产KPC酶肺炎克雷伯菌对头孢他啶_阿维巴坦耐药机制研究进展.pdf

.160.World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5产KPC酶肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦耐药机制研究进展郑媚，匡徐，李甫豪，冯可莹，于洋1（1华南农业大学，广州510 6 42；2 菲鹏生物股份有限公司，东莞52 38 0 8)摘要：头孢他啶/阿维巴坦(Ceftazidime/Avibactam，CZA)是头孢他啶和一种新型-内酰胺酶抑制剂(阿维巴坦)的组合，已被美国食品药品监督管理局和国家市场监督管理总局批准，主要用于治疗复杂的腹部和尿道感染、医院获得性细菌性肺炎和呼吸机相关的细菌性肺炎，特别是由肺炎克雷伯菌引起的感染和炎症。然而，CZA临床应用导致了多重耐药肺炎克雷伯菌的出现。其耐药机制主要有三种：blakpc基因的突变、细菌细胞膜孔蛋白突变和KPC酶的表达量增加。本文就耐CZA的肺炎克雷伯菌流行情况和耐药机制进行综述，旨在为临床防治CZA的耐药菌株提供科学依据，并为新药开发提供指导。关键词：产KPC酶肺炎克雷伯菌；头孢他啶；阿维巴坦；耐药机制；作用机理；突变中图分类号：R978.1文献标志码：A文章编号：10 0 1-8 7 51(2 0 2 3)0 3-0 16 0-0 6Research Progress on the Resistance Mechanism of KPC-Producing Klebsiellapneumoniae to Ceftazidime/AvibactamZheng Meil,Kuang Xu,Li Fu-hao,Feng Ke-ying,Yu Yang(1 South China Agricultural University，G u a n g z h o u 510 6 42;2 Fe i p e n g Bi o t e c h n o lo g y C o.,Lt d,D o n g g u a n 52 38 0 8)Abstract:Ceftazidime/avibactam(CZA)is a combination of ceftazidime and a novel-lactamase inhibitor(avibactam)approved by the U.S.Food and Drug Administration and the State Administration of China for thetreatment of complex abdominal and urinary tract infections,hospital-acquired bacterial pneumonia,and ventilator-associated bacterial pneumonia,particularly those caused by Klebsiella pneumoniae.However,the clinical use of CZAhas led to the emergence of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae.There are three main mechanisms of drugresistance:mutation of blakpc,mutation of cell membrane pore protein,and increased expression of KPC enzyme.The article reviews the prevalence and mechanism of Klebsiella pneumoniae resistant to CZA,aiming to providescientific basis for the clinical prevention and treatment of drug-resistant strains of CZA and provide guidance for thedevelopment of new drugs.Key words:KPC-producing Klebsiella pneumoniae;ceftazidime;avibactam;drug resistance;mechanismmechanism of action;mutation1碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)流行现状据估计，在世界范围内，因细菌感染引起的死亡人数每年可达7 0 0,0 0 0，预计到2 0 50 年，将有10 0 0万人死于多重耐药性微生物引起的相关疾病。抗生素耐药性已成为当今最紧迫的公共卫生挑战之一，而肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种重要的革兰阴性机会致病菌，具有超强的环境适应能力，除污水、土壤、地表水、工业废水和植被外，肺炎收稿日期：2 0 2 2-11-0 6作者简介：郑媚，硕士研究生，主要从事细菌耐药性研究。*通讯作者：于洋，副教授，主要从事细菌耐药性以及药动药代等研究。克雷伯菌还可寄居在易感人类和动物粘膜表面，并诱导局部组织感染，包括尿路感染、菌血症、肺炎及肝脓肿等，或诱发全身性感染，如败血症等，甚至危及患者生命2-3。肺炎克雷伯菌被列为ESKAPE病原体，已成为我国仅次于大肠埃希菌的第二大革兰阴性致病菌，其菌体细胞内可携带多种高效的可移动性抗菌药物耐药性维持和传播的遗传元件，是抗生素耐药性(Antimicrobial Resistance，A M R)在国外医药抗生素分册2 0 2 3年5月第44卷第3期人、动物和环境中传播的重要媒介。在抗菌药物压力下，由于这些质粒、转座子、插入序列等可移动元件，肺炎克雷伯菌已进化出多种抗菌药耐药性表型，且耐药基因在种属间及跨种属间广泛传播，导致出现了具有“超级耐药性”的泛耐药菌株(Extensivedrug resistance，X D R)4。碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(Carbapenems resistant K.pneumoniae,CRKP)在国内外有越来越多的报道。在意大利，美国纽约州感染CRKP引起的死亡率分别为41.6%和48%。其中，ST258以及ST512是CRKP在美洲和南欧的主要克隆株5-6 。值得注意的是，根据我国抗菌药物监测网络(CHINET)报道显示，在我国肺炎克雷伯菌对美罗培南和亚胺培南的耐药率上升8 倍以上7 。近十年间，CRKP在我国广泛传播，流行范围几乎覆盖了所有省份，且引起了较高的临床发病率；其中基因型ST11是我国CRKP感染中最主要的MLST分型8 。而ST11和ST258属于克隆复合物CC258，其包含ST11、ST 2 58 和另外五个分型ST270、ST 340、ST379、ST 40 7 和ST4189。此外，新出现的ST307也被认为是一种高危克隆型，其在医院的高流行率应该引起重视10 。CRKP菌株中碳青霉烯酶编码基因包括KPC、ND M、O X A、I M P、V I M，最主要的碳青霉烯酶基因是blakpe2,blaNDM1，b l a o x-4s，其中ST11型携带blakpc-2的肺炎克雷伯菌的克隆传播速度惊人。CRKP感染通常具有较高的发病率和死亡率，给临床治疗带来了严峻的挑战12-13。2CZA使用现状以及作用机理目前用于治疗CRKP感染的抗生素选择十分有限，主要包括多黏菌素、替加环素和氨基糖苷类药物，因此呕需有效的治疗CRKP感染的方法。头孢他啶/阿维巴坦(CZA)由阿斯利康制药有限公司开发，于2 0 15年2 月获得美国食品和药物管理局批准14-15,并于2 0 19 年底在中国投入使用。它将广谱头孢菌素头孢他啶与新型非-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦结合，用于治疗复杂的腹部和尿道感染、医院获得性细菌性肺炎和呼吸机相关的细菌性肺炎16 。毫无疑问，CZA的出现为对抗CRKP感染提供了十分宝贵的替代方案。值得注意的是，尽管CZA对大多数碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌都是敏感的，但是在我国临床使用CZA之前就已经出现了对该药物的耐药菌17 。有研究表明，KPC-2单个基因替换突变使得阿维巴坦对KPC的-内酰胺酶失去抑制作用18 ，以及突变的KPC-3酶显著降低了肺炎克雷伯菌对CZA的易感性19。一.161.方面阿维巴坦可以保护头孢他啶免受KPCs、O X A-48、A m p C等-内酰胺酶的水解，但无法抵抗金属-内酰胺酶(MBLs)，如NDM、V I M 或IMP的水解。因此，阿维巴坦可恢复头孢他啶对KPC阳性肺炎克雷伯菌(KPC-Kp)的活性，在受到KPC酶亲核进攻后，阿维巴坦的酰胺键断开，从而开环与酶形成共价结合物，进而达到抑制效果。与他唑巴坦、克拉维酸等经典的“自杀式酶抑制剂”不同的是，酶-抑制剂复合体不发生水解，经环合形成内酰胺环可又形成阿维巴坦，因此具有长效抑酶作用2 0 。3产KPC酶肺炎克雷伯菌对CZA的耐药机制据报道，KPC-Kp对CZA的耐药机制主要有三种，包括blakpc基因的突变所引起的KPC酶上的氨基酸取代/缺失/插入，KPC酶的表达量增加和细菌细胞膜孔蛋白突变。3.1blakpc基因的突变blakpc基因由8 7 9个碱基组成，当基因发生突变时，会引起肺炎克雷伯菌所表达的KPC酶发生变化，当blakpc基因出现碱基置换时，其结果对应的是氨基酸的单取代或多取代；当blakpc基因出现多个碱基缺失和插入时，其结果对应的是KPC酶的氨基酸缺失或者插入，值得注意的是，临床上所出现的blakpc基因变体所插入或者缺失的碱基数均是3的倍数，所以并未出现移码突变而导致KPC酶的结构大幅改变。近年来，携带blakpc基因亚型的肺炎克雷伯菌在世界范围内迅速出现，自2 0 2 0 年以来报告的新型KPC酶变体数量超过了前17 年的总和。迄今为止，NCBI参考基因目录共收录了12 3个KPC酶变体，其中有16 个变体来自临床报道的CZA耐药肺炎克雷伯菌，于表1中列出。总体而言，导致肺炎克雷伯菌对CZA耐药产生的blakpc基因突变以置换为主，表现为KPC酶的氨基酸取代。其中，以第17 9位的天冬氨酸被其余氨基酸取代最为常见。研究显示在一株分型为ST258的临床肺炎克雷伯菌中发现了KPC-3变体Asp179Tyr，命名为KPC-33；另有研究报道在一株分型为ST11的临床菌株中发现了KPC-2变体Asp179Ala，命名为KPC-78；这些菌株对CZA的敏感性均下降，其对CZA的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)与亲本菌株相比分别上升了6 4倍和16 倍17-18 。研究显示通过定点饱和突变技术获得了19种不同的Asp179变异体，并使用质谱分析和比较酶促动力学参数确定了一种特别值得关注的变异体一Asp179Asn，其.162.突变体KPC-78KPC-33KPC-14KPC-76KPC-79KPC-23KPC-28KPC-39KPC-46KPC-50KPC-51KPC-52KPC-53KPC-70KPC-71KPC-93可以帮助肺炎克雷伯菌对多种-内酰胺类药物和-内酰胺类抑制剂的组合产生抗性2 3。Alsenani等2 4在分析了Asp179N和Asp179Tyr的晶体结构之后，发现Asp179Asn和Asp179Tyr的存在破坏了Q环上盐桥的稳定性，从而使得KPC酶更容易与头孢他啶结合，从而使得肺炎克雷伯菌对CZA耐药。同样的机理可以用以解释KPC-39(Ala172Thr)和KPC-46(Leu168Phe)变体所引起的CZA抗性，因为它们的突变位点也处于KPC酶的Q环上(Arg164-Asp179),其上的突变会导致分子间的氢键作用减弱，从而使得Q环结构变得不稳定而易于头孢他啶结合；同时，有研究报道Q环上盐桥被破坏后，会使得KPC酶与阿维巴坦的亲和力降低，从而使得阿维巴坦不能有效抑制KPC酶。除氨基酸取代外，由于KPC酶上出现氨基酸插入和缺失等突变而引起的CZA耐药在近几年也时有发生。Niu等2 5 在纽约分离的一株临床肺炎克雷伯菌中，存在KPC-14变体，该变体是由KPC-2缺失第242位甘氨酸和第2 43位苏氨酸而形成；在将blakc-2和blakpc-14基因克隆并构建到pET-28质粒后，并比较了KPC-2和KPC-14的酶促动力学参数，发现了KPC-14对于头孢他啶的亲和力明显上升，因此可以介导CZA的耐药。研究报道在瑞士分离的一株临床肺炎克雷伯菌中，发现了KPC-3的变体，命名为KPC-50，其在2 7 6 至2 7 7 位插入了谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸等World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5表1耐CZA的KPC-Kp临床菌株中KPC酶的突变情况野生型突变类型KPC-2置换KPC-3置换KPC-2缺失KPC-2置换、插入KPC-2插入KPC-3置换KPC-2缺失、置换KPC-3置换KPC-3置换KPC-3插入KPC-2置换KPC-2置换、插入KPC-3重复KPC-3置换KPC-2置换KPC-2插入突变结果Asp179AlaAsp179TyrDel_242Gly243ThrAsp179Tyr,Ins_260Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Pro-AsnIns_260Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Pro-AsnVal240AlaDel_242Gly243Thr,His274TyrAlal72ThrLeul68PheIns_276Glu-Ala-ValAsp179Asn,Tyr241His,His274AsnAsp179Tyr,Ins_262ValIns_167Leu-GluAsp179Tyr and Thr263AlaIns_182SerIns_267Pro-Asn-Asn-Arg-Ala三个氨基酸；Shi等2 6 也确定了新变体KPC-76和KPC-79，它们都在KPC-2的第2 6 1位至2 6 2 位中插入了缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸和天冬酰胺七个氨基酸，KPC-76和KPC-79的区别在于前者多一个Asp179Tyr突变。耐人寻味的是，Shi等提到了在治疗KPC-kp感染中KPC酶多次突变的现象，在治疗9d后，KPC-2突变成了KPC-79，随后又在CZA治疗2 1d后突变成了KPC-76，但后期使用美罗培南进行治疗后又恢复突变成KPC-2，这说明了KPC酶具有高度的灵活性以帮助宿主适应环境的威胁。值得注意的是，有多项研究报道了携带KPC变体的肺炎克雷伯菌对除头孢他啶外其他-内酰胺类药物的敏感性逆转，这一方面提示了美罗培南等-内酰胺类药物可以作为治疗CZA耐药肺炎克雷伯菌感染的备选方案，另一方面却增加了快速检测KPC-Kp的难度，因为其对-内酰胺类药物的MIC值较低而无法被筛选。3.2膜孔蛋白突变和KPC酶高表达KPC-Kp的膜孔蛋白突变和KPC酶的高表达均可导致细菌对CZA耐药，并且在某些时候这两种因素是偶联在一起的。膜孔蛋白发挥着重要的生理作用，可以促进小分子亲水性溶质的流入，并促进有毒物质通过原本不透水的革兰阴性外膜的流出。与CZA耐药相关的细菌膜孔蛋白主要包括OmpC和OmpF，其中尤以OmpK35和OmpK36最参考文献2122 252626272829293031 3132333435 国外医药抗生素分册2 0 2 3年5月第44卷第3期受关注，也是近年来研究的热点32-33。OmpK35和OmpK36的整体结构显示出与其他一般孔蛋白相似的特征，即由16 个-折叠片组成的三聚体结构。孔蛋白中的两个重要结构成分是细胞外L3和L4区域38(Major nonspecific porins are matrix porin,OmpF)。Humphries等39 将CZA耐药株KP1244和敏感株KP1245比较分析后，发现前者的ompK35基因由于发生了移码突变，导致OmpK35不能正常表达而变成了一个非功能性孔蛋白。此外，前者与后者相比在ompK36中存在一个突变一Thr333Asn；进一步研究发现，将野生型ompK36转移到KP1244后，其对CZA的MIC值降低了，说明Thr333Asn突变可以介导KPC-Kp的低水平耐药。Castanheira等40 也证明了在ompK36的L3区域产生的突变可以导致细菌对于头孢他啶的MIC值上升(表2)。KPC酶的高表达也是近年来导致CZA耐药的原因之一。2 0 17 年有报道通过荧光定量PCR技术发现一株耐CZA的KPC-3阳性肺炎克雷伯菌中blakpc基因的表达量是敏感菌株的3.8 倍34-36 。Zhang等42 对12 株CZA耐药的KPC-Kp研究后发现，耐药菌株可通过增加blakpc-2所在质粒的拷贝数从而介导KPC酶的高表达；值得注意的是，在将酶抑制剂阿维巴坦的浓度提升之后，大部分耐药菌株可以恢复对CZA的敏感性，说明耐药菌株中KPC酶量的增加使得阿维巴坦的量相对不足而导致耐药。Coppi等4 也发现KPC-Kp通过多拷贝携带blakpc-3的转座子Tn4401a从而使得blakpc-基因高表达，同时研究也发现blakpc.基因高表达跟外膜蛋白的结构变化相关，blakpc.基因高表达使得细菌的膜孔蛋白的通透性降低，从而导致对CZA的耐药性升高。但是，在Sun等44 的研究中，blakpc基因的突变和其高表达共同导致了KPC-Kp对CZA的抗性增加，然而其膜孔蛋白的突变对CZA的易感性并无影响。4小结和展望综上所述，KPC阳性肺炎克雷伯菌对CZA产生耐药性主要是由于blakpc基因的突变、细菌细胞膜孔蛋白突变和KPC酶的表达量增加，这三种机制有可能同时出现而导致KPC-Kp对CZA的高水平耐药。针对KPC-Kp的感染，在使用CZA进行治疗的同时，临床医生应当密切关注KPC-Kp对美罗培南等碳青霉烯类抗生素的敏感性变化，依据实际情况进行联合用药和轮换用药。参考文献1WHO.Antimicrobial resistance.Global report on.163.表2 KPC-Kp的膜孔蛋白突变情况及其影响突变体突变位点OmpK35移码突变OmpK36Thr333AsnOmpK36L3区域产生突变surveillanceJ.World Health Organization,2014,61(3):12-28.2 Lai Y C,Lu M C,Hsueh P R.Hypervirulence andcarbapenem resistance:two distinct evolutionary directionsthat led high-risk Klebsiella pneumoniae clones to epidemicsuccessJJ.Expert Rev Mol Diagn,2019,19(9):825-837.3 Hennequin C,Robin F.Correlation between antimicrobialresistance and virulence 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