PIWI相互作用RNA017724在肝细胞癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响.pdf

交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3咱文章编号暂1006-2440渊2023冤03-0235-07咱引文格式暂吴依靖，王婕，王浩，等.PIWI 相互作用 RNA017724 在肝细胞癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响 J.交通医学，2023，37（3）：235-241.*基金项目 南通市科技计划项目（JCZ2022036）；第五批全国优秀中医临床人才研修项目。*作者简介 吴依靖，女，汉族，江苏苏州人，生于 1995 年 10 月，硕士，住院医师。研究方向：消化系统疾病。通信作者：王峰，E-mail：richard原PIWI 相互作用 RNA017724 在肝细胞癌中的表达及其对细胞增殖尧凋亡尧侵袭和迁移的影响*吴依靖1袁2*袁王婕1袁2袁王浩1袁2袁陈琳2袁王慧璇2袁居林玲2袁袁柳霞2袁李民2袁王峰3渊1南通大学医学院袁江苏 226001曰2南通大学附属南通第三医院/南通市第三人民医院肝病研究所曰3南通大学附属医院检验科冤摘要目的院分析 PIWI 相互作用 RNA017724 在肝细胞癌组织、人肝癌细胞系中的表达及其对细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法院采用实时定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测肝细胞癌组织和肝癌细胞系中 PIWI 相互作用 RNA017724 的表达水平。将 PIWI 相互作用 RNA017724 模拟物和抑制剂转染 SMMC-7721 和PLC/PRF/5 细胞，采用 CCK-8 法和细胞集落形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力。结果院肝癌组织中 PIWI 相互作用 RNA017724 表达水平显著低于匹配的相邻正常肝组织，差异有统计学意义（P约0.05）；PIWI 相互作用 RNA017724 低表达患者的生存期较短。PIWI 相互作用RNA017724 抑制剂促进 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞的增殖、迁移和侵袭，而模拟物抑制 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞的增殖、迁移和侵袭。PIWI 相互作用 RNA017724 对细胞凋亡无明显作用。结论院PIWI 相互作用 RNA017724 抑制 HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭。关键词肝细胞癌；PIWI 相互作用 RNA017724；增殖；迁移；侵袭；凋亡中图分类号R735.7文献标志码ADOI10.19767/ki.32-1412.2023.03.003The expression of piRNA-017724 inhepatocellular carcinoma andits effectson cell proliferation,apoptosis,invasion and migrationWU Yijing1袁2,WANG Jie1袁2,WANG Hao1袁2,CHEN Lin2,WANG Huixuan2,JU Linling2,YUAN Liuxia2,LI Min2,WANG Feng3(1Medical School,Nantong University,Jiangsu 226001;2Affiliated Nantong Hospital 3 of Nantong University/Institute ofLiver Diseases,Nantong Third People爷s Hospital;3Central Lab,Affiliated Hospital of Nantong University冤AbstractObjective:To explore the expression of piRNA-017724 in hepatocellular carcinoma tissue and humanliver cancer cell line,and its effects on cell proliferation,apoptosis,invasion and migration.Methods:Relative piRNA-017724 expression in hepatocellular carcinoma tissue and liver cancer cell line was measured by real-time quantitativePCR(RT-qPCR).piRNA-017724 mimic and inhibitor were transfected into SMMC-7721 and PLC/PRF/5 cells.CCK8 methodand cell colony formation assay were used to detect cell proliferation,flow cytometry was used to detect cell apoptosis,andTranswell assay was performed to detect cell migration and invasion.Results:piRNA-017724 in hepatocellular carcinomatissue was significantly lower than that in adjacent normal liver tissue,the difference was statistically significant渊P约0.05冤;and the patients with low expression of piRNA-017724 had shorter survival.The piRNA-017724 inhibitor promoted theproliferation,migration and invasion of SMMC-7721 and PLC/PRF/5 cells,while the piR-hsa-017724 mimic inhibited theproliferation,migration and invasion of SMMC-7721 and PLC/PRF/5 cells.However,piRNA-017724 had no affect on cellapoptosis.Conclusions:piRNA-017724 inhibits the proliferation,migration and invasion of HCC cells.Key wordshepatocellular carcinoma;piRNA-017724;proliferation;migration;invasion;apoptosis235窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占绝大多数。HCC 的危险因素包括自身免疫性肝炎、酗酒、糖尿病和慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染1-3。虽然近年来涌现许多HCC 免疫疗法和靶向治疗，但患者总体预后仍较差，术后复发和转移率很高4-6。HCC 中存在多种基因表达变化，识别在发病机制中具有重要作用的基因有助于开发有效治疗靶点。近年来，PIWI 与 RNA相互作用成为新的研究热点。研究表明，PIWI 相互作用 RNA 可能在癌症的发展中发挥重要作用，并可能作为诊断和预后的生物标志物7-10。RIZZO 等11发现 PIWI 相互作用 RNA 017724（piRNA-017724）在肝细胞肝癌中异常表达。本研究选取南通大学附属南通第三医院/南通市第三人民医院行肝癌根治术 45例肝癌组织及其匹配的相邻正常肝组织，分析 PIWI相互作用 RNA 017724 的表达水平及其与预后的相关性，探索其在 HCC 发病机制中的潜在作用。1资料与方法1.1一般资料肝癌患者 45 例，经病理证实均为肝细胞癌，其中男性 36 例，女性 9 例，臆50 岁 13例，跃50 岁 32 例；血清 AFP臆20 ng/mL 18 例，跃20 ng/mL27 例；肿瘤直径臆3 cm 1 例，跃3 cm 44 例；无侵袭32 例，发生侵袭 13 例；肿瘤 TNM 分期 I/II 期 11 例，III/IV 期 34 例。本研究经南通市第三人民医院临床研究伦理委员会批准，患者均知情同意。1.2细胞培养永生 LO2 人肝细胞、人肝癌细胞系（SMMC-7721、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1、Huh-7、MHCC-97H、HCC-LM3）均购自上海细胞库。将 LO2细胞、SMMC-7721、Li-7 细胞置于 RPMI-1640 培养基（Gibco）中培养，PLC/PRF/5、SK-HEP-1 细胞在添加碳酸氢钠和丙酮酸钠的 MEM 培养基中培养，Huh-7、MHCC-97H、HCC-LM3 细胞在 Dulbecco 改良伊格尔培养基（Gibco）中培养，所有培养基均添加10%胎牛血清（Cell Sciences，Canton，MA），在 37 毅C、5%CO2培养箱中培养。1.3实时定量 PCR 渊RT-qPCR冤 检测使用 Trizol试剂从细胞和手术切除肝癌组织及其匹配的相邻正常肝组织中提取总 RNA，使用 Bulge-LoopTM qPCR试剂盒（锐博生物，中国广州）进行 RT-qPCR，检测PIWI 相互作用 RNA017724 的表达水平。采用 U6小核 RNA 作为内参对照，RNA 相对表达量以幂值（2-吟吟Ct）计算。1.4细胞转染PIWI 相互作用 RNA017724 模拟物和抑制剂及相应的阴性对照物由锐博生物合成。将SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞接种在 6 孔板中，培养过夜。分为过表达 PIWI 相互作用 RNA017724 组（mi-017724）及其空白对照组（mi-NC），敲低 PIWI相互作用 RNA017724 组（in-017724）及其空白对照组（in-NC）。根据制造商说明书，两种溶液混合后，将混合物添加到 6 孔板中。转染 48 h 后收集细胞，进行后续实验。1.5细胞增殖试验采用 CCK-8 法检测细胞活力，按照试剂盒（Sigma，USA）说明书操作。将转染48 h 的肝癌细胞用胰蛋白酶消化，以每孔 3伊103个细胞密度接种到 96 孔板，培养过夜。每孔加入 10 滋LCCK-8 试剂，37 毅C 孵育 2.5 h。在酶标仪（ThermoFisher，USA）450 nm 处测量吸光度。1.6细胞集落形成试验转染 48 h 的肝癌细胞经胰蛋白酶化，制备单细胞悬液，以每孔 2 000 个细胞密度接种到 6 孔板中。每 3 天更换 1 次培养基，培养2 周以获得细胞集落。磷酸盐缓冲液清洗，4%多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色。洗涤并在空气中干燥后，对细胞集落进行拍照和计数。1.7细胞凋亡检测应用 Annexin V/7-AAD Apop原tosis Detection Kit（BD 公司，美国）对细胞进行染色，使用 FlowJo 软件（BD 公司）通过流式细胞术评估细胞凋亡。1.8Transwell 试验采用 transwell 室（Corning 公司，NY，USA）测试细胞侵袭和迁移能力。转染 48 h后肝癌细胞经胰蛋白酶消化，收集后离心，基培重悬。以每孔 2伊105个细胞接种到小室中，将 600 滋L含 20%FBS 培养基加至下室中。37 毅C、5%CO2培养箱中培养 24 h，用棉签去除 transwell 膜上表面的残留细胞。transwell 膜下表面迁移的细胞用 4%多聚甲醛固定，PBS 洗涤，结晶紫染色 8 min。侵袭实验需在transwell 膜预涂基质胶（BD Biosciences，USA）。用光学显微镜（Olympus，Japan）对 transwell 膜下表面的细胞进行拍照，计算 3 个随机视野的细胞数。1.9统计学处理应用 SPSS 25.0 统计学软件对数据进行分析处理。计量资料以x 軃 依s 表示，组间比较采用 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。236窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3A：PIWI 相互作用 RNA017724 在肝癌细胞系中低表达。B：RT-qPCR 检测验证 SMMC-7721 细胞的转染效率。C：RT-qPCR 检测验证 PLC/PRF/5 细胞的转染效率。*P0.05，*P0.01，*P0.001，*P0.0001。图 2肝癌细胞 PIWI 相互作用 RNA017724 表达及转染效果A：PIWI 相互作用 RNA017724 在 HCC 组织中低表达。B：PIWI 相互作用 RNA017724 表达与肝癌患者预后的关系。*P0.01图 1肝癌组织中 PIWI 相互作用 RNA017724 表达及其与患者预后的关系2结果2.1肝癌组织中 PIWI 相互作用 RNA017724 表达及其与患者预后的关系RT-qPCR 检测显示，与正常肝组织比较，肝癌组织中 PIWI 相互作用RNA017724低表达，差异有统计学意义（P约0.01）（图 1A）。根据PIWI 相互作用 RNA017724 临界值，将 45 例患者分为 PIWI 相互作用 RNA017724-high 组和low 组，结果显示 PIWI 相互作用 RNA017724 水平与患者的预后密切相关，与高表达组患者比较，低表达组患者生存期较短，差异有统计学意义（P约0.05）（图 1B）。2.2肝癌细胞 PIWI 相互作用 RNA017724 表达及转染效果RT-qPCR 检测显示，与正常 LO2 肝细胞比较，各肝癌细胞系 PIWI 相互作用 RNA017724 表达显著减少，差异均有统计学意义（P约0.05）（图 2A）。SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞转染 PIWI 相互作用RNA017724 抑制剂后，PIWI 相互作用 RNA017724表达降低，转染 PIWI 相互作用 RNA017724 模拟物后，PIWI 相互作用 RNA017724 表达增加（图 2B、C），说明转染成功。2.3PIWI 相互作用 RNA017724 抑制肝癌细胞增殖能力CCK-8 实验显示，抑制 PIWI 相互作用RNA017724 表达后 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞活力显著增加，而增加 PIWI 相互作用 RNA017724表达后两种细胞活力降低（图 3A、B）。细胞集落形成实验显示，PIWI 相互作用 RNA017724 降低 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞集落数量（图 3C、D）。生存时间渊月冤P=0.0095P=0.0218n=45237窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3A：PIWI 相互作用 RNA017724 敲低和过表达时 SMMC-7721 细胞的增殖能力。B：PIWI 相互作用 RNA017724 敲低和过表达时PLC/PRF/5 细胞的增殖能力。C、D：PIWI 相互作用 RNA017724 敲低和过表达时 SMMC-7721 细胞、PLC/PRF/5 细胞集落形成能力。*P0.05，*P0.001。图 3PIWI 相互作用 RNA017724 表达对肝癌细胞增殖的影响2.4PIWI 相互作用 RNA017724 表达对肝癌细胞凋亡的影响流式细胞仪检测发现，过表达 PIWI 相互作用 RNA017724 和敲除 PIWI 相互作用RNA017724对 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞凋亡无显著影响（图 4）。A、B：流式细胞术检测 PIWI 相互作用 RNA017724 敲低和过表达对 SMMC-7721 细胞凋亡的影响。C、D：流式细胞术分检测 PIWI相互作用 RNA017724 敲低和过表达对 PLC/PRF/5 细胞凋亡的影响。图 4PIWI 相互作用 RNA017724 对肝癌细胞凋亡的影响238窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3A、B：敲低和过表达 PIWI 相互作用 RNA017724 对 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞迁移的影响。C、D：敲低和过表达 PIWI 相互作用 RNA017724 对 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞侵袭的影响。*P0.05，*P0.01，*P0.001，*P0.0001。图 5PIWI 相互作用 RNA017724 对肝癌细胞迁移和侵袭的影响2.5PIWI 相互作用 RNA017724 抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力transwell 实验显示，与 in-NC 组比较，敲低 PIWI 相互作用 RNA017724 表达增加 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞的迁移能力，而与 mi-NC 组比 较，PIWI 相 互 作 用 RNA017724 过 表 达 抑 制SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞的迁移能力（图 5A、B）。与 mi-NC 组比较，PIWI 相互作用 RNA017724过表达抑制 SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 细胞的侵袭能力，而与 in-NC 组比较，抑制 PIWI 相互作用RNA017724 表达增强细胞侵袭能力（图 5C、D）。表明 PIWI 相互作用 RNA017724 可以抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。3讨论PIWI 相互作用 RNA 是一类新发现的小非编码RNA（ncRNA）12-13，迄今为止已鉴定出 20 000 多个PIWI 相互作用 RNA14-15。一些研究表明，PIWI 相互作用 RNA 在生殖细胞中广泛表达。高通量测序表明，PIWI 相互作用 RNA 信号通路在人类癌细胞中也很活跃16-20，可能在癌症发展过程中发挥作用。PIWI 相互作用 RNA 通过调节转录和转录后水平的基因表达影响癌细胞多种过程，包括细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭17，21。已证明，PIWI 相互作用 RNA 通过直接结合 PIWI 蛋白表现出促癌或抗癌作用22。PIWI 相互作用 RNA 的异常表达与多种癌症有关，可能参与癌症发生、发展和转移。PIWI 相互作用RNA 与胃癌的恶性程度密切相关，胃癌组织中 PIWI相互作用 RNA651 和 PIWI 相互作用RNA823 异常表达与患者预后密切相关，可作为胃癌的诊断工具或治疗靶点23-25。PIWI 相互作用 RNA 在乳腺癌的发239窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3病中具有重要作用26-28。PIWI 相互作用 RNA 与肾癌的转移和预后密切相关29-31。PIWI 相互作用 RNA 作为结直肠癌诊断工具和治疗靶点具有重要临床意义32-37。PIWI 相互作用 RNA55490 在肺癌组织中的表达降低，抑制 PIWI 相互作用 RNA55490 表达可以通过抑制肺癌细胞中 mTOR 通路的激活来促进肺癌细胞的增殖。这表明 PIWI 相互作用 RNA55490 在肺癌的发生中可能具有抗癌作用19。PIWI 相互作用RNA651 参与非小细胞肺癌的发生、侵袭和转移，可能是一种潜在的癌症诊断工具38-40。既往研究表明，PIWI 相互作用 RNA017724 在肝细胞癌中异常表达。本研究结果显示，PIWI 相互作用 RNA017724 在肝细胞癌组织中显著下调，PIWI相互作用 RNA017724 低表达患者预后较差。当上调PIWI 相互作用 RNA017724 时，肝癌细胞侵袭、迁移和增殖能力受到抑制，下调 PIWI 相互作用RNA017724 则促进肿瘤细胞侵袭、迁移和增殖。有研究表明，上皮间充质转化（EMT）41、WNT/茁-连环蛋白通路42-43影响细胞增殖、侵袭和迁移。推测 PIWI相互作用 RNA017724 可能通过这些途径影响肝细胞癌的发生发展，有待后续进一步实验研究。PIWI相互作用 RNA017724 在 HCC 的发生和发展中发挥重要作用，并可能作为诊断和预后的生物标志物。参考文献1 魣LVAREZ E G，DEMEULEMEESTER J，OTERO P，et al.Aberrant integration of Hepatitis B virus DNA promotes ma原jor restructuring of human hepatocellular carcinoma genomearchitecture J.Nat Commun，2021，12（1）：6910.2 LOCKART I，YEO M G H，HAJARIZADEH B，et al.HCCincidence after hepatitis C cure among patients with ad 原vanced fibrosis or cirrhosis：a 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