艾叶配方颗粒HPLC特征图谱及含量的测定.pdf

第14卷第14期2023年7 月黑龙江科学HEILONGJIANG SCIENCEVol.14Jul.2023艾叶配方颗粒HPLC特征图谱及含量的测定朱亚文,欧阳习叶,唐正平,易跃能（1.湖南易能生物医药有限公司，长沙410 2 2 1；2.湖南春光九汇现代中药有限公司，湖南浏阳410 330）摘要：采用高效液相色谱法测定艾叶配方颗粒中的绿原酸及挥发油含量，建立该制剂的特征图谱。色谱柱为Agilent5TC-C18(150mm4.6mm,3.0m），流动相为乙睛-0.1%甲酸溶液（梯度洗脱），流速1.0 mLmin=,检测波长32 5nm，柱温30。对相对保留时间进行评价，确定共有峰。结果表明，15批标准汤剂样品的HPLC图谱中有6 个共有峰，2 号峰为绿原酸。绿原酸浓度在0.6 2 6 325.0013mgg（=0.999），与峰面积线性关系良好，精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0 0%（n=6），平均加样回收率为9 8.9 6%（n=6）,R SD 为0.7 5%。15批煎液中挥发油平均转移率为9.47%。结果说明，该方法简单，准确，重复性好，可用于艾叶配方颗粒的质量评价。关键词：艾叶配方颗粒；特征图谱；绿原酸；挥发油；HPLC；含量测定中图分类号：0 6 57.7 2;R286.0HPLC Characterization and Content Determination of ArtemisiaZhu Yawen,Ouyang Xiye,Tang Zhengping,Yi Yueneng(1.Hunan Yineng Biological Medicine Co.,LTD.,Changsha 410221,China;2.Hunan Chunguang Jiuhui Modern Chinese Medicine Co.,LTD.,Liuyang 410330,China)Abstract:The contents of chlorogenic acid and volatile oil in Artemisia mugwort formula granules are determined byhigh performance liquid chromatography(HPLC),and the characteristic spectrum of the preparation is established.Thedetermination is performed on Agilent 5TC-C18(150 mm 4.6 mm,3.0 m)column with mobile phase consisted ofacetonitrile-0.1%formic acid solution(gradient elution)at the flow rate of 1.0 mL min-1.The detectionwavelength is 325 nm and column temperature is 30 C.The relative retention time is evaluated to determine thecommon peak.The results showed that there are 6 common peaks in the HPLC chromatogram among 15 batches ofstandard decoction samples,and the second peak is chlorogenic acid.The concentration of chlorogenic acid ranges from0.6263 to 25.0013 mg:g-(r2=0.999),which has a good linear relationship with peak area.RSDS of precision,stability and repeatability tests are all less than 2.00%(n=6),the average recovery rate is 98.96%(n=6),andRSD is 0.75%.The average transfer rate of volatile oil in 15 batches is 9.47%.The results show that the method issimple,accurate and reproducible,and can be used to evaluate the quality of Artemisia argyi formula granules.Key words:Artemisia argyi formula granules;Specific chromatogram;Chlorogenic acid;Essential oil;HPLC;Contentmeasurement叶的主要化学成分为挥发油、黄酮类、类、苯丙素类、0引言艾叶配方颗粒为符合炮制规范的艾叶饮片（Arte-misiaargyiLevl.etVant.菊科植物艾的干燥叶）按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒，作为传统中药饮片的有益补充被应用于临床。研究表明,艾收稿日期:2 0 2 3-0 5-0 2作者简介：朱亚文（19 7 7）,女（侗族），本科，执业药师。研究方向：中药新药研发。通讯作者：易跃能（19 7 5），女，博士，主任药师。研究方向：中药新药研究。86文献标志码：AArgyi Formula Granules文章编号：16 7 4-8 6 46(2 0 2 3)14-0 0 8 6-0 4有机酸类、留体类、多糖类及微量元素等。非挥发性成分中,黄酮类与苯丙素类化合物含量较高且易于检测，常作为指标性成分用于含量测定及指纹图谱的研究1。本研究按照中国药典2 0 2 0 年版一部,参考有关文献2-4,以艾叶为对照药材，通过对艾叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的相关性研究5,为艾叶配方颗粒质量标准的建立提供参考。1仪器与试药1.1仪器Wayeal3100高效液相色谱仪（安徽皖仪科技股份有限公司生产），Agilent1100高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司生产）,BSA124S赛多利斯科学仪器（北京)有限公司生产,DHG-9246A电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司生产），KQ-250E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产）。1.2试药艾叶配方颗粒共3批，由湖南春光九汇现代中药有限公司提供。绿原酸对照品（批号：110 8 7 9-2 0 17 0 3，纯度9 9.7%）、艾叶对照药材（批号：12 1130-2 0 2 10 7）。乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水。2方法与结果2.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（150 mm4.6mm,3.0m），流动相A：乙腈，流动相B:0.1%甲酸溶液。梯度洗脱(0 4min时10%A,440min时10%A28%A),流速1.0 mLmin-1,检测波长32 5nm，进样量10 L,柱温30。理论板数按绿原酸峰计应不低于7 0 0 0。2.2溶液制备对照药材溶液：取艾叶对照药材0.1g,加水2 5mL，回流提取30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加8 0%甲醇2 5 mL溶解,并转移至具塞锥形瓶中,超声处理(250W,40kHz)30min，放冷，摇匀，过滤，取续滤液即得。5000148004600440042004000380036003400320030002800号2600信22400220020001800160014001200100080060040020000供试品色谱中应呈现6 个特征峰，应与对照药材参照物色谱中的6 个特征峰保留时间相对应，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在对照品溶液：精密称定绿原酸对照品，加8 0%甲醇溶解，制成每1mL含7 5g的溶液即得。供试品溶液：精密称定艾叶配方颗粒0.2 g，置具塞锥形瓶中,加人8 0%甲醇2 5mL，称定重量，超声处理（2 0 0 W,40kHz)30min后，放冷，用8 0%甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液即得。阴性对照溶液：制备艾叶配方颗粒阴性样品，按供试品溶液方法处理。2.3特征图谱2.3.1方法学考察精密度实验：取供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定。重复性实验：取样品适量，按“2.2”项下制备供试品溶液，再按“2.1 项色谱条件进样测定。稳定性实验：取供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、18、2 4h，按“2.1”项色谱条件进样测定。2.3.2特征图谱的建立及相对保留时间评价按艾叶配方颗粒处方制备15批煎剂，按“2.1”项下色谱条件进样测定，15批煎剂特征图谱见图1。在最优的特征图谱色谱条件下，供试品一共呈现与标准汤剂、对照药材一致的6 个明显的峰,对各个峰采用对照品定位指认,指认峰2 为阿魏酸且峰响应值较高，故以峰2 阿魏酸作为S峰。人人人人人510Fig.1 15 batches of standard HPLC overlapping characteristicS15(6)S14(6)S13(6)S12(6)S11(6)s10(6)s9(6)8(6)S7(6)S6(6)5(6)S4(6)S3(6)S2(6)$1(6)R(6)1520图115批标准煎剂高效液相色谱重叠特征图谱25时间/min规定值的10%范围内。规定值分别为0.56（峰1）、1.11（峰3）、2.8 9（峰4）、3.0 2（峰5）3.2 9（峰6）,结果见图2。30354045505587300280260240220200180160140120100806040200024681012 1416 18202224 26 283032343638404244 4648时间/min图2 艾叶配方颗粒高效液相色谱对照特征图谱Fig.2HPLC reference characteristic of Artemisia argyi formula granules2.4指标成分含量测定2.4.1方法学考察专属性试验：分别取供试品溶液、参照物溶液及空白溶剂,按照“2.1 项色谱条件进样采集。结果表明，mAU2001501005000mAU2000001150000100000500000-500000mAU3001250200150100500mAU20015010050008841512(S)355510to09/516供试品色谱中呈现6 个特征峰，与对照药材参照物色谱中的6 个特征峰保留时间相对应,阴性对照无干扰峰,结果见图3。Btz:oL1010152OE/EL10R(6)1520A.对照品溶液1520时间/minB.阴性溶液2025时间/minC.对照药材溶液1520时间/minD.供试品溶液图3高效液相色谱图Fig.3HPLC chromatogram252530253030303592O.ZS/S3535354040404045454545线性关系考察：精密量取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以浓度（C）为横坐标,以峰面积（A)为纵坐标，作标准曲线。结果表明，绿原酸浓度为5.0 1 2 0 0.0 1mgmL-1,即供试品绿原酸含量范围为0.6 2 6 3 2 5.0 0 13mgg,回归方程为y=32167x-103963,R=0.999,线性良好。仪器精密度试验：取对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果表明，保留时间（t)与峰面积(A)RSD均小于2%，仪器精密度良好。稳定性试验：精密称取艾叶配方颗粒适量，按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备。分别在0、2、4、8、12、18、2 4h 按“2.1”项所述色谱条件进样测定，绿原酸峰的保留时间（t）与峰面积（A）的RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在室温下放置2 4h稳定。重复性试验：精密称定样品6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按2.1”项下色谱条件进行测定,计算绿原酸含量。样品中绿原酸的平均含量为5731.64gg,RSD值为0.1%，表明该方法的重复性良好。中间精密度试验：不同人员用不同仪器对同一批供试品进行测定，结果均值为57 16.8 9 gg,RSD为1.4%，小于2%，表明本方法中间精密度好。准确度试验：精密称取供试品0.1g，按供试品含量约10 0%浓度水平进行前加标（加标被测物质浓度1000gmL-1,加标体积为0.57 mL），按“2.2”项下供试品制备方法制备，依据重复性试验结果作为样品均值含量计算回收率，平均回收率为9 8.9 6%，RSD值为0.7 5%,结果表明该方法准确度良好。2.4.23批样品含量测定采用上述色谱方法，对3批艾叶配方颗粒进行含量测定,结果分别为0.2 7 9 mggl、0.30 7 mg：g、0.253mgg-1,RSD分别为1.3%、0.9%、0.6%,均小于2%,结果可靠。2.4.3挥发油对15批次标准汤剂中挥发油进行研究,因10 0 g饮片标准汤剂滤液中仅提取到少量挥发油，为方便读数，扩大样品量考察标准汤剂中挥发油情况。将15批饮片加大投料量至50 0 g/批，每批5份（每份10 0 g），按标准汤剂工艺煎煮，合并滤液进行收油考察，15批标准汤剂中挥发油的平均转移率为9.47%，均值30%，转移率范围为6.6 3%12.32%，转移率分布范围相对集中。综合考虑挥发油使用剂量的安全性，建议按转移率9.47%计算艾叶配方颗粒生产工艺中挥发油的加人量。3讨论参照医疗机构中药煎药室管理规范中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求，以出膏率、指标/主要成分转移率、特征图谱为指标，对提取、固液分离、浓缩、干燥、制剂环节进行考察，以确保艾叶配方颗粒与标准汤剂质量的一致性。根据研究结果确定了艾叶配方颗粒的制备工艺与参数：取艾叶饮片40 0 g，加热提取两次，一煎加10 倍水量，沸腾提取2 h，二煎加8倍水量，沸腾提取1h，150 目滤布趁热过滤，合并滤液,7 0 8 0 下减压浓缩至相对密度为1.0 51.10（6 0），150 目滤布趁热过滤，加辅料适量喷雾干燥,再加辅料适量，16 目筛网干法制粒,6 5目筛网整粒,即得。艾叶配方颗粒依据饮片含挥发油含量不得少于0.4%（mLgl）,按平均转移率推算冻干粉中挥发油的下限为0.0 14%（mLg=），挥发油收集量占冻干粉中比例不到1%o。药材与饮片中龙脑、按油精两成分的含量低下限分别为0.0 2 0%、0.0 50%，参照标准汤剂提取试验结果中挥发油转移率，则标准汤剂中龙脑、油精的含量低于万分之一，故不选择中国药典中的这两个挥发油成分指标作为含量测定，只将挥发油包合后加人干膏粉中制粒。中药配方颗粒在质量控制上缺少饮片性状等重要指标，在质量控制标准制订过程中测定指标应多元化。对15批标准汤剂拟合出对照指纹图谱，与中试生产3批配方颗粒相拟合,指认出6 个共有峰,测定绿原酸含量。通过实验研究建立的方法操作简单、准确，结合含量测定及指纹图谱，可为艾叶配方颗粒的质量评价提供参考。参考文献：1】兰晓燕，张元，朱龙波，等.艾叶化学成分、药理作用及质量研究进展J.中国中药杂志，2 0 2 0，45（17）：40 17-40 30.2中国药典委员会.中华人民共和国药典S.北京：化学工业出版社,2 0 2 0:2 0 3 2 0 4.3国家药典委员会.中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求S.国家药典委员会，2 0 2 1.4陈士林,刘安,李琦,等.中药饮片标准汤剂研究策略J.中国中药杂志,2 0 16,41(0 8）：136 7-137 5.5简梨娜，宋学丽,郭江涛，等.艾草的化学成分及临床应用J.化学工程师,2 0 2 1,35(0 7):58-6 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