丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响.pdf

动物营养学报，（）：丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响彭 浩，任 莹 马灵燕 吕文涛 陈 渠 杨 华 肖英平（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉；浙江农业科学院省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，农产品质量安全与营养研究所，杭州）摘 要：本试验旨在研究丁酸梭菌及其胞外囊泡对小鼠结肠炎的缓解作用以及对肠道真菌结构的影响。试验选用 周龄雄性 小鼠 只，随机分为 组，每组 只。组、组、组和 组分别给予正常饮水并灌胃 生理盐水、葡聚糖硫酸钠（）饮水并 灌 胃 生 理 盐 水、饮 水 并 灌 胃 丁 酸 梭 菌 溶 液（）、饮水并灌胃 丁酸梭菌胞外囊泡（溶于 生理盐水），后各组饮水均换为正常饮水。于第 天停止灌胃，对小鼠进行眼球取血，收集血清，测定炎症因子含量；随后麻醉处死小鼠，解剖后收集结肠组织及其内容物，进行组织病理学分析和真菌测序分析。结果显示：）相对于 组，组小鼠血清中白细胞介素（）、肿瘤坏死因子（）和脂多糖（）的含量显著提高（），白细胞介素（）的含量显著下降（）。相对于 组，组和 组小鼠血清中、和 的含量显著下降（），的含量有所提高（）。）经 处理的小鼠结肠真菌菌群操作分类单元（）数量、指数和 指数较 组显著增加（），而灌胃丁酸梭菌或其胞外囊泡使结肠炎小鼠结肠真菌菌群的 数量和 指数减小，趋于 组。在门水平上，处理小鼠结肠中子囊菌门（）的相对丰度下降，担子菌门（）的相对丰度增加；在属水平上，处理小鼠结肠中哈萨克斯坦酵母属（）的相对丰度下降，枝孢菌属（）、锥盖伞属（）和青霉菌属（）的相对丰度增加，而灌胃丁酸梭菌或及其胞外囊泡能使这些真菌门和真菌属的相对丰度趋于正常。）斯皮尔曼相关性分析发现，诱导的结肠炎小鼠结肠中暗梗单孢霉属（）、帚霉属（）、和丝孢菌属（）的相对丰度与血清中、和 的含量呈显著或极显著正相关（或），与血清中 含量呈极显著负相关（）；而结肠中 的相对丰度与血清中、和 的含量呈显著或极显著负相关（或），与血清中 的含量呈极显著正相关（）。综上所述，丁酸梭菌及其胞外囊泡能通过调节小鼠的肠道真菌菌群结构对 诱导的肠道黏膜损伤和炎症产生缓解作用。关键词：丁酸梭菌；胞外囊泡；结肠炎；小鼠；真菌菌群结构中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）作者简介：彭 浩（），男，湖北孝感人，硕士研究生，研究方向为畜禽肠道微生物。：通信作者：肖英平，研究员，：期彭 浩等：丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响 肠道炎症会不同程度地损伤胃肠道功能，影响营养物质的正常吸收，最终导致机体出现腹泻、腹痛和便血等病状。肠道的独特生理结构为微生物群创造了独特的生存环境，而肠道微生物与肠道的相互作用可诱导宿主的保护性免疫能力以抵抗炎症。肠道细菌产生的代谢产物，如短链脂肪酸（，），具有抗炎和免疫调节作用，可保护肠道稳态。肠道菌群的紊乱会导致肠道结构的变化，引发炎症产生，进而影响宿主健康状态。肠道炎症的产生会伴随的肠道黏膜损伤和肠道菌群紊乱，使得肠道中产生丁酸和具有抗炎作用的菌群减少，产生脂多糖（，）的菌群增多，加剧 对肠道的损伤。不同于细菌，真菌在人类和动物肠道微生物群中占比仅有 ，但其对宿主的免疫发育和微生物形成起着重要作用。真菌对免疫系统的影响与细菌相似，真菌菌群也可调节局部和远端的免疫反应，而细菌可激活宿主免疫系统调节真菌的定植，以影响真菌对宿主的作用。研究表明，肠杆菌科细菌通过影响肠道中布拉氏酵母菌和白色念珠菌的定植，调节这 种真菌对肠道炎症的积极或消极作用。丁酸梭菌（）是一种重要的产丁酸菌，既能抑制病原菌的生长和繁殖，还能增强机体免疫功能，降低炎症反应。研究表明，产丁酸菌能通过产生的丁酸或自身的结构特性发挥抗结肠炎的作用，以此达到结肠炎的防治效果。胞外囊泡（，）是一种普遍存在于生物体的具有磷脂双分子层的纳米级颗粒物，能介导细胞物质与信号通讯。肠道细菌来源的 可与宿主的多种疾病相互作用，如脆弱拟杆菌（）产生的 能有效诱导调节性 细胞产生白细胞介素（，），以 防 治 葡 聚 糖 硫 酸 钠（，）诱导的结肠炎。本课题组前期发现，丁酸梭菌的 可以有效地降低 处理小鼠的肠道炎症，改善肠道菌群结构。但是丁酸梭菌等细菌的 是否对真菌产生影响，目前相关研究甚少。丁酸梭菌及其 对 诱导的小鼠肠道真菌结构是否具有调节作用，以及真菌结构变化与炎症因子的相关性仍待研究。因此，本试验以 诱导的小鼠结肠炎模型来揭示丁酸梭菌及其 对小鼠结肠真菌结构的影响，以及真菌结构变化与炎症因子白细胞介素（，）、肿瘤坏死因子（，）、和 的相关性，为丁酸梭菌及其高活性制品开发与应用奠定理论基础。材料与方法 丁酸梭菌溶液制备与丁酸梭菌 提取 试验采用本实验室前期分离的丁酸梭菌，该菌株分离自贵州山区农户散养的健康生长肥育猪，在养殖过程中未饲喂商业饲料和未使用抗生素。在 厌氧条件下于锥形瓶中培养，最终所获丁酸梭菌溶液浓度。丁酸梭菌 通过使用丁酸梭菌溶液超速离心提 取。超 速 离 心 方 法：丁 酸 梭 菌 溶 液 以 离心 ，提取上清，然后以 离心 ，提取上清，使用 滤膜过滤后 离心 ，弃上清，使用磷酸盐缓冲液（）重悬沉淀，然后以 离心 ，弃上清，重悬收集即得丁酸梭菌。试验设计 本试验中所用小鼠由中国国家实验动物资源中心提供，所选小鼠为 周龄雄性 小鼠，并在 暗光循环下饲养于温控室（）中，适应 周后，根据体重将动物分组，以确保进一步试验的起始状态相同，于浙江省农业科学院动物实验房开展试验。将小鼠随机分为 组，每组 只，其中 组小鼠给予正常饮水并灌胃 生理盐水；组小鼠给予 饮水并灌胃 生理盐水；组小鼠给予 饮水并灌胃 丁酸梭菌溶液（）；组小鼠给予 饮水并灌胃 丁酸梭菌（溶于 生理盐水）。在整个试验期间内，每 更换 次新鲜的 饮水，后 组均更换为正常饮水，每天测量体重。于第 天停止灌胃，并对小鼠进行眼球取血，收集血清；随后麻醉处死小鼠，解剖后收集结肠组织及其内容物，以便进一步分析。结肠组织病理学分析 取小鼠结肠组织于 多聚甲醛固定液中固定，包埋之后制作切片，使用苏木精伊红（）染色后在 型共聚焦显微镜下进行组织病理学观察。动 物 营 养 学 报 卷 血清炎症因子含量测定 使用小鼠眼球取血方法，将收集的血液静止，在 、条件下离心 分离并收集血清，于 保存。各组小鼠血清炎症因子（，）、（，）、（，）和（，）的含量严格按照酶联免疫吸附测定（）试剂盒说明书检测。结肠真菌菌群结构分析 提取与扩增 采用 分离试剂盒（）提取结肠内容物，并在 琼脂糖凝胶上检测 的浓度和纯度。本研究所用引物为（）和（），以该引物对小鼠结肠内容物真菌 进行 扩增，以便后续测序分析。生物信息学分析 采用建库试剂盒（）建立测序文库，在 平台上对该文库进行测序，并对测序序列 进 行 质 控 过 滤。通 过 软 件 包 和 软件获得有效的操作分类单元（），并对 代表序列进行分类分析，以获得 对应物种的分类信息。此外，为了评估样本内和样本间的多样性，采用 计算 数量、指数、指数和 指数，并进行主坐标分析（）。数据统计与分析使用 和 软件进行统计分析。通过单因素方差分析（）评估组间相对丰度差异的显著性，结果以“平均值标准误”表示，被认为差异具有统计学意义。结果与分析 小鼠体重变化 如图 所示，在试验的前 ，各组小鼠体重无显著差异（），第 天起 组和 组小鼠体重相比 组显著下降（），第 天起 组小鼠体重相比 组也显著下降（）；在第 天，组小鼠体重显著高于 组（）。小鼠血清炎症因子含量变化 图 显示，相对于 组，组小鼠血清中、和 的 含 量 分 别 提 高 了、和（），的含量下降了（）。相对于 组，组和 组小鼠血清中 的含量分别下降了 和（），的含量分别下降了 和（），的含量分别下降了和（），的含量分别提高了 和（）；组 和 组 之 间 血 清 中、的含量均无显著差异（）。（）、（）均表示与 组相比差异显著（）；（）表示与 组相比差异显著（）。（）（）（）；（）（）图 丁酸梭菌及其 对 诱导的结肠炎小鼠体重的影响 小鼠结肠组织形态变化图 显示，组小鼠结肠长度较 组显著缩短（），并在灌胃丁酸梭菌或其 后出现显著逆转（），但灌胃丁酸梭菌与其 对结肠长 度 的 作 用 差 异 不 显 著（）。图 的结肠组织切片 染色结果显示，组小鼠结肠隐窝大面积缺失、黏膜损伤，并有明显的炎性细胞浸润，而丁酸梭菌及其 能够减少 引起的肠道隐窝缺失、黏膜损伤和炎性细胞浸润，且以丁酸梭菌 对小鼠肠道损伤的改善效果更为明显。期彭 浩等：丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响 数据柱标注不同小写字母表示差异显著（），标注相同字母表示差异不显著（）。图 同。（），（）图 丁酸梭菌及其 对 诱导的结肠炎小鼠血清炎症因子含量的影响 图 丁酸梭菌及其 对 诱导的结肠炎小鼠结肠组织形态的影响 （）小鼠结肠真菌菌群多样性分析 多样性分析 由表 可知，经 处理的小鼠结肠真菌菌群 数 量、指 数 和 指 数 较组显著增加（），指 数 较 组显著降低（），说明真菌菌群的丰富度和多样性增加；而灌胃丁酸梭菌或其 后小鼠结肠真菌菌群 指数与 组无显著差异（），说明真菌菌群丰富度趋于向 组转变。组和 组小鼠结肠真菌菌群的丰富度和多样性均无显著差异（）。动 物 营 养 学 报 卷表 小鼠结肠真菌菌群 多样性指数 项目组别 数量 指数 指数 指数 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（），相同字母表示无显著差异（）。，（），（）多样性分析 表明，经 处理的小鼠真菌菌群与组存在明显不同的聚类，而灌胃丁酸梭菌及其 后小鼠真菌菌群结构有向 组靠拢的趋势（图）。图 小鼠结肠真菌菌群的主坐标分析 小鼠结肠真菌菌群结构变化 图 显示，在门水平上，小鼠结肠真菌菌群的优势菌门主要是子囊菌门（）和担子菌门（）。与 组 相 比，组 的相对丰度降低，而 的相对丰度增加。与 组相比，组与 组 的相对丰度升高，而 的相对丰度降低，趋于向 组转变。组与 组小鼠结肠真菌菌群各菌门的相对丰度差异较小。图 显示，在属水平上，小鼠结肠真菌菌群的优势菌 属 主 要 是 哈 萨 克 斯 坦 酵 母 属（）、枝 孢 菌 属（）、锥 盖 伞 属（）、青霉菌属（）等。与 组相比，组小鼠 的相对丰度降低，、和 的相对丰度升高。与 组相比，组与 组 的 相 对 丰 度 升 高，、和 的 相 对 丰 度 降 低，趋 于 向组转变。组与 组上述优势菌属的相对丰度差异较小。期彭 浩等：丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响 ：子囊菌门；：担子菌门；：毛霉门；：未分类；：其他。图 小鼠结肠真菌菌群门水平结构 ：哈萨克斯坦酵母属；：枝孢菌属；：锥盖伞属；：青霉菌属；曲霉菌属；：灰葡萄孢属；：不整孢菌属；：其他。图 小鼠结肠真菌菌群属水平结构 为了进一步分析不同组之间的差异菌属，通过 分析（图）发现，个菌属的相对丰度发生了显著变化，其中经过 处理后，小鼠结肠、等菌属的相对丰度显著升高（）；灌胃丁酸梭菌后，的相对丰度显著升高（）；灌胃丁酸梭菌 后，的相对丰度显著升高（）。结肠炎小鼠结肠差异真菌属相对丰度与血清炎症因子含量的相关性分析 通过斯皮尔曼相关性分析进一步分析小鼠结肠差异真菌属相对丰度与血清炎症因子含量之间的相关性，结果（图）发现，结肠炎小鼠结肠中大多差异真菌属的相对丰度与血清中 和 的含量呈极显著正相关（），与血清中 的含量呈极显著负相关（）；结肠中暗梗单孢霉 属（）、帚 霉 属（）、动 物 营 养 学 报 卷 和丝孢菌属（）的相对丰度与血清中 的含量呈显著或极显著正相关（或），而结肠中 的相对丰度与血清中、和 的含量呈显著或极显著负相关（或 ），与血清中的含量呈极显著正相关（）。图 小鼠结肠真菌菌群 分析 讨 论 肠道炎症是一类由细菌、真菌等微生物引起的肠道免疫系统失调和肠道屏障破坏的肠道疾病，影响宿主的健康与代谢。益生菌干预可有效调节肠道炎症，减轻炎症造成的损伤。本试验以 诱导小鼠肠道炎症，发现小鼠体重明显减轻，结肠缩短和黏膜结构破坏，而丁酸梭菌及其 能缓解 造成的小鼠结肠结构的损伤，降低血清炎症因子的含量，缓解结肠炎小鼠体重的降低。丁酸梭菌作为一种有益菌，其对肠道微生态的平衡具有重要作用。有研究表明，丁酸梭菌发酵糖类产酸，可降低肠道，抑制大肠杆菌等有害菌的生长，促进乳酸菌和双歧杆菌等有益菌的繁殖，从而调节肠道菌群紊乱。在畜禽生产中，饲粮中添加丁酸梭菌可降低畜禽的腹泻率，提升生产性能，并有效提高血清免疫蛋白含量，提高畜禽免疫能力。目前关于肠道微生物的研究多集中于细菌在调节黏膜免疫和促进肠道健康方面，而忽视了其他微生物的功能。肠道真菌对于肠道稳态与免疫发育起关键作用，并与某些胃肠道疾病相关，如马拉色菌属（）会加重结肠炎症，并与克罗恩病有关，而酿酒酵母（）具有改善胃肠炎的能力。在本研究结果显示，处理的小鼠结肠真菌菌群丰富度和多样性增加，这与 等的研究结果相一致，而灌胃丁酸梭菌或其 的小鼠结肠真菌菌群丰富度会降低，且趋于正常小鼠，这表明丁酸梭菌及其 能有效改善结肠炎小鼠真菌菌群丰富度。显示 组与 组小鼠结肠真菌菌群相分离，表明炎症会导致真菌菌群结果发生显著变化，而灌胃灌胃丁酸梭菌或其 后小鼠真菌菌群结构有向正常小鼠靠拢的趋势，这表明丁酸梭菌及其 能对由 诱导的结肠炎而产生的真菌菌群变化产生缓解作用。本 期彭 浩等：丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响试验还发现，经过 处理的小鼠结肠真菌菌群中 和 的占比变小，这与潘丽雅等和 等的研究结果一致；同时，在灌胃丁酸梭菌或其 条件下，和 的占比接近于 组，表明丁酸梭菌或其 均能在一定程度上缓解结肠炎，且这种变化在 组中尤为明显。此外，处理后小鼠结肠中 的相对丰度显著增加，而 会降低小鼠的免疫功能，促进炎症的产生。通过斯皮尔曼相关性分析也确认了小鼠结肠中 的相对丰度与血清中 和 的含量存在极显著正相关；同时，结肠中、和 的相对丰度与血清中、和 的含量存在显著或极显著正相关，可能导致炎症的产生。其中，是引发各种感染，甚至能威胁生命的真菌。汪贵娥指出，大量 存在时会引起正常小鼠系统性感染，并导致急性或慢性炎症。是一种致病真菌，能增加炎症因子 和 的产出，加重炎症感染。表示显著相关（），表示极显著相关（）。（），（）图 结肠炎小鼠结肠差异真菌属相对丰度与血清炎症因子含量的相关性分析 灌胃丁酸梭菌或其 后，诱导的结肠炎小鼠结肠中 的相对丰度显著增加，向正常小鼠转变。目前对 这个真菌属的研究较少，但有研究表明它能促进产生短链脂肪酸的细菌的生长，这对肠道保护具有重要作用。综上所述，结肠炎会显著改变结肠真菌菌群丰富度和多样性，丁酸梭菌及其 具有缓解结肠炎症并改善真菌菌群结构的作用，但其缓解炎症的作用机制还需进一步探究。结 论 诱导的结肠炎小鼠结肠真菌菌群的动 物 营 养 学 报 卷 数量、指数和 指数增大，真菌菌群的丰富度和多样性增加，而丁酸梭菌及其 干预能使其趋于正常。在门水平上，处理的小鼠结肠中 的相对丰度下降，的相对丰度增加；在属水平上，处理的小鼠结肠中 的相对丰度下降，、和 的相对丰度增加，而丁酸梭菌及其 干预能使这些真菌门和真菌属的相对丰度趋于正常。结肠炎小鼠结肠中、和 等差异真菌属的相对丰度与血清中、和 的含量呈显著或极显著正相关，与血清中 的含量呈极显著负相关，而结肠中 的相对丰度与血清中、和 的含量呈显著或极显著负相关，与血清中 的含量呈极显著正相关。参考文献：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：王宗伟，付建中，李洪涛，等丁酸梭菌对肠道屏障的影响机制及其在畜禽养殖中应用的研究进展动物营养学报，（）：，（）：（），（）：陈映宇，毛联智，刘华缓，等肠道产丁酸菌防治炎症性肠病的机制研究进展世界华人消化杂志，（）：，（）：（），：陈舒泽，陈烨肠道细菌来源细胞外囊泡在炎症性肠病中的作用中华内科杂志，（）：，（）：（），期彭 浩等：丁酸梭菌及其胞外囊泡对结肠炎小鼠肠道真菌菌群结构的影响 ，（）：，（）：，（）：，：，：，：林华林，秦颖超，周加义，等丁酸梭菌及其代谢产物对畜禽肠道健康影响的研究进展饲料工业，（）：，（）：（）刘虎传，杨培培，王莎莎，等丁酸梭菌在养猪业中应用的研究进展 山东畜牧兽医，（）：，（）：（）雷春龙，王巧娜，曾雁鸣，等丁酸梭菌生物学功能以及在鸡生产中的应用中国家禽，（）：，（）：（），（）：，（）：，（）：，：，（）：潘丽雅，阮冰炎症性肠病患者的肠道真菌改变及其致病机制探讨 临床内科杂志，（）：，（）：（），（）：杨超，姜尧章，何鸣，等大熊猫源枝孢样枝孢霉对实验小鼠的血常规、生化及致病性影响的研究中国预防兽医学报，（）：，（）：（），（）：汪贵娥短帚霉的形态学观察及致病性的动物实验研究硕士学位论文石家庄：河北医科大学，：，（），（）：，：，（）：动 物 营 养 学 报 卷，：（责任编辑 菅景颖），（，；，）：，（），（），：），（），（）（）（），（）（），（），（）（），（），；，），（），（），（），（），（）：；