n h i b i t o rN C,由上海中洪博元生物技术有限公司提供。收集生长状态良好的H e L a/D D P细胞,以21 05个细胞/孔,接种到6孔板,待细胞生长融合达7 0%时,将细胞培养液更换为不含血清的培养液,按照分组使用L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0转染对应质粒,转染46h后,更换含2 0%胎牛血清的完全培养液,继续培养2 4h后,q R T-P C R检测转染效率。1.3 实时荧光定量P C R(q R T-P C R)检测分别收集H e L a和H e L a/D D P细胞,加入T r-i z o l试剂裂解细胞,向细胞裂解液中加入适量氯仿,剧烈振荡后,冰上放置5m i n;4,1 2 0 0 0r/m i n离心1 5m i n,转移水相至新的离心管,然后加入等体积预冷的7 0%乙醇,颠倒混匀;将混合液加入已装有收集管的吸附柱RM中,4,1 2 0 0 0r/m i n离心3 0s,弃上清;洗涤R NA沉淀,冰上放置晾干后,向R NA沉淀中加入3 05 0L的无R N a s e水,溶解R NA。使用逆转录试剂盒进行逆转录反应,合成c D NA。采用S Y B RG r e e n法进行荧光定量P C R反应。实验用引物序列如下:l n c R NA H 1 9上游引物5 -C T G G G C AA C G GAG G T G T G-3,下 游 引 物5 -C T G G GAG G G T G T C T G C T T C-3;-a c t i n上 游 引物5-T G G C A C C C AG C A C AAT GAA-3,下游引物5 -C T AAG T C AT AG T C C G C C T AGAAG C A-3;m i R-4 7 3 5-3 p上 游 引 物5 -G T AT GAAAAG G T-G C T C AAAT T AGA C A-3,下 游 引 物5 -C AG T G-C G T G T C G T G GAG T-3;U 6上 游 引 物5 -C T C G-C T T C G G C AG C A C AT A-3,下 游 引 物5 -C GAA-T T T G C G T G T C AT C C T-3。1.4 C C K-8实验分别取H e L a和H e L a/D D P细胞,将细胞消化、计数,按7 0 0 0个细胞/孔接种于9 6孔板,置于培养箱中培养,待细胞贴壁后,分别更换含不同浓度D D P的培养液,以更换不含顺铂的培养液为空白对照组,2 4h后,更换相同的培养液,然后每孔加入1 0L的C C K-8试剂,继续培养2h。然后使用酶标仪在4 5 0n m波长处检测每孔的吸光度值,并计算I C5 0值。1.5 克隆形成评估细胞增殖能力收集生长状态良好的H e L a/D D P细胞,消化后,离心,用完全培养液重悬并吹打成单个细胞;将细胞分别以每皿5 0 0个细胞接种到培养皿中,置于培养箱中培养,培养2 4h后,更换含2 7.7 7g/m L顺铂的培养液,继续培养,培养至出现肉眼可见的克隆时,弃去培养液;使用P B S清洗细胞,加入适量4%多聚甲醛固定细胞,然后加入适量结晶紫溶液染色1 02 0m i n;用流水轻轻冲掉染色液,室温下风干;将培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,在低倍显微镜下计数大于1 0个细胞的克隆数。1.6 流式细胞术检测细胞凋亡收集生长状态良好的H e L a/D D P细胞,计数后接种至6孔板,用含2 7.7 7g/m L顺铂的培养液培养2 4h后,收获细胞;然后使用A n n e x i n-F I T C/P I细胞凋亡检测试剂盒中的B i n d i n gb u f f e r重悬细胞,再分别加入5L的A n n e x i n-F I T C和P I,室温下避光孵育1 5m i n后,流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。1.7 W e s t e r nb l o t检测收集细胞,加入R I P A裂解液充分裂解细胞后,离心,收集上清蛋白质,沸水中变性;取适量蛋白样品,进行S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后将目的蛋白转移至P V D F膜;5%脱脂奶粉封膜2h后,与一抗稀释液共孵育过夜,然后与二抗孵育2h;将膜放入超敏发光液中显色,在化学发光成像仪中曝光、显影条带,I m a g eJ软件检测各条带灰度值。1.8 双荧光素酶报告基因实验将含有m i R-4 7 3 5-3 p结合位点的H 1 9野生序列(w t)和突变序列(m u t)分别插入p m i r G L O双荧光素酶报告基因载体的下游,合成H 1 9w t或H 1 9m u t荧光素酶报告质粒。然后将上述质粒分别与794王烈宏等.l n c R NA H 1 9靶向m i R-4 7 3 5-3 p激活N F-B信号通路调控宫颈癌顺铂耐药m i m i c sN C或m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s共转染H e L a/D D P细胞;转染2 4h后,测定荧光素酶活性。1.9 R N A交互沉降(p u l l d o w n)实验将生物素标记的m i R-4 7 3 5-3 p(b i o-m i R-4 7 3 5-3 p),m i R-N C(b i o-m i R-N C),和对照组(C o n t r o l)分别转染H e L a细胞,培养4 8h。然后将上述获得的H 1 9细胞进行裂解并与D y n a b e a d sTMM-2 8 0链霉亲和素在室温培养1 0m i n。最后,q R T-P C R检测结合R NA s的数量。1.1 0 统计学方法本研究上述所有实验均独立重复3次。使用G r a p h P a dP r i s m8.0软件进行数据统计分析,符合正态分布的数据用均数标准差表示,采用t检验分析两组独立样本均数间的差异,采用单因素方差分析比较多组均数之间的差异,以P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 l n c R N AH 1 9在H e L a/D D P细胞中高表达C C K-8检测H e L a和H e L a/D D P细胞在不同浓度顺铂中的死亡情况,计算I C5 0值。结果显示,H e L a细胞的I C5 0为7.2 4 6g/m L,H e L a/D D P细胞的I C5 0为2 7.7 6 6g/m L。q R T-P C R结果显示,l n c R N AH 1 9在H e L a/D D P细胞中明显高表达(图1)。与H e L a组比较,*P0.0 5图1 l n c R NA H 1 9在H e L a/D D P细胞中高表达F i g.1T h eh i g he x p r e s s i o no f l n c R NA H 1 9 i nH e L a/D D Pc e l l s2.2 敲低l n c R N AH 1 9增强H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性q R T-P C R检测结果显示,与对照组和s i-N C组比较,s i-H 1 9组H e L a/D D P细胞中l n c R N A H 1 9表达水平明显降低(图2 A)。C C K-8、克隆形成和流式细胞术结果显示,与对照组和s i-N C组比较,s i-H 1 9组H e L a/D D P细胞的I C5 0值明显降低,细胞克隆形成能力降低,细胞凋亡率明显升高(图2 B2 D)。W e s t-e r nb l o t实验结果显示,与对照组和s i-N C组比较,s i-H 1 9组H e L a/D D P细胞中B c l-2蛋白水平降低,而B a x和c-C a s p 3蛋白水平升高(图2 E)。A:q R T-P C R法检测H 1 9含量;B:C C K-8实验检测细胞I C5 0值;C:克隆形成实验检测细胞增殖;D:流式细胞术检测细胞凋亡;E:W e s t e r nb l o t检测蛋白含量;与s i-H 1 9组比较,*P0.0 1图2 敲低l n c R NA H 1 9增强H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性F i g.2K n o c k d o w no f l n c R NA H 1 9e n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oD D P2.3 l n c R N AH 1 9靶向m i R-4 7 3 5-3 p利用在线数据库S t a r B a s e预测到l n c R NAH 1 9可以与许多m i R NA直接结合。但是在这些候选者中,我们发现m i R-4 7 3 5-3 p能够参与宫颈癌细胞对894华中科技大学学报(医学版)2 0 2 3年8月第5 2卷第4期顺铂敏感性的调控1 2。因此,我们选择m i R-4 7 3 5-3 p为研究对象。本研究中,S t a r B a s e预测显示l n-c R NA H 1 9序列的一段核苷酸序列可以和m i R-4 7 3 5-3 p互补(图3 A)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s明显抑制H 1 9w t荧光素酶活性,而对H 1 9m u t荧光素酶活性没有明显影响(图3 B)。R NAp u l l d o w n实验结果显示,生物素标记的m i R-4 7 3 5-3 p能够明显富 集l n c R NAH 1 9(图3 C)。q R T-P C R检测结果显示,与H e L a细胞比较,m i R-4 7 3 5-3 p在H e L a/D D P细胞中明显低表达(图3 D);与对照组和s i-N C组比较,s i-H 1 9组H e L a/D D P细胞中m i R-4 7 3 5-3 p表达水平明显上调(图3 E)。A:S t a r B a s e预测的H 1 9和m i R-4 7 3 5-3 p的结合位点;B:双荧光素酶报告基因实验验证H 1 9与m i R-4 7 3 5-3 p的靶向关系;C:RNAp u l l d o w n实验验证H 1 9与m i R-4 7 3 5-3 p的靶向关系;D:q R T-P C R法检测H e L a/D D P和H e L a细胞中m i R-4 7 3 5-3 p含量;E:q R T-P C R法检测敲除H 1 9后H e L a/D D P细胞中m i R-4 7 3 5-3 p含量。*P0.0 5图3 l n c R NA H 1 9与m i R-4 7 3 5-3 p的靶向关系验证F i g.3V e r i f i c a t i o no f t h e t a r g e t i n gr e l a t i o n s h i pb e t w e e n l n c R NA H 1 9a n dm i R-4 7 3 5-3 p2.4 过表达m i R-4 7 3 5-3 p增强H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性q R T-P C R检 测m i R-4 7 3 5-3 p m i m i c s转 染 效率,结果显示,与对照组和m i m i c sN C组比较,m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s组H e L a/D D P细胞中m i R-4 7 3 5-3 p表达明显升高(图4 A)。C C K-8、克隆形成和流式细胞术检测结果显示,与对照组和m i m i c sN C组比较,m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s组H e L a/D D P细胞的I C5 0值明显降低,细胞克隆形成能力降低,细胞凋亡率明显升高(图4 B4 D)。W e s t e r nb l o t实验结果显示,与对照组和m i m i c sN C组比较,m i R-4 7 3 5-3 pm i m-i c s组H e L a/D D P细胞中B c l-2蛋白水平降低,而B a x和c-C a s p 3蛋白水平升高(均P0.0 5,图4 E)。1:C o n t r o l组;2:m i m i c sN C组;3:m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s组;A:q R T-P C R法检测m i R-4 7 3 5-3 p含量;B:C C K-8实验检测细胞I C5 0值;C:克隆形成实验检测细胞增殖;D:流式细胞术检测细胞凋亡;E:W e s t e r nb l o t检测蛋白含量;与m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s组比较,*P 0.0 5图4 过表达m i R-4 7 3 5-3 p增强H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性F i g.4m i R-4 7 3 5-3 po v e r e x p r e s s i o ne n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oD D P994王烈宏等.l n c R NA H 1 9靶向m i R-4 7 3 5-3 p激活N F-B信号通路调控宫颈癌顺铂耐药2.5 l n c R N AH 1 9可能通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p调控H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性 q R T-P C R检测m i R-4 7 3 5-3 pi n h i b i t o r转染效率,结果显示,与对照组和i n h i b i t o rN C组比较,m i R-4 7 3 5-3 p i n h i b i t o r组H e L a/D D P细胞中m i R-4 7 3 5-3 p表达明显降低(图5 A)。C C K-8、克隆形成和流式细胞术结果显示,与s i-H 1 9+i n h i b i t o rN C组比较,s i-H 1 9+m i R-4 7 3 5-3 pi n h i b i t o r组H e L a/D D P细胞的I C5 0值明显升高,细胞克隆形成能力增强,细胞凋亡率明显降低(图5 B5 D)。W e s t e r nb l o t实验结果显示,与s i-H 1 9+i n h i b i t o rN C组比较,s i-H 1 9+m i R-4 7 3 5-3 pi n h i b i t o r组H e L a/D D P细胞中B c l-2蛋白水平升高,而B a x和c-C a s p 3蛋白水平降低(图5 E)。1:s i-N C组;2:s i-H 1 9组;3:s i-H 1 9+i n h i b i t o rN C组;4:s i-H 1 9+m i R-4 7 3 5-3 p i n h i b i t o r组;A:q R T-P C R法检测m i R-4 7 3 5-3 p含量;B:C C K-8实验检测细胞I C5 0值;C:克隆形成实验检测细胞增殖;D:流式细胞术检测细胞凋亡;E:W e s t e r nb l o t检测蛋白含量;*P0.0 5图5 l n c RNA H 1 9/m i R-4 7 3 5-3 p轴对H e L a/D D P细胞顺铂敏感性的影响F i g.5T h ee f f e c t so f l n c R NA H 1 9/m i R-4 7 3 5-3 pa x i so nt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oD D P2.6 l n c R N AH 1 9/m i R-4 7 3 5-3 p轴对N F-B信号通路的影响W e s t e r nb l o t实 验 检 测l n c R NA H 1 9/m i R-4 7 3 5-3 p对H e L a/D D P细胞中N F-B信号通路的影响,结 果 显 示,与s i-N C组 比 较,s i-H 1 9组p-I B/I B、p-p 6 5/p 6 5水平均明显降低(图6)。与s i-H 1 9+i n h i b i t o rN C组比较,s i-H 1 9+m i R-4 7 3 5-3 pi n h i b i t o r组p-I B/I B、p-p 6 5/p 6 5水平上升(图6)。*P0.0 5图6 W e s t e r nb l o t检测N F-B通路蛋白表达F i g.6D e t e c t i o no fN F-Bp a t h w a y-r e l a t e dp r o t e i n sb yW e s t e r nb l o t t i n g005华中科技大学学报(医学版)2 0 2 3年8月第5 2卷第4期3 讨论宫颈癌是一种发病率和死亡率均较高的女性生殖系统肿瘤,据2 0 2 0年全球癌症统计数据,宫颈癌在女性肿瘤发病中占到6.5%,死亡人数占比高达7.7%,其中新发病例有8 0%在发展中国家1 3。在临床上,宫颈癌化疗药物首选仍然是铂类药物。顺铂作为最有效的一线化疗药物,广泛用于转移性或复发性宫颈癌的治疗。然而,在临床应用中有约2 0%的宫颈癌患者出现化疗耐药,导致治疗失败、肿瘤复发或转移,严重影响宫颈癌的疗效和预后1 4-1 5。因此,探索宫颈癌顺铂耐药的机制,采取有针对性的干预措施,有助于提高宫颈癌患者生存率和生存质量。多项证据证实l n c R NA广泛地参与调控基因表达,在肿瘤发生、发展及化疗耐药中发挥着重要作用1 6。例如,Z h o u等1 7研究证实l n c R NA P VT 1通过激活Wn t/-c a t e n i n通路,促进胰腺癌吉西他滨耐药;C a i等1 8发现l n c R NAG B C D R l n c 1通过激活自噬诱导胆囊癌细胞产生耐药;S u n等1 9报道l n c R NATUG 1通过促进GAT A 6蛋白表达增强结直肠癌干细胞特性和化疗耐药。l n c R NA H 1 9长约2.3k b,包含5个外显子和4个内含子,是最早被发现的肿瘤相关l n c R NA2 0。此外,既往研究发现l n-c R NA H 1 9与 肿 瘤 细 胞 的 化 疗 耐 药 有 关,如l n-c R NA H 1 9调控肝癌细胞对阿霉素的抗性2 1;l n-c R NA H 1 9能够与程序性死亡配体1(P D-L 1)配合,增强卵巢癌细胞对铂类药物的抗性2 2。但目前l n c R NA H 1 9对宫颈癌细胞耐药的影响尚不明确。本研究通过体外构建宫颈癌顺铂耐药细胞株,发现l n c R NA H 1 9在顺铂耐药的细胞中高表达,且敲低l n c R NA H 1 9能够明显增强耐药细胞株对顺铂的敏感性,提示l n c R NA H 1 9与宫颈癌顺铂耐药相关。微小R NA(m i c r o R NA,m i R NA)是一类研究比较广泛的小分子非编码R NA,在人类生理及病理过程中起重要调控作用2 3。近年来,许多研究阐明了l n c R NA作为m i R NA的“海绵”发挥作用,如l n-c R NA AK 0 2 4 0 9 4靶 向m i R-1 8 1 a促 进 乳 腺 癌 进展2 4;l n c R NAD AN C R调控m i R-3 3 b促进胰腺癌的增殖和转移2 5。值得关注的是早期研究表明敲低l n c R NA H 1 9可以通过调控m i R-1 3 8-5 p削弱宫颈癌细胞的增殖2 6;l n c R NA H 1 9可以增强宫颈癌细胞系的细胞增殖和非锚定依赖性生长2 7。本研究进一步分析发现,l n c R NA H 1 9能够靶向结 合m i R-4 7 3 5-3 p,在宫颈癌耐 药 细 胞 中 敲 低l n c R NAH 1 9后明显上调m i R-4 7 3 5-3 p的表达。既往研究报道,m i R-4 7 3 5-3 p在胃癌、宫颈癌、卵巢癌中作为肿瘤抑制因子发挥作用,且可能与宫颈癌的化疗耐药有关1 2,2 8-2 9。本研究在敲低l n c R NA H 1 9表达的宫颈癌耐药细胞中同时抑制m i R-4 7 3 5-3 p的表达,进行功能拯救实验,结果表明抑制m i R-4 7 3 5-3 p能够逆转l n c R NA H 1 9敲低对细胞顺铂敏感性的增强作用,提示l n c R NA H 1 9通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p发挥调控功能。有证据表明,N F-B信号通路的异常激活可引起肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,严重影响肿瘤的化疗效果3 0-3 1。本研究结果表明敲低l n c R NA H 1 9可能通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p抑制宫颈癌耐药细胞中N F-B信号通路的活性。综上所述,l n c R NA H 1 9在宫颈癌顺铂耐药细胞株中高表达,敲低l n c R NA H 1 9可能通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p抑制细胞中N F-B信号通路活性,增强细胞对顺铂的敏感性,提示l n c R NA H 1 9可能成为改善宫颈癌耐药的新靶点。但这些研究只仅限于体外的实验,对于l n c R NA H 1 9在体内是如何作用,其与宫颈癌顺铂耐药以及相关的作用机制仍有待继续研究。参 考 文 献1 B u s k w o f i eA,D a v i d-W e s tG,C l a r eCA.Ar e v i e wo fc e r v i c a lc a n c e r:i n c i d e n c ea n dd i s p a r i t i e sJ.JN a t lM e dA s s o c,2 0 2 0.1 1 2(2):2 2 9-2 3 2.2 C o h e nAC,R o a n eBM,a n dL e a t hCA.3 r d:N o v e l t h e r a p e u-t i c s f o r r e c u r r e n t c e r v i c a l c a n c e r:m o v i n g t o w a r d sp e r s o n a l i z e dt h e r a p yJ.D r u g s,2 0 2 0.8 0(3):2 1 7-2 2 7.3 G a d d u c c iA,C o s i oS.N e o a d j u v a n t c h e m o t h e r a p y i n l o c a l l ya d-v a n c e dc e r v i c a l c a n c e r:R e v i e wo ft h el i t e r a t u r ea n dp e r s p e c-t i v e so fc l i n i c a lr e s e a r c hJ.A n t i c a n c e rR e s,2 0 2 0,4 0(9):4 8 1 9-4 8 2 8.4 P a l a z z oAF,K o o n i nEV.F u n c t i o n a l l o n gn o n-c o d i n gR NA se v o l v e f r o mj u n kt r a n s c r i p t sJ.C e l l,2 0 2 0,1 8 3(5):1 1 5 1-1 1 6 1.5 L i uC,L iH,C h uF,e t a l.L o n gn o n-c c o d i n gR NA s:k e yr e g u-l a t o r si n v o l v e di n m e t a b o l i cr e p r o g r a mm i n gi nc a n c e r(R e-v i e w)J.JO n c o lR e p,2 0 2 1,4 5(5):5 4