液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座.pptx

目录一、液质联用原理二、液质联用应用液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第1页LC:液湘色谱仪一个能够把液体混合物中不一样组分依据在色谱柱中保留时间不一样进行分离,检测及搜集仪器MS:MassSpectrometer质谱仪一个能够把分子转化生成带电离子,并在气态中依据质荷比(m/z:m质量z分子所带电荷数)不一样把离子进行分离并进行检测仪器.一、液质联用原理液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第2页液质联用原理液质联用液质联用(LC-MS)：不挥发性化合物分析测定，极性化合物分析测定，热不稳定化合物分析测定，大分子量化合物（包含蛋白、多肽、多聚物等）分析测定液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第3页用液相或注射泵将样品注入质谱.1.样品注入样品注入样品在离子源内电离,带电离子在接口内进行去溶剂,聚集,冷却进入质量分析器2.离子化离子化四极杆用于传输离子或选择母离子和子离子,.离子经过聚焦和传输进入下一组四极杆3.质量分析器质量分析器四极杆四极杆检测器统计离子信号.然后将信号传输到电脑绘制成色谱图.4.离子检测和数据分析离子检测和数据分析Q0Q1Q3DFCEMORSKEXITQ2(LINAC)系系 统统 组组 成成5.真空系统真空系统液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第4页连续注射连续注射样品放在注射器中或静态针内用注射泵或电场引力,样品流连续并恒定地流入离子源喷口通惯用于安装时调谐通惯用于安装时调谐,质量校正质量校正 和标准样品质谱方法优化和标准样品质谱方法优化流动注射分析流动注射分析用手动进样器和液相泵,注入样品,由流动相带入离子源喷口通常安装通常安装5ul定量环定量环液质联用液质联用用液相泵,流速从nL/min到mL/min样品可能是纯品或者是混合物流动相带着样品经过色谱柱分离后进入质谱离子源1、样品注入液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第5页2、离子源大气压电离（API）（包含大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）ESI为电喷雾，即样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，对于极性大样品效果好一些；APCI为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最终检测，对极性小样品效果很好。APPI：大气压光电离源，适合用于弱极性化合物，如多环芳烃等液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第6页2.1ESI离子源ESI为电喷雾，即样品先带电再喷雾，带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子，从而被检测，对于极性大样品效果好一些；电喷雾电离源是一个软电离方式，即便是分子量大，稳定性差化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源最大特点是轻易形成多电荷离子。当前采取电喷雾电离，能够测量分子量在300000Da以上蛋白质液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第7页APCI为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最终检测，对极性小样品效果很好。有些分析物因为结构和极性方面原因，用ESI不能产生足够强离子，能够采取APCI方式增加离子产率，能够认为APCI是ESI补充。APCI主要产生是单电荷离子，所以分析化合物分子量普通小于1000Da。用这种电离源得到质谱极少有碎片离子，主要是准分子离子。2.2APCI离子源液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第8页API-MS特点是能够和液相色谱、毛细管电泳等分离伎俩联用，扩展了应用范围，包含药品代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学应用等；液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第9页大气压电喷雾质谱应用范围大气压电喷雾质谱应用范围大气压电喷雾源大气压电喷雾源大气压化学源大气压化学源分子量分子量化合物极性化合物极性1000100,00010,000非极性非极性极性化合物极性化合物气相色谱气相色谱/质谱质谱液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第10页3、质量分析器-四级杆（quadrupolemassspectrometer）四极杆工作原理四极杆工作原理不稳定离子不稳定离子稳定离子稳定离子离子源离子源检测器检测器直流和交流控制电信号直流和交流控制电信号液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第11页ABBA To Detector去检测器去检测器AABBRF only-A rods&B rodsare 180 out of phase只加交流信号只加交流信号-A杆与杆与B杆上杆上加电压强度相同加电压强度相同,相位差相位差180度度液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第12页四极杆工作原理四极杆工作原理RF+DC 液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第13页液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第14页离子在四极杆中稳定性液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第15页4、离子检测MS/MS必须经过连续放置多个分析器来实现空间串联多级质谱分析。对于QQQ，每个分析器有以下单独作用：第一个四极杆(Q1)依据设定质荷比范围扫描和选择所需离子。第二个四极杆(Q2)，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。在所选择离子飞行途中，引入碰撞气体，比如氮气等。第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生碎片离子。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第16页三重四极杆基本功效Q1 能够筛选母离子 mz1Q2 经过碰撞碎裂打坏离子，形成碎片离子峰Q3 筛选子离子，定量子离子碎片强度 mz2液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第17页三重四极杆工作模式模式Q1 扫描Q1扫描离子Q2不打坏，传输Q3无分辨，传输用途和特点了解样品基本信息子离子扫描固定过滤母离子打坏母离子扫描子离子研究母离子结构特征母离子扫描扫描母离子打坏母离子固定过滤子离子筛选含有特征子离子（结构）分子中性丢失单离子监视 SIM多反应检测MRM扫描母离子按表过滤离子按表过滤母离子打坏离子不打坏，传输打坏母离子扫描子离子，与母离子有特征差异无分辨，传输按表过滤子离子筛选含有特征结构分子，此结构不易形成子离子定量定量，假阳性低液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第18页QQQ多级质谱：子离子扫描Q1选择了某一特定质量母离子，Q2碰撞池产生碎片离子，然后在Q3中分析。此过程产生经典质谱质谱碎片谱图。第一个四极杆在选择性离子监测模式，第二个在全扫描监测模式液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第19页QQQ多级质谱：母离子扫描在母离子扫描中，Q1测定母离子，Q3测定某个特定碎片离子，所以可在非常复杂混合物中监测某种特定分子。在下面例子中，睾丸激素在母碎片（m/z367）中碎片m/z97得到选择性监测，含有极高灵敏度和准确定量分析。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第20页QQQ多级质谱：中性丢失扫描l在QQQ中进行中性丢失扫描，Q1和Q3分析器结合使灵敏度和选择性得到最大化。Q1/Q3中性丢失扫描可监测母离子特定中性丢失，比如缩氨酸磷酸盐中一个磷酸根丢失。在这个例子中，Q1和Q3扫描得到母离子谱图，这张谱图是母离子为了磷酸化，丢失了碎片98而得到液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第21页QQQ多级质谱：单个反应监测(SRM)l选择某一质量母离子，Q2碰撞单元产生碎片离子。Q3只分析一个碎片离子。此过程产生一个简单单个离子碎片谱图液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第22页QQQ多级质谱：多反应监测lQ1选择某一质量母离子，碰撞单元产生碎片离子。Q3用于搜寻多个选择反应监测，这就是多重反应监测（MRM）。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第23页MRM 假阳性率较低原因利用母离子和子离子共同特征，定量选择性提升比如：假如样品 A 母离子 697 和样品 B542 在打坏后都含有子离子 245假如直接以特征离子 245 定量 A697，那么样品 B 就会对样品 A 定量造成干扰而利用离子对 697-245 定量，B542 在 A697 经过 Q1 时无法经过 Q1，这么就排除了B542 干扰697EI245542液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第24页三重四极杆与其它液相/质谱联用技术比较质谱联用技术比较在质谱应用领域里三重四极杆是最灵敏和定量重现性最好仪器。在质谱应用领域里三重四极杆在执行中性丢失扫描和母子扫描模式含有最好灵敏性和准确性。三重四极杆不是最好获取质谱图仪器，平行测量质谱系统会更加好些：三重四极杆质谱/质谱不如离子阱质谱仪（TRAPS）灵敏（定性）三重四极杆质谱不如飞行时间质谱仪（TOF）所获取质谱图那么 有说服力（定性）液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第25页二、LC-MS/MS应用高效液相色谱分离化合物范围广泛，准确度高，对化合物破坏性小。质谱灵敏度高，对未知化合物结果分析定性准确，对被测定化合物和形影标准样品了解要求较低。将HPLC高效分离能力与MS高专属性高灵敏度检测功效结合起来，实现对复杂混合物更准确定性和定量分析。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第26页液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第27页优点：测定准确分子量，其它技术无法比。灵敏度高，常规10-710-8g，单离子检测可达10-12g分析速度快便于分离、分析混合物其它技术无法胜任广泛适合用于各类化合物不足：异构体、立体化学区分能力差重复性差，需专员操作离子源产生记忆效应、污染等。价格贵，操作复杂，试验环境要求高。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第28页医药学：药品代谢、药动学、杂质分析、天然产物分析生物化学：多肽、蛋白质、核酸、糖环境化学：农药、农残分析、有机物污染、土壤/食品/水分析临床医学：新生儿检验、糖化血红蛋白、血红蛋白变异、胆酸食品科学：香料、添加剂、包装物、蛋白质、致癌物法医学：滥用药品、爆炸物、兴奋剂检测化学：合成、表面活性剂、染料液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第29页在药品研发中应用药品研发、生产过程中，微量杂质和副产物定性判定。潜在基因毒杂质定量分析。LC-MS分析条件选择考虑两个原因：1、使分析样品得到最正确分离条件2、得到最正确电离条件以取得更加好灵敏度当进行单离子检测时，假如没有介质效应，不用将物质完全分开便能够检测，这么既降低了分析时间，也能够降低分析难度，尤其是在进行大量体内药品分析时能够考虑。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第30页影响LC/MS测定原因pH影响检测正离子，酸化样品检测负离子，碱化样品惯用pH调整溶剂乙酸pH34甲酸pH23三氟乙酸pH12氨水溶液甲酸铵乙酸铵液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第31页溶液和缓冲剂组成ESI离子源APCI源以上均可用不适合：不挥发性盐：磷酸及盐、硼酸及盐、氯化钠、十二烷基硫酸钠、强离子对试剂等惯用可用可用不适合不适合甲醇丙醇苯乙腈丁醇甲苯异丙醇二氯甲烷烷烃丙酮三氯甲烷环烷烃乙醇水四氯化碳液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第32页样品浓度影响样品浓度过低：检测不出样品浓度过高：污染离子源、仪器管路（尤其是表明活性剂）产生簇离子或多聚体-谱图复杂化产生空间电荷效应-谱图歧变液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第33页2、基质效应基质效应（matrixeffect）是因为样品中存在干扰物质，对响应造成直接或间接影响。LC-MS分析时，内源性物质使待测物离子化效率降低或者增强。产生原因：待测组分与样品中基质成份在雾滴表面离子化过程竞争。结果显著降低或增强目标离子生成效率及离子强度，进而影响测定结果精密度和准确度。使得信号响应值产生较大变异。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第34页LC-MS分析时基质效应客观存在，并随样品不一样而不一样。影响基质效应原因很多，如样品、基质、样品前处理过程、色谱条件、色谱分离效果、流动相、离子化等。优化色谱条件改进前处理方法纯化样品改变离子化方式内标定量法液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第35页样品前处理过滤（0.45um滤膜）、超滤（3K、10K、30K等）溶剂萃取（去除杂质Na+、K+等）高速离心（去除不溶物）透析（惯用于蛋白纯化、除盐）固相萃取（除杂质、盐、浓缩样品、更换溶剂等）分子筛（惯用于蛋白纯化）色谱分离（正相、反相、亲和）液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第36页联用时主要问题难挥发和/或不稳定样品离子化流速不兼容流动相不兼容：不挥发缓冲盐、添加剂等液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第37页APCI-LC/MS氨基甲酸盐类化合物分析氨基甲酸盐类化合物分析mAUmin51015202520406080UV 254 nmTomato extract spiked with 11 carbamatesNorm.400008000010EIC m/z 222MS TICcarbofuran液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第38页药品中杂质含量低、起源广、结构多与主成份类似，必须选择适当分析技术进行研究。LC-MS联用技术结合了色谱高分离能力和质谱高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息优点，在食品分析、环境分析和医药研究等许多领域已得到了广泛应用。伴随联用技术日趋完善，以及色谱、质谱新技术应用，LC-MS联用技术成为杂质分析中广泛采取方法。液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第39页在杂质谱分析中：对药品中存在已知杂质进行判别同时也能对未知杂质进行结构推导在工艺杂质分析中：能够直接判定杂质化学结构，从而为原料药质量控制、合成工艺改进提供依据在降解产物研究中：对药品在实际储备条件下产生降解产物进行分析，可为药品储备、运输及使用整个过程中存放条件提供依据液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第40页谢谢谢谢!液质联用技术的原理和在药学研究中的应用专家讲座第41页