流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座.pptx

河南省人民医院血研所1概论 造血干细胞移植（HSCT）是治疗血液系统疾病、本身免疫性疾病、一些实体瘤和基因缺点等疾病主要伎俩之一。在造血干细胞移植过程中采集足够数量造血干细胞是造血干细胞移植成功关键。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第1页河南省人民医院血研所2概论 但至今为止，尚无一个与体内重建造血全吻合造血干细胞体外检测法。早期经过有核细胞计数、集落形成单位来计算移植物中造血干/祖细胞数量，但前者与造血干细胞数量一致性差，后者试验变异性大、耗时长，其临床使用价值低。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第2页河南省人民医院血研所3概论 20世纪80年代，发觉CD34分子在造血干/祖细胞上表示，为临床HSCT提供了可评价造血干/祖细胞植入最低阈值强有力依据。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第3页河南省人民医院血研所4概论 近年来尽管体外研究表明，人类CD34-脐血干细胞也有造血活性，但大量临床研究证实用富含CD34+细胞移植可安全、持久地重建多系造血。所以，当前临床及试验室依然是应用CD34+细胞进行造血干细胞移植、基因转染等。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第4页河南省人民医院血研所5概论 而流式细胞仪含有CD34+细胞计数准确、方便、快捷等优势，已广泛地应用于造血干/祖细胞数量检测及采集时机确实定。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第5页河南省人民医院血研所6造血干细胞数量是造血干细胞移植 成功关键原因造血干细胞移植造血干细胞数量恶性血液病一些实体瘤免疫性疾病免疫缺点病心肌血管胰岛细胞成功关键流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第6页河南省人民医院血研所7 怎样准确地计数造血干细胞数量，什么是有效质量控制成了各大试验室探讨焦点。惯用方法：集落培养法 流式细胞术CD34+细胞计数法造血干细胞检测方法流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第7页河南省人民医院血研所8集落培养法：优点：干细胞计数结果与移植结果相吻合缺点：极难标准化，只代表晚期干/祖细 胞，培养时间长，不能当即判断采 集物造血干细胞数量。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第8页河南省人民医院血研所9流式细胞术CD34+细胞计数法：优点：干细胞计数结果与移植结果相吻合 快速，简单，方便。当前已取代了集落培养法流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第9页河南省人民医院血研所10标本标识 造血干细胞采集完成后马上抽样，抽样前要将采集袋中细胞与小辫中采集物混合5次以上，再封闭小辫，剪取小辫中采集物，在小辫上标识供者编号、姓名及标本名称，送试验室检测。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第10页河南省人民医院血研所11 标本标识 全部检测标本应及时贴上标签，注明 患者姓名，标本类型，采集时间，申请单和标本粘贴在一起送检，申请单要详细填写患者信息、标本类型及检测项目，进行双平台检测时还需提供白细胞计数和分类。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第11页河南省人民医院血研所12 抗凝剂选择 不一样抗凝剂抗凝、标本稳定性不一样。EDTA抗凝标本，常温下可保留12-24h，肝素钠或枸橼酸钠抗凝标本可保留48h。假如标本需用血细胞分析仪同时进行白细胞计数和分类，则应选择EDTA抗凝。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第12页河南省人民医院血研所13抗凝剂选择 1、外周血标本常选取EDTA盐抗凝，2、采集物惯用枸橼酸钠凝，3、骨髓和脐血标本可选取EDTA、肝素或ACD 抗凝。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第13页河南省人民医院血研所14标本质量 标本处理步骤越多，细胞丢失就越多。对于全血标本，溶血后不洗涤，能够使标本处理步骤减到最少，细胞丢失少。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第14页河南省人民医院血研所15 标本质量（标本目测）标本常见问题有两种类型：1、变性或损坏标本，需马上弃之；2、标本在处理过程中出现错误操作，则 需深入评价。错误操作问题需要统计下来，这对标本处理、分析以及结果地解释将很有帮助。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第15页河南省人民医院血研所16标本质量（溶血、凝血）1、严重溶血标本应该放弃检测。所 有可能破坏标本完整性异常情况均应亲密观察，并统计下来。2、即使很小凝块也会引发血液中一些成份选择性丢失或改变，凝血标本应尽可能弃用。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第16页河南省人民医院血研所17标本质量（温度极限）经过长距离或长时间运输标本，应确认标本是否过热或过冷，即使其它全部判定标准都正常，也应该统计下来以利于后续处理、分析和结果解释。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第17页河南省人民医院血研所18标本质量（错误标本）假如标本没有标签或标签与病人信息不符，应拒绝接收标本，并及时与相关医护人员沟通流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第18页河南省人民医院血研所19标本质量（标本保留时间及条件）可接收标本最长保留时间取决于抗凝剂种类、溶血剂、储存条件及细胞浓度。试验室应该依据使用抗凝剂和溶血剂确定可接收标本最长保留时间。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第19页河南省人民医院血研所20标本质量（标本保留时间及条件）标准上标本采集后应马上检测，不过实际操作中往往无法做到。不能马上检测标本应该保留于2-6冰箱中。标本处理和免疫染色应严格按照试剂说明书进行。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第20页河南省人民医院血研所21标本运输 采集标本应该在2-6环境下尽快送检，注意防止标本冻结和过热。内部送检可用含有防漏密封塑料袋和带盖塑料容器等运输标本。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第21页河南省人民医院血研所22标本运输 外部运输标本，包装要求含有三层体系：防水内容器；防水并含有吸附材料第二层内容器；坚固外包装。致病原血液标本应严格按照相关要求运输。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第22页河南省人民医院血研所23CD34+细胞绝对计数方法流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第23页河南省人民医院血研所24CD34+细胞绝对计数方法 CD34+细胞绝对计数分为单平台方法和双平台方法。单平台方法是首选方法，它防止了室间变异和多台仪器间系统误差。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第24页河南省人民医院血研所25单平台计数单平台：在抗体染色细胞中,等容量加入确定浓度荧光微球，直接用FCM检测出采集物中CD34+浓度，然后计算出采集物中CD34+细胞总数流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第25页河南省人民医院血研所26 经过计数板计数或使用血细胞分析仪预先计算标本中白细胞浓度，并严格按照操作说明书调整标本和抗体最正确百分比。白细胞浓度和抗体用量流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第26页河南省人民医院血研所27 白细胞过少标本应降低单抗用量；白细胞过多标本应使用含1%白蛋白或其它蛋白PBS稀释到适当浓度。白细胞浓度和抗体用量流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第27页河南省人民医院血研所28 标本和荧光微球移液量应准确，确保准确计数加入定量微球浓度和标本体积，推荐采取反向抽吸法加样。移液量流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第28页河南省人民医院血研所29 裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。采取含7-AAD方案时应选择不含固定剂溶血素，如氯化铵-Tris缓冲液。裂解红细胞流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第29页河南省人民医院血研所30 为防止荧光微球丢失，单平台计数在裂解红细胞后不用离心洗涤。离心流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第30页河南省人民医院血研所31双平台方法双平台：分别用FCM检测出CD34+细胞在有核细胞中百分比，用血液细胞计数仪检测出有核细胞浓度，在光镜下进行白细胞分类，然后再计算出采集物中CD34+细胞总数。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第31页河南省人民医院血研所32双平台方法 白细胞浓度与抗体用量同单平台方法，不需要采取已知数量荧光微球管或加入荧光微球悬液。裂解红细胞时间和方法按照所用溶血素说明书进行，裂解红细胞后进行离心洗涤2次。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第32页河南省人民医院血研所33免疫荧光染色 可采取商品化CD34+细胞计数试剂盒或试验室自己组合单抗。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第33页河南省人民医院血研所34免疫荧光染色 自己组合抗体中,每一个抗体都需分别滴定,以明确其噪音与阳性信号最正确分离滴度，并检测作为组合抗体使用和作为组合抗体成份之一单独使用平均荧光强度和阳性率，其可比性需要在均值2标准差之内。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第34页河南省人民医院血研所35抗体及荧光微球选择CD34抗体：选择PE直标抗类抗体；CD45抗体：选择广谱抗CD45抗体；CD34抗体同型对照：采取与CD34匹配同一 厂家生产同型对照；定量荧光微球：推荐使用绝对计数商品化荧光微球。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第35页河南省人民医院血研所36抗体组合方案含7-氨基放线菌素D（AAD）三色方案：抗体组合为CD45，CD34，7-AAD；不含7-AAD双色方案：抗体组合为CD45，CD34。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第36页河南省人民医院血研所37免疫荧光染色按照试剂说明书和注意事项进行操作，普通流程以下：流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第37页河南省人民医院血研所38 取含1106白细胞全血或稀释标本50L-200L加入适量直标抗体10L-20L，室温孵育20min-30min。标本与抗体孵育流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第38页河南省人民医院血研所39 裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。采取含7-AAD方案时应选择不含固定剂溶血素，如氯化铵-Tris缓冲液。裂解红细胞流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第39页河南省人民医院血研所40 离心洗涤方法与溶血素相关，按照所用溶血素说明书进行操作。单平台绝对值计数法在裂解红细胞后，不要离心洗涤离心流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第40页河南省人民医院血研所41 采取包被有已知数量荧光微球或按说明书加入一定数量荧光微球。绝对计数商品化荧光微球流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第41页河南省人民医院血研所42 制备好标本在上机分析前放在4-10下避光保留，应在1h内上机检测，检测前混匀细胞。染色后标本保留流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第42页河南省人民医院血研所43对照通常采取同型对照和阳性对照标本同型对照：采取ISHAGE设门方法时可不需同型对照，多重逻辑设门后可去除非特异性抗体结合；对照标本流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第43页河南省人民医院血研所44 阳性对照：检测新批号和当前批号试剂染色效率是否有问题时需要做阳性对照，或怀疑试剂出现问题时，采取该试剂与已知可接收性能批号试剂同时操作进行验证。对照标本流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第44页河南省人民医院血研所45阳性对照种类：主要有全血标本，冻干淋巴细胞；使用频率：更换试剂时对照标本流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第45页河南省人民医院血研所46流式细胞仪质控 包含光学系统调整、荧光分辨率调整、荧光赔偿调整、性能评定及百分比、仪器保养及统计等。仪器调整很多方面要遵从制造商提议。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第46页河南省人民医院血研所47数据获取和分析流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第47页河南省人民医院血研所48细胞获取 设定阈值和分辨率：依据仪器操 作说明书和试剂盒使用说明书进 行设定。调整细胞群分布：在CD45/SSC散 点图中，调整SSC，使全部白细 胞群均可见。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第48页河南省人民医院血研所49 作CD45/SSC散点图定位白细胞群，排除标本中细胞碎片等对计数干扰；CD45从强阳性到弱阳性，包含淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、原始细胞、嗜碱性粒细胞和有核红细胞。依据CD45划定白细胞区域流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第49页河南省人民医院血研所50 在非设门荧光散点图中，最少搜集50000个白细胞及100个CD34+细胞。采集细胞数流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第50页河南省人民医院血研所51CD34+细胞计数流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第51页河南省人民医院血研所52双参数荧光散点图设置 双平台双色CD34+细胞计数设置：CD45/SSC、CD34/SSC、CD45/SSC、FSC/SSC、CD45/CD34、FSC/SSC 6个散点图。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第52页河南省人民医院血研所53双参数荧光散点图设置 单平台三色CD34+细胞计数设置：CD45/SSC、CD34/SSC、CD45/SSC、FSC/SSC，CD45/CD34、FSC/SSC、7-AAD/SSC、7-AAD/SSC 8个散点图。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第53页河南省人民医院血研所54设门方法流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第54页河南省人民医院血研所55双平台ISHAGE设门 白细胞计数需要与CD34+细胞计数使用同一标本检测，并在6h内完成。当白细胞计数不能准确取得时，不能用双平台方法，只能用单平台方法。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第55页河南省人民医院血研所56基本ISHAGE：双平台法试剂：CD45-FITC,CD34-PE全血，直接荧光标识，溶血、洗涤、双平台设门CD45/SSC,CD34/SSC,FSC/SSC，CD45/CD34流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第56页河南省人民医院血研所57流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第57页河南省人民医院血研所58标识定义G1R1G2R1 and R2G3R1 and R2 and R3CD34+细胞 R1 and R2 and R3 and R4淋巴细胞R5双平台ISHAGE设门流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第58页河南省人民医院血研所59(1)CD45/SS R1包含全部CD45+及dimCD45。R5为淋巴细胞(2)CD34/SS。显示R1门内细胞。R2包含全部CD34+细胞，从低SS到中等SS强度。双平台ISHAGE设门流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第59页河南省人民医院血研所60(3)CD45/SS。显示R1+R2门内细胞。R3确认CD34+细胞位于低CD45与低SS区域，为真正CD34+细胞。双平台ISHAGE设门流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第60页河南省人民医院血研所61(4)FS/SS，取R1+R2+R3门内细胞。R4选取SS大于淋巴细胞下限细胞，用于去除细胞碎片、聚集血小板影响。双平台ISHAGE设门流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第61页河南省人民医院血研所62(5)CD45/CD34。显示R1门内细胞，设定CD45和CD34阳性十字界限，确定R1左边界CD45下限。(6)FS/SS。显示R5门内细胞，用于确定R4FS下限。双平台ISHAGE设门流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第62页河南省人民医院血研所63单平台ISHAGE设门法 商业化CD34+细胞绝对计数试剂盒,其CD34+细胞绝对数由专门软件直接计算生成，操作依据是试剂操作说明书。试验室自己配制抗体组合需要加入商业化荧光微球。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第63页河南省人民医院血研所64流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第64页河南省人民医院血研所65 同双平台相比，单平台多设了R6（荧光微球）、R7（细胞碎片）及R8（活CD34+细胞）。单平台ISHAGE设门流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第65页河南省人民医院血研所66单平台ISHAGE设门法 需手动设门，对操作者要求高；无需同型对照，亦不受抗体浓度及荧光素与蛋白比率限制，经济廉价，抗体选择范围也宽；7-AAD活细胞染料，可计数活细胞，需逻辑手动设门。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第66页河南省人民医院血研所67结果汇报和审核流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第67页河南省人民医院血研所68汇报内容双平台ISHAGE法汇报CD34+细胞百分比及绝对值；单平台ISHAGE法汇报CD45+细胞绝对值、CD34+细胞百分比及绝对值、活CD45+细胞和CD34+细胞绝对数。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第68页河南省人民医院血研所69审核内容 包含数据采集阈值设置、采集细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案、与试验结果相关全部设门等。这些数据均由试验室专业人员在解释数据时进行审核。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第69页河南省人民医院血研所70参考范围 每个试验室都应确定本试验室CD34+细胞在外周血、动员后外周血、采集物、骨髓和脐带血中参考范围。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第70页河南省人民医院血研所71数据储存 数据储存和检测数据方法都应详细统计，方便于检测者或医师对数据进行复核。保留汇报原始数据最少2年。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第71页河南省人民医院血研所72室内质控 试验室应开展室内控制工作，提议每个月最少进行室内质控一次。进行室内质控品检测前，首先采取健康志愿者新鲜外周血标本作为质控物上机测定，普通需要做重复测定。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第72页河南省人民医院血研所73室间质控 试验室应参加国内或国外质评机构组织室间质量评价和能力验证，用于能力验证样本需与病人标本同等对待，要求检验人员和检验流程完全一致。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第73页河南省人民医院血研所74人员培训 流式细胞分析室应含有监督人员和操作人员岗位，并制订用于培训标准化操作规程。试验室监督人员对每一位操作人员培训效果、流式细胞术检测能力进行考评并决定是否授权上岗。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第74页河南省人民医院血研所75小结 应用流式细胞CD34+细胞计数是一个已被普遍接收快速、简便方法；流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第75页河南省人民医院血研所76小结 不一样流式细胞术CD34+计数各有优缺点，所得结果有一定差异；单平台ISHAGE法重复性好，室间差异小，但技术要求高。流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第76页河南省人民医院血研所77 流式细胞术CD三四细胞计数专家讲座第77页