单针藻%28Monoraphidium sp.%294M-18对4种抗生素的敏感性分析.pdf

第40 卷第3期2023年6 月D0I:10.13482/j.issn1001-7011.2022.10.123黑龙江大学自然科学学报JOURNAL OF NATURAL SCIENCE OF HEILONGJIANG UNIVERSITYVol.40No.3June,2023投稿网址：https:/单针藻（Monoraphidium sp.）4M-18 对4种抗生素的敏感性分析李畅2，3张云野12，樊阳12，孙莹12，天林宜萌2，葛菁萍12，平文祥1.2（1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150 50 0；2.黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室，哈尔滨150 0 8 0）摘要：为探讨单针藻（Monoraphidium sp.）4M-18 对抗生素的敏感性，采用血球计数板监测藻细胞密度来研究卡那霉素、四环素、氯霉素和青霉素4种抗生素对单针藻4M-18生长的影响。结果表明,不同浓度的卡那霉素、四环素和氯霉素对单针藻4M-18的生长均有不同程度的抑制作用。在液体和固体培养基中,150 和10 0 mgL-1青霉素对单针藻4M-18的生长及藻细胞形态无影响，但是对杂菌有很好的抑制效果。本研究为单针藻4M-18利用抗生素法进行无菌化处理奠定了基础,降低了其他微生物对单针藻4M-18生物量与油脂积累的不利影响。关键词：单针藻4M-18；抗生素；敏感性；微藻中图分类号：Q935文献标志码：A尹紫良12,文章编号：10 0 1-7 0 11(2 0 2 3)0 3-0 30 9-0 7Sensitivity analysis of Monoraphidium sp.4M-18 to four antibioticsLI Chang*2,(1.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education,Heilongjiang University,Harbin 150500,China;2.Key Laboratory of Microbiology,College ofHeilongjiang Province,School of Life Sciences,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)Abstract:To investigate the sensitivity of Monoraphidium sp.4M-18 to four antibiotics,algal cell densitywas measured by hemocytometer to confirm the effects of four antibiotics,including kanamycin,tetracycline,chloramphenicol and penicillin,on the growth of Monoraphidium sp.4M-18.The resultsshowed that differect concentrations of kanamycin,tetracycline and chloramphenicol could inhibit thegrowth of Monoraphidium sp.4M-18 in varying degrees.In liquid and solid media,150 and 100 mg L-1penicillin had no effect on the growth and cell morphology of Monoraphidium sp.4M-18,but had goodinhibitory effect on bacteria.This study laid the foundation for the antimicrobial treatment ofMonoraphidium sp.4M-18,reducing the negative effects of other microorganisms on the biomass and lipidaccumulation of Monoraphidium sp.4M-18.收稿日期：2 0 2 2-0 1-18基金项目：国家自然科学基金（32 0 7 1519）；黑龙江省自然科学基金（LH2020C089）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费项目（2 0 2 1-KYYWF-0014）；黑龙江大学2 0 2 2 年研究生创新科研资金（YJSCX2022-240HLJU）通讯作者：平文祥（19 59-），男，教授，博士生导师，主要研究方向：微生物分子生物学和应用微生物学，E-mail：w e n x i a n g p a l i y u n.c o m引文格式：李畅，张云野，樊阳，等单针藻（Monoraphidiumsp.）4M-18 对4种抗生素的敏感性分析J黑龙江大学自然科学学报，2023,40(3):309-315.ZHANG Yunye,FAN Yang,SUN Ying,YIN Zilang 2,LIN Yimenge,CE Jinping e,PINC Wenxiang1,2310Keywords:Monoraphidium sp.4M-18;antibiotics;sensitivity;microalgae黑龙江大学自然科学学报第40 卷0引言化石能源的使用带动了全球经济的快速进步与发展。自工业革命开始，全球化石能源的消耗一直处于加剧上升状态。美国能源信息管理局预测，这种消耗状态至少还要持续2 0 年1。化石能源的加剧消耗在推动社会进步、改善人们生活水平的同时，也导致了气候变暖2 和化石能源危机3 等问题。因此，大力发掘清洁环保、可再生的化石能源替代品，对于满足国家清洁能源和可持续发展的需求及解决因化石能源大量使用导致的诸多问题具有重要意义。微藻是一类光学显微镜下可见、个体微小、种类繁多、营养价值丰富、分布广泛、单细胞或简单多细胞、真核或原核的水生生物4-7 。微藻经代谢可以在体内累积中性脂肪三酰甘油（Triacylglycerol，T A G），它是生产生物质燃料生物柴油的主要原料。生物柴油是当前公认的可以替代化石能源的清洁能源，利用微藻生产生物柴油具有以下三大优势：（1)微藻环境适应力强，在淡水、海水甚至污水中都可生长，不与粮食作物竞争土地，且在一定程度上有助于污水的回收利用与净化处理并减少粮食危机发生的概率8-12 ；（2)微藻的光合速率高、繁殖速度快、生长周期短、单位面积生物量产量高13-14；（3）微藻具有较高的含油量及产油量，其含油量及产油量可分别高达传统产油作物的10 倍和10 3 倍15。因此，目前科研工作者致力于利用微藻高产生物柴油的研究，以满足国家清洁能源和可持续发展的要求。微藻在培养和纯化过程中容易染菌，针对微藻容易染菌的问题，研究人员通常采用物理及化学方法对微藻进行无菌化处理，以获得微藻纯藻株。不同的无菌化处理方法有其各自不同的特点，物理无菌化处理方法操作复杂、工作量大,且仅可除去微藻培养环境中的杂菌，而对微藻体内共生杂菌的去除效果较差；化学无菌化处理方法操作方便、技术简单，且能够同时抑制微藻体内及培养环境中的杂菌生长16-17 ，对于微藻的无菌化处理更彻底，因此得到研究人员的普遍认可。本文分别采用液体培养和固体培养两种不同的手段，观察单针藻4M-18对卡那霉素、四环素、氯霉素和青霉素4种抗生素的敏感性，为单针藻4M-18利用抗生素法进行无菌化处理提供了参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试藻株单针藻4M-18由黑龙江大学微生物重点实验室保存。1.1.2主要培养基BG11培养基18 用于单针藻4M-18 种子液的扩大培养;TAP含氮培养基19 用于藻株的混合培养。在相应的液体培养基中加入2.0%2.5%的琼脂，用于藻株的固体平板培养。1.1.3主要试剂冰乙酸购于天津市光复科技发展有限公司；琼脂粉、卡那霉素、四环素、青霉素和氯霉素购于上海索莱宝生物科技有限公司；草酸铵、石碳酸、结晶紫、复红和碘化钾购于天津市科密欧化学试剂有限公司。1.2试验方法1.2.1藻株的培养利用光照摇床和人工气候箱，采用混合培养和自养培养两种方式对藻株进行培养。除特别说明外，藻株的培养均按以下方式进行：光照摇床的培养条件设定为：转速10 0 rmin-1、温度2 5、光照强度30 0 0 lux，每天下午4点开摇床（开光照和转速按钮），次日早8 点关摇床（关光照和转速按钮）；人工气候箱的培养条件设定为：培养温度2 5、光照强度30 0 0 lux、光暗周期比12 h：12 h。1.2.2单针藻4M-18种子液的培养取单针藻4M-18藻液，按照10%的量接种于BG11自养培养基中，最终装液量为2 0 0 mL/500mL（三角瓶），于光照摇床中培养至稳定期（2 0 2 2 d），即得种子液。1.2.3利用TAP含氮培养基培养藻株取自养培养的单针藻4M-18种子液，按照终止OD680mm=0.3接于TAP含氮培养基中，并接入适宜体积第3期的抗生素母液，TAP含氮培养基最终装液量为2 50 mL/500mL（三角瓶），于光照摇床中培养至稳定期。1.2.4单针藻4M-18在液体培养基中的抗生素敏感性试验取自养培养至稳定期的单针藻4M-18种子液，按照10%的比例接种于TAP含氮培养基中,最终装液量为10 0 mL/250mL（三角瓶），按表1所示的抗生素浓度分别加人适宜体积的抗生素母液后，于人工气候培养箱中培养，每天固定时间早晚各摇晃藻液一次，避免藻细胞沉底影响其生长；同时，每天早8 点取样测定藻细胞密度，观察藻细胞生长情况。每个浓度抗生素均设置3个平行试验，以降低试验误差。抗生素浓度梯度的调整方法为：在最终装液量为10 0 mL/250mL（三角瓶）的单针藻4M-18培养液中，分别加人浓度为100mgmL-的青霉素母液0、50、10 0、150、2 0 0 和2 50 L,调整培养液中青霉素终浓度分别为0、50、100、150、2 0 0 和2 50 mgmL-l。以上为青霉素浓度梯度的调整方法,其他抗生素与之相同。卡那霉素/(mgL-)0204060801001.2.5单针藻4M-18在固体培养基中的抗生素敏感性试验取自养培养至稳定期的单针藻4M-18种子液，利用血球计数板计算藻细胞密度，以确定藻液的稀释倍数。利用无菌0.9%NaCl溶液稀释藻液，取稀释好的藻液10 0 2 0 0 L均匀涂布于含有不同浓度抗生素（0、100、150 和2 0 0 mgL-）的TAP含氮培养基的固体平板上（保证每个平板上2 0 0 30 0 个藻落即可），于人工气候箱中培养15d后，观察不同浓度抗生素在平板上对杂菌的抑制作用及对单针藻4M-18生长的影响。每个浓度抗生素均设置3个平行试验，以减小试验误差。固体培养基中抗生素的选择及浓度梯度设定如表2所示。2结果与讨论2.1单针藻4M-18的杂菌污染情况在利用TAP含氮培养基培养单针藻4M-18的过程中，发现藻液极易受杂菌污染，通过革兰氏染色及镜检发现，藻液所染杂菌主要为革兰氏阳性球菌及革兰氏阳性杆菌，如图1所示。李畅等：单针藻（Monoraphidiumsp.）4M-18 对4种抗生素的敏感性分析Table 1 Setting of concentration gradient for different antibiotics四环素/(mg L-)01020304050311表1不同种类抗生素的浓度梯度设定青霉素/（mg L-I)050100150200250氯霉素/(mg L-)01020304050口口5um注：圆圈内为藻液中的革兰氏阳性球菌；三角形内为藻液中的革兰氏阳性杆菌；长方形内为单针藻4M-18细胞。图1单针藻4M-18藻液的杂菌污染情况（40 0）Fig.1 Bacterial contamination of Monoraphidium sp.4M-18 in algal fluid(400)3122.2单针藻4M-18在液体培养基中的抗生素敏感性试验根据不同抗生素抗菌谱范围的不同,选择卡那霉素、四环素、氯霉素和青霉素4种抗生素,在液体培养基中对单针藻4M-18进行了抗生素敏感性试验。2.2.1卡那霉素对单针藻4M-18生长的影响卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对大多数革兰氏阴性菌具有强大的抑制作用。图2 为卡那霉素对单针藻4M-18生长的影响结果，由图可知,2 0 mgL-1卡那霉素处理后的单针藻4M-18细胞在培养0 4d时处于延滞期,4 6 d时处于急剧生长期,且藻细胞密度在6 d时与对照组持平。由于经2 0 mgL-1卡那霉素处理后的单针藻4M-18细胞生长延滞期过长，因此不选择卡那霉素作为最优抗生素。余旭亚等利用卡那霉素在液体培养基中对单针藻FXY-10进行抗生素敏感试验，发现2 5 2 0 0 mgL-1卡那霉素均可显著抑制藻细胞的生长2 0 ,本试验结果与其一致。2.2.2四环素对单针藻4M-18生长的影响四环素是一种能防治革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引发的疾病、维持人体健康的一类抗生素2 1。图3为四环素对单针藻4M-18生长的影响，由图可知，不同浓度的四环素对单针藻4M-18生长均有不同程度的抑制作用。当四环素浓度为10 mgL-时，微藻有生长的现象，但与未添加抗生素组相比，生长相对缓慢，而其他四环素浓度下的微藻基本不生长。张茜等研究发现,在液体培养基中的低浓度四环素（10 mgL-1）可抑制富油新绿藻（Neochlorisoleoabundans）的生长2 2】，本试验结果与其相似。40F-0 mgL-l-O-20 mg L-1355F 40 mgL-l(贵/，0 1)/-o-60 mg L-13080 mgL-125-100 mg:L-201510500图2 卡那霉素对单针藻4M-18生长的影响Fig.2Effect of kanamycin on the growth ofMonoraphidium sp.4M-182.2.3氯霉素对单针藻4M-18生长的影响氯霉素是从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuela）中分离提取的广谱抗生素，对许多需氧革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及厌氧的菌质体都有抑制作用2 3。图4为氯霉素对单针藻4M-18生长的影响结果,从图中可以看出，当氯霉素浓度为10 mgL-1时，单针藻4M-18藻株生长缓慢；在抗生素浓度高于10mgL-时,藻株几乎不再生长,受到明显的抑制。这与余旭亚等研究发现10 2 0 0 mgL-氯霉素可抑制藻细胞生长的结果2 3 一致。2.2.4青霉素对单针藻4M-18生长的影响青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合，阻碍细菌细胞壁合成，从而发挥杀菌作用2 4。图5为青霉素对单针藻4M-18生长的影响结果，由图可知，当青霉素浓度为50 和150 mgL-时，藻细胞呈现S型增长,且在培养周期5 6 d的藻细胞密度高于对照组。由图6 可知,150 mgL-1青霉素能够有效抑制杂菌生长,且经两种浓度青霉素（50 和150 mgL-）处理后的单针藻4M-18藻液,藻细胞形态无明显变化,均呈现弯曲的月牙型,表明浓度为150 mgL-的青霉素对单针藻4M-18的细胞形态无影响。有文献报道，青霉素可以广泛应用于微藻的无菌化处理,其能够有效抑制微藻共生杂菌的生长,但对微藻的生长抑制不明显，一定浓度的青霉素还可促进微藻细胞的生长2 4,这与本试验结果相似。刘晓娟等研究发现,在液体培养基中添加50 mgL-I青霉素，对眼点拟微绿球藻（Nannochloropsisocutala）的生长无明显影响，且在黑龙江大学自然科学学报40-0 mgL-D.-10 mg L-35 20 mgL-1-O.-30 mg L3040 mg:L255F-50 mgL-120105012第40 卷345时间/d670图3四环素对单针藻4M-18生长的影响Fig.3Effect of tetracycline on the growth ofMonoraphidium sp.4M-18123时间/d4567第3期添加青霉素2 d后，培养液中的共生杂菌数目有所减少2 5;李静红等研究发现，当培养液中的青霉素终浓度为1.5gL-时,波吉卵囊藻（Oocystisborgei)的生长才被抑制2 6 。本试验结果与刘晓娟和李静红等的研究结果有一定差异,可能是由于不同藻株之间存在种属差异性和特异性。因此,在液体培养基中可选择添加150mgL-1青霉素作为单针藻无菌体系建立的备选抗生素。40-0 mg L-.-.-10 mg L-3520 mgL-130-30mgL-l40 mgL-125-50 mgL-1201510500图4氯霉素对单针藻4M-18生长的影响Fig.4Effect of chloramphenicol on the growth ofMonoraphidium sp.4M-18(a)李畅等：单针藻（Monoraphidiumsp.）4M-18 对4种抗生素的敏感性分析1231340-0 mg:L-1-.-50 mg L-135（/0 1)/100 mgL30-0.-150 mgL-200 mgLl25-250 mgL-12015105034时间/d56(b)70图5青霉素对单针藻4M-18生长的影响Fig.5Effect of penicillin on the growth ofMonoraphidium sp.4M-18)123时间/d45675m图6不同浓度青霉素处理7 d后单针藻4M-18的染菌情况（40 0）：(a）0 mg L-l；(b)50 mg L-l;(c)150 mg L-1Fig.6 Bacterial contamination of Monoraphidium sp.4M-18 treated with different concentrationsof penicillin for 7 days(400):(a)0 mg L-l;(b)50 mg L-;(c)150 mg L-12.3单针藻4M-18在固体平板上的抗生素敏感性试验藻株在固体培养基和液体培养基中对抗生素的耐受浓度是不同的2 7 ，而且固体平板培养法可以直观地反映微藻在不同浓度抗生素的固体培养基中能否生长存活,方法简便2 0 。以TAP含氮液体培养基中添加的抗生素种类和浓度为基础，进一步在固体平板上确定单针藻4M-18所耐受的抗生素浓度。在固体平板上，不同浓度青霉素对单针藻4M-18藻落生长和藻落形态的影响及对杂菌的抑制情况如表2 和图7 所示。Table 2Growth of Monoraphidium sp.4M-18 treated with different concentrationsof penicillin for 15 days抗生素浓度/(mgL-)0100150200注：+代表菌落数16 0 个；+代表菌落数130 135个；+代表菌落数12 0 12 5个。5m表2 不同浓度青霉素处理15d后单针藻4M-18的生长情况抗生素作用效果+5 m:314(a)黑龙江大学自然科学学报(b)(c)第40 卷(d)1 mm图7 不同浓度青霉素处理15d后单针藻4M-18的生长、形态和染菌情况：（a）0 mg L-1；（b）10 0 mg L-1；(c)150 mg L-1;(d)200 mg L-1Fig.7 Growth,morphology and bacterial contamination of Monoraphidium sp.4M-18 treated with different concentrationsof penillin for 15 days:(a)0 mg L-1;(b)100 mg L-1;(c)150 mg L-1;(d)200 mg L-1在固体平板上,10 0 mgL-1青霉素对单针藻4M-18的生长无显著影响，同时未见其他杂菌生长。与对照组相比，藻落形态无明显变化,均表现为大而饱满有光泽，该结果与张茜等报道的“同一种藻在固体和液体培养基中对同一种抗生素敏感度不同”的结论2 2 相似。因此,在固体平板上可选择添加10 0 mgL-1青霉素作为单针藻无菌体系建立的备选抗生素。综上所述，由于不同藻株之间存在种属特异性及差异性,在利用抗生素抑菌法对藻株进行无菌化处理时，应根据藻株的性质来选择适宜种类及浓度的抗生素。3 结 论以实验室保存的单针藻4M-18为出发藻株，利用4种抗生素对单针藻4M-18进行敏感性试验，最终选用青霉素对单针藻4M-18进行无菌化处理。在液体和固体培养基中,150 和10 0 mgL-1青霉素能够有效抑制单针藻4M-18共生杂菌的生长，同时对藻细胞（藻落）生长及形态无显著影响。参考文献1 YORK R,BELL S E.Energy transitions or additions?:why a transition from fossil fuels requires more than the growth of renewable energy J.Energy Research&Social Science,2019,51:40-43.2郭扬世界视域下新能源替代化石能源的驱动效应J中国人口资源与环境，2 0 2 2，32（5）：14-2 2.3】林伯强全球能源危机凸显中国低碳转型紧迫性J中国电力企业管理，2 0 2 2（19）：6-7.4 YANG C Y,LI R,ZHANG B,et al.Pyrolysis of microalgae:a critical review J.Fuel Processing Technology,2019,186:53-72.5张方，熊绍专，何加龙，等用于生物柴油生产的微藻培养技术研究进展J化学与生物工程，2 0 18，35（1）：5-11.6】朱莺莺微藻能源化利用进展综述J广东化工，2 0 17，44（11）：142-144.7 FERREIRA S P,HOLZ J C P,LISBOA R,et al.Fatty acid profile of Chlorella biomass obtained by fed batch heterotrophic cultivation J.International Food Research Journal,2017,24(1):284-291.8 ABREU A P,FERNANDES B,VICENTE A A,et al.Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris using industrial dairy waste as organic carbonsource J.Bioresource Technology,2012,118:61-66.9 BELLOU S,BAESHEN M N,ELAZZAZY A M,et al.Microalgal lipids biochemistry 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41.李畅等：单针藻（Monoraphidiumsp.）4M-18 对4种抗生素的敏感性分析315