溶血空斑专题知识专家讲座.pptx

试验二试验二溶血空斑专题知识专家讲座第1页n n血清分离（眼球取血）血清分离（眼球取血）血清分离（眼球取血）血清分离（眼球取血）n n脾细胞制备脾细胞制备脾细胞制备脾细胞制备(吹气球法吹气球法吹气球法吹气球法)n n溶血空斑试验溶血空斑试验溶血空斑试验溶血空斑试验溶血空斑专题知识专家讲座第2页血清分离血清分离n n眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在试验台上，取侧卧位，左手食指尽可能将小试验台上，取侧卧位，左手食指尽可能将小试验台上，取侧卧位，左手食指尽可能将小试验台上，取侧卧位，左手食指尽可能将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊快速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住弯镊快速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住弯镊快速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住弯镊快速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出血液。采血完成马上用纱布压迫止血。流出血液。采血完成马上用纱布压迫止血。流出血液。采血完成马上用纱布压迫止血。流出血液。采血完成马上用纱布压迫止血。每次采血量每次采血量每次采血量每次采血量0.6-0.1mL0.6-0.1mL0.6-0.1mL0.6-0.1mL。溶血空斑专题知识专家讲座第3页【操作方法操作方法】n n眼球采血将血液保留于眼球采血将血液保留于眼球采血将血液保留于眼球采血将血液保留于1.5mlEp1.5mlEp1.5mlEp1.5mlEp管中，管中，管中，管中，n n4 4 4 4 静置静置静置静置24H24H24H24H 10000rpm/10min 10000rpm/10min 10000rpm/10min 10000rpm/10min，搜集血清；，搜集血清；，搜集血清；，搜集血清；n n-20-20-20-20保留待抗体水平检测。同时采集正常小保留待抗体水平检测。同时采集正常小保留待抗体水平检测。同时采集正常小保留待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。溶血空斑专题知识专家讲座第4页小鼠小鼠B B细胞溶血空斑形成试验细胞溶血空斑形成试验n n溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞原理来检测抗体形成细胞化补体，溶解细胞原理来检测抗体形成细胞化补体，溶解细胞原理来检测抗体形成细胞化补体，溶解细胞原理来检测抗体形成细胞一个体外试验方法，经典试验是用于检验动一个体外试验方法，经典试验是用于检验动一个体外试验方法，经典试验是用于检验动一个体外试验方法，经典试验是用于检验动物抗体产生功效。物抗体产生功效。物抗体产生功效。物抗体产生功效。n n将绵羊红细胞（将绵羊红细胞（将绵羊红细胞（将绵羊红细胞（SRBCSRBCSRBCSRBC）免疫过小鼠脾细胞制）免疫过小鼠脾细胞制）免疫过小鼠脾细胞制）免疫过小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量绵羊红细胞混合，在成细胞悬液，与一定量绵羊红细胞混合，在成细胞悬液，与一定量绵羊红细胞混合，在成细胞悬液，与一定量绵羊红细胞混合，在补体参加下，使抗体产生细胞周围补体参加下，使抗体产生细胞周围补体参加下，使抗体产生细胞周围补体参加下，使抗体产生细胞周围SRBCSRBCSRBCSRBC溶解，溶解，溶解，溶解，形成一个肉眼可见溶血空斑。主要用于测定形成一个肉眼可见溶血空斑。主要用于测定形成一个肉眼可见溶血空斑。主要用于测定形成一个肉眼可见溶血空斑。主要用于测定B B B B细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。溶血空斑专题知识专家讲座第5页【试剂与器材试剂与器材】1.1.1.1.健康小鼠（约健康小鼠（约健康小鼠（约健康小鼠（约1818181820 20 20 20 克重）。克重）。克重）。克重）。2.2.2.2.绵羊红细胞悬液（绵羊红细胞悬液（绵羊红细胞悬液（绵羊红细胞悬液（2.5%2.5%2.5%2.5%）。）。）。）。3.3.3.3.指示细胞悬液：指示细胞悬液：指示细胞悬液：指示细胞悬液：含含含含10%10%10%10%绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液 0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清），补体（即新鲜豚鼠血清），补体（即新鲜豚鼠血清），补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml0.3ml0.3ml0.3ml，Hanks Hanks Hanks Hanks 液液液液2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml。4.Hanks 4.Hanks 4.Hanks 4.Hanks 液（液（液（液（pH7.2pH7.2pH7.2pH7.2）。）。）。）。5.5.5.5.动物解剖器械、注射器（动物解剖器械、注射器（动物解剖器械、注射器（动物解剖器械、注射器（5ml5ml5ml5ml）、平皿、中）、平皿、中）、平皿、中）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、6.6.6.6.盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。溶血空斑专题知识专家讲座第6页【操作方法操作方法】n n免疫动物免疫动物n n取取2.5%2.5%绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液2ml2ml，无菌操作注射，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（于小鼠腹腔内。（4 4 天后追加一次免疫效果天后追加一次免疫效果更佳）。更佳）。n n见试验一，已做见试验一，已做溶血空斑专题知识专家讲座第7页制备脾细胞悬液制备脾细胞悬液1.1.1.1.将将将将免免免免疫疫疫疫后后后后7 7 7 7 天天天天小小小小鼠鼠鼠鼠颈颈颈颈椎椎椎椎脱脱脱脱位位位位处处处处死死死死，75%75%75%75%乙乙乙乙醇醇醇醇浸浸浸浸泡泡泡泡3 3 3 3分分分分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；2.2.2.2.在在在在小小小小鼠鼠鼠鼠左左左左腹腹腹腹侧侧侧侧中中中中部部部部剪剪剪剪开开开开小小小小口口口口，撕撕撕撕开开开开皮皮皮皮肤肤肤肤，暴暴暴暴露露露露腹腹腹腹壁壁壁壁，可见红色长条状脾脏；可见红色长条状脾脏；可见红色长条状脾脏；可见红色长条状脾脏；3.3.3.3.在在在在脾脾脾脾脏脏脏脏下下下下侧侧侧侧提提提提起起起起腹腹腹腹膜膜膜膜，剪剪剪剪开开开开后后后后上上上上翻翻翻翻，暴暴暴暴露露露露脾脾脾脾脏脏脏脏，用用用用镊镊镊镊子子子子提提提提起起起起脾脾脾脾脏脏脏脏，眼眼眼眼科科科科剪剪剪剪分分分分离离离离脾脾脾脾脏脏脏脏下下下下面面面面结结结结缔缔缔缔组组组组织织织织，取取取取出脾脏。放入盛有出脾脏。放入盛有出脾脏。放入盛有出脾脏。放入盛有5ml Hanks 5ml Hanks 5ml Hanks 5ml Hanks 液培养皿中；液培养皿中；液培养皿中；液培养皿中；4.4.4.4.左左左左手手手手持持持持一一一一把把把把小小小小镊镊镊镊子子子子夹夹夹夹住住住住脾脾脾脾脏脏脏脏，右右右右手手手手用用用用5ml 5ml 5ml 5ml 注注注注射射射射器器器器抽抽抽抽取取取取平平平平皿皿皿皿内内内内液液液液体体体体(4(4(4(4ml)ml)ml)ml)缓缓缓缓缓缓缓缓注注注注入入入入脾脾脾脾脏脏脏脏内内内内，将将将将脾脾脾脾细细细细胞胞胞胞冲洗出来。如此重复冲洗，到脾脏变白为止。冲洗出来。如此重复冲洗，到脾脏变白为止。冲洗出来。如此重复冲洗，到脾脏变白为止。冲洗出来。如此重复冲洗，到脾脏变白为止。溶血空斑专题知识专家讲座第8页5.5.5.5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少许用少许用少许用少许Hanks Hanks Hanks Hanks 液冲洗脾脏及平皿内残留细液冲洗脾脏及平皿内残留细液冲洗脾脏及平皿内残留细液冲洗脾脏及平皿内残留细胞，移入试管内。离心胞，移入试管内。离心胞，移入试管内。离心胞，移入试管内。离心1000 1000 1000 1000 转转转转/分分分分5 5 5 5 10 10 10 10 分分分分,弃上清，加弃上清，加弃上清，加弃上清，加5ml 5ml 5ml 5ml 冷红细胞裂解液（冷红细胞裂解液（冷红细胞裂解液（冷红细胞裂解液（NHNHNHNH4 4 4 4Cl Cl Cl Cl 3.735g/450ml 3.735g/450ml 3.735g/450ml 3.735g/450ml 双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水+Tris 1.3g/50ml+Tris 1.3g/50ml+Tris 1.3g/50ml+Tris 1.3g/50ml 双蒸双蒸双蒸双蒸水水水水pH7.65pH7.65pH7.65pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每），将细胞离心管插入碎冰中，每），将细胞离心管插入碎冰中，每），将细胞离心管插入碎冰中，每2 2 2 2 分钟摇动分钟摇动分钟摇动分钟摇动1 1 1 1 次，裂解次，裂解次，裂解次，裂解10 10 10 10 分。离心（分。离心（分。离心（分。离心（1000100010001000转转转转/分）分）分）分）5 5 5 510 10 10 10 分。弃上清，用分。弃上清，用分。弃上清，用分。弃上清，用Hanks Hanks Hanks Hanks 液洗液洗液洗液洗2 2 2 2 次，离心（次，离心（次，离心（次，离心（1000 1000 1000 1000 转转转转/分）分）分）分）5 5 5 510101010分钟。弃上清。分钟。弃上清。分钟。弃上清。分钟。弃上清。用用用用HanksHanksHanksHanks悬浮细胞，调细胞浓度到悬浮细胞，调细胞浓度到悬浮细胞，调细胞浓度到悬浮细胞，调细胞浓度到2l02l02l02l06 6 6 6/m1/m1/m1/m1。6.6.6.6.将沉积红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸将沉积红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸将沉积红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸将沉积红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸收此悬液收此悬液收此悬液收此悬液0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 放小试管中，再加放小试管中，再加放小试管中，再加放小试管中，再加0.9mlHanks 0.9mlHanks 0.9mlHanks 0.9mlHanks 液，即为液，即为液，即为液，即为500 500 500 500 倍稀释脾细胞悬倍稀释脾细胞悬倍稀释脾细胞悬倍稀释脾细胞悬液。液。液。液。溶血空斑专题知识专家讲座第9页n n眼球取血眼球取血眼球取血眼球取血 处死小鼠处死小鼠处死小鼠处死小鼠 取脾取脾取脾取脾用用用用10ml10ml10ml10ml洗洗洗洗液冲脾液冲脾液冲脾液冲脾离心离心离心离心r/min 8minr/min 8minr/min 8minr/min 8min弃上清，加裂解弃上清，加裂解弃上清，加裂解弃上清，加裂解液液液液2ml2ml2ml2ml，混匀，混匀，混匀，混匀，2min2min2min2min后离心（转数、时间同上）后离心（转数、时间同上）后离心（转数、时间同上）后离心（转数、时间同上）弃上清加洗液弃上清加洗液弃上清加洗液弃上清加洗液10ml10ml10ml10ml，混匀，离心（同上），混匀，离心（同上），混匀，离心（同上），混匀，离心（同上）n n 弃上清加弃上清加弃上清加弃上清加4.9ml4.9ml4.9ml4.9ml洗液混匀洗液混匀洗液混匀洗液混匀n n取取取取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml脾细胞悬液脾细胞悬液脾细胞悬液脾细胞悬液+0.9ml+0.9ml+0.9ml+0.9ml洗液（洗液（洗液（洗液（A A A A液），混液），混液），混液），混匀匀匀匀n n n n 取取取取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml（A A A A液）液）液）液）+0.1ml+0.1ml+0.1ml+0.1ml指示系统，混匀指示系统，混匀指示系统，混匀指示系统，混匀n n n n 取取取取50ul50ul50ul50ul加入玻片小室（约用加入玻片小室（约用加入玻片小室（约用加入玻片小室（约用30ul30ul30ul30ul）溶血空斑专题知识专家讲座第10页细胞计数板细胞计数板（HemacytometerHemacytometer）n n血球计数板，通常是一块特制载玻片，其上由血球计数板，通常是一块特制载玻片，其上由血球计数板，通常是一块特制载玻片，其上由血球计数板，通常是一块特制载玻片，其上由四条槽组成三个平台。中间平台又被一短横槽四条槽组成三个平台。中间平台又被一短横槽四条槽组成三个平台。中间平台又被一短横槽四条槽组成三个平台。中间平台又被一短横槽隔成两半，每一边平台上各刻有一个方格网，隔成两半，每一边平台上各刻有一个方格网，隔成两半，每一边平台上各刻有一个方格网，隔成两半，每一边平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间大方格即为每个方格网共分九个大方格，中间大方格即为每个方格网共分九个大方格，中间大方格即为每个方格网共分九个大方格，中间大方格即为计数室，微生物计数就在计数室中进行。计数室，微生物计数就在计数室中进行。计数室，微生物计数就在计数室中进行。计数室，微生物计数就在计数室中进行。n n计数室刻度普通有两种规格，一个是一个大方计数室刻度普通有两种规格，一个是一个大方计数室刻度普通有两种规格，一个是一个大方计数室刻度普通有两种规格，一个是一个大方格分成格分成格分成格分成16161616个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成25252525个个个个小方格；另一个是一个大方格分成小方格；另一个是一个大方格分成小方格；另一个是一个大方格分成小方格；另一个是一个大方格分成25252525个中方格，个中方格，个中方格，个中方格，而每个中方格又分成而每个中方格又分成而每个中方格又分成而每个中方格又分成16161616个小方格。但不论是哪个小方格。但不论是哪个小方格。但不论是哪个小方格。但不论是哪种规格计数板，每一个大方格中小方格数都是种规格计数板，每一个大方格中小方格数都是种规格计数板，每一个大方格中小方格数都是种规格计数板，每一个大方格中小方格数都是相同，即相同，即相同，即相同，即1625=4001625=4001625=4001625=400小方格。小方格。小方格。小方格。溶血空斑专题知识专家讲座第11页示意图示意图溶血空斑专题知识专家讲座第12页细胞计数板使用细胞计数板使用A AB BD DC C1mm1mm1mm1mm1ml=1cm1ml=1cm3 3=1000mm=1000mm3 3细胞数细胞数细胞数细胞数=A+B+C+DA+B+C+D4 4 10 104 4 稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数溶血空斑专题知识专家讲座第13页溶血空斑专题知识专家讲座第14页溶血空斑专题知识专家讲座第15页Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 4 squares/4)X 10Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 4 squares/4)X 104 4细胞数细胞数细胞数细胞数=A+B+C+DA+B+C+D4 4 10 104 4 稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数溶血空斑专题知识专家讲座第16页红细胞计数红细胞计数Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 5 squares X5)X 10Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 5 squares X5)X 104 4溶血空斑专题知识专家讲座第17页加样加样10ul 10ul 10ul 10ul 细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液溶血空斑专题知识专家讲座第18页玻片小室制作玻片小室制作取洁净载玻片按下列图贴二条宽约取洁净载玻片按下列图贴二条宽约取洁净载玻片按下列图贴二条宽约取洁净载玻片按下列图贴二条宽约5mm 5mm 5mm 5mm 和一条和一条和一条和一条10mm 10mm 10mm 10mm 双面胶，然后用小镊子取双面胶，然后用小镊子取双面胶，然后用小镊子取双面胶，然后用小镊子取二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。溶血空斑专题知识专家讲座第19页细胞混悬液配制及灌注细胞混悬液配制及灌注1.1.取小试管一支，用取小试管一支，用1ml1ml吸管取吸管取0.2ml0.2ml指示指示细胞悬液；细胞悬液；0.2ml 5000.2ml 500倍稀释脾细胞悬倍稀释脾细胞悬液，混匀后即为被检细胞混合悬液。液，混匀后即为被检细胞混合悬液。2.2.用用100l100l微量进样器吸收被检细胞混合微量进样器吸收被检细胞混合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室。统计实际注入悬液微升数。小室。统计实际注入悬液微升数。3.3.将做好标本水平放置将做好标本水平放置3737温箱中，孵温箱中，孵育育30 30 分。分。溶血空斑专题知识专家讲座第20页【结果分析结果分析】结果观察及溶血空斑计数。结果观察及溶血空斑计数。结果观察及溶血空斑计数。结果观察及溶血空斑计数。1.1.1.1.肉眼观察空斑肉眼观察空斑肉眼观察空斑肉眼观察空斑 ，计数两个小室出现溶血空斑，计数两个小室出现溶血空斑，计数两个小室出现溶血空斑，计数两个小室出现溶血空斑数。对含糊不清空斑，可在低倍镜下检验。数。对含糊不清空斑，可在低倍镜下检验。数。对含糊不清空斑，可在低倍镜下检验。数。对含糊不清空斑，可在低倍镜下检验。真正溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，真正溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，真正溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，真正溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。周围为透明区。周围为透明区。周围为透明区。2.2.2.2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：脾细胞悬液总毫升数（即为脾细胞悬液总毫升数（即为脾细胞悬液总毫升数（即为脾细胞悬液总毫升数（即为50ml50ml50ml50ml）抗体产生细胞总数抗体产生细胞总数抗体产生细胞总数抗体产生细胞总数 标本出现空斑数标本出现空斑数标本出现空斑数标本出现空斑数注入小室内脾细胞毫升数注入小室内脾细胞毫升数注入小室内脾细胞毫升数注入小室内脾细胞毫升数溶血空斑专题知识专家讲座第21页溶血空斑试验现象溶血空斑试验现象溶血空斑专题知识专家讲座第22页