DB4505T-0006-2023-岛礁海参生态增殖技术规范.docx

ICS 65.150CCS B 504505 北海市地方标准DB4505/T 00062023岛礁海参生态增殖技术规范Technical specification for ecological enhancement of reef-inhabiting sea cucumbers2023 - 03 - 08 发布2023 - 04 - 08 实施北海市市场监督管理局发 布 DB4505/T 00062023目次前言III1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 海域选择2 自然条件2 海水理化条件25 物种选择26 种苗培育及苗种要求27 苗种检验检疫2 检验资质机构要求2 抽检原则与数量要求3 检验内容与方法38 生态增殖3 苗种转运3 适应性驯化3 底播增殖39 增殖容量410 海参丰度监测4 潜水员和设备4 潜水断面设置4 丰度监测与计算411 效果评估4 基于海参丰度的增殖效果评估4 基于环境 DNA 的增殖效果评估5 基于增殖群体回捕占比率的增殖效果评估512 管理5附录 A（规范性） 海参生态增殖放流情况记录表6附录 B（资料性） 基于环境 DNA 的海参丰度计算7B.1 特异性 qPCR 扩增引物设计7B.2 PCR 扩增、质粒构建及质粒标准模板制备7B.3 DNA 标准定量曲线制作7B.4 环境DNA 的 qPCR 扩增及海参丰度计算7附录 C（资料性） 基于微卫星分子标记的海参增殖群体回捕占比率计算9I C.1 样本采集9C.2 样本保存9C.3 样本DNA 提取9C.4 多态性 SSR 位点的筛选9C.5 PCR 扩增及基因分型9C.6 海参回捕抽样样本的遗传区分及回捕占比率计算9参考文献11II 前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由北海市海洋局提出并归口。 本文件起草单位：中国科学院南海海洋研究所、海南大学、华南农业大学、广西科学院、广西精工海洋科技有限公司、湛江市东海岛东方实业有限公司。 本文件主要起草人：胡超群、罗鹏、陈廷、鄂子譞、谢珍玉、孙红岩、陈偿、江晓、柯志新、姜发军、吴海峰、程楚杭、张鑫、刘阳、章翔、张吕平、但学明、宋建强、陈文林。 III DB4505/T 00062023岛礁海参生态增殖技术规范1 范围本文件规定了岛礁海参生态增殖的海域选择、物种选择、种苗培育、苗种检验检疫及增殖容量要求， 描述了生态增殖效果监测与评估的方法，提供了海参生态增殖管理的指导意见。 本文件适用于北海市辖区内岛礁海参的生态增殖。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 11607 渔业水质标准 GB/T 12763.6 海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查SC/T 2074 刺参繁育与养殖技术规范 SC/T 9401.11 水生生物增殖放流技术规程 第11部分：投放 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 原生种 original species在无人为干预的野生环境下自然演化而来的物种。 生态增殖 ecological enhancement采用放流、移植或栽培、底播等人工方式，在生态系统承载力范围内，利用天然生产力增加生物种群产量的过程。 适应性驯化 adaptive domestication增殖放流苗种适应野外海域环境的人工处理过程。 底播增殖 bottom sowing for stock enhancement通过播撒底栖生物苗种到适合的海底生境中，利用天然生产力增加放流种群产量的过程。 环境 DNA environmental DNA从环境样本中提取的所有DNA的集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA。 1 4 海域选择 自然条件根据岛礁环境特点，结合历史资料、捕捞生产信息以及资源生态环境的本底调查资料，针对不同种类的海参，筛选确定海参生态增殖的海域。增殖海域应生态环境良好、饵料生物丰富、水流畅通。 海水理化条件增殖海域的海水理化因子应符合表1的要求。 表1 增殖海域海水理化因子要求海水理化因子 参数 水温 18 35 盐度 2535 pH 8.08.5 底层溶解氧 5.0 mg/L 其它水质因子 符合GB 11607的规定 选择目标海区或周边海区的礁栖海参原生种，禁止采用外来种、杂交种、转基因种以及其他不符合生态要求的海参物种进行生态增殖。用于生态增殖的主要种类为小疣刺参（Stichopus monotuberculatus）、糙刺参（S. horrens）、玉足海参（Holothuria leucospilota）和糙海参（H. scabra）。 6 种苗培育及苗种要求参照 SC/T 2074 中的方法进行生态增殖种苗的培育。 用于生态增殖的参苗应活力强、外观无损伤、无畸形、规格整齐。规格应符合表 2 的要求。 表2 生态增殖海参苗种规格7 苗种检验检疫检验资质机构要求由具备相应检验资质的单位进行检验，并出具正式报告。 2 5 物种选择规格等级 体重g/头 小规格 1,2） 中规格 2,3） 大规格 3,5） 抽检原则与数量要求随机取样，常规质量检验每次取样不少于50头。 检验内容与方法苗种质量的检验内容、检验方法与要求见表1。 表3 苗种质量的检验内容、检验方法与要求检验内容 检验方法与要求 感官质量 规格整齐、外观完整 可数指标 规格合格率90以上，死亡个体比例、伤残率、畸形率之和5 病害 采用PCR方法对引起海参腐皮病的弧菌病原进行检测，无病害 8 生态增殖 苗种转运海参苗种从育苗池转运至待增殖海域的方法及要求如下： a) 在参苗运输桶或塑料袋内加入清洁海水，加水量不超过容器体积的 2/3； b) 从海参育苗池中收集海参苗，以清洁海水冲洗参苗体表，放入参苗运输桶或塑料袋内，密度控制在小规格参苗 150 头/L 或中规格参苗 100 头/L 或大规格参苗 50 头/L； c) 采用敞口运输桶运输参苗，应配备充电式移动增氧机持续增氧；采用塑料袋运输参苗，应向袋内充入纯氧，氧气与水体体积比为 1:3，并用宽橡皮筯轧紧袋口； d) 用敞口运输桶充气运输时应注意遮荫，用封闭塑料袋运输时应适当降温，运输时气温不应高于35 ； e) 将运输桶或塑料袋放入转运车内，运送至待增殖海域。 适应性驯化将海参苗种运输至待增殖海域后，在海域浅水区放置规格为2 m2 m2 m的沉水式小型网箱，使其底部与海底接触，每个网箱可暂养小规格参苗4万头或中规格参苗3万头或大规格参苗2万头，暂养时间为3 d，暂养期间每天观察参苗的摄食和存活情况。 底播增殖8.3.1 底播时间海参苗种的底播最适宜月份为每年的310月。 8.3.2 底播天气选择晴朗、多云或阴天进行海参底播生态增殖，海面最大风力5级，气温35 。 8.3.3 运输船及暂养桶根据运输量以及放流海域的水深，选择合适大小的渔船或快艇作为运输船，运输船应有遮阴设施和配置移动式增氧泵，可平稳放置暂养桶。暂养桶体积为100 L300 L，每个暂养桶放置增氧气石1个，桶内水体溶解氧5 mg/L。 3 8.3.4 苗种运输以抄网将参苗从暂养网箱内捞至装有清洁海水的暂养桶内，密度控制在小规格参苗150头/L或中规格参苗100头/L或大规格参苗50头/L，运输至底播预定海域。 8.3.5 苗种底播船速：2 m/s4 m/s，投放密度：0.1头/m20.2头/m2，苗种底播按照SC/T 9401.11中的方法进行， 记录投放中心位点的经纬度、投放数量和覆盖范围，填写海参增殖放流情况记录表（见附录A）。 9 增殖容量不超过增殖海域历史上礁栖海参最大捕捞产量的2倍。 10 海参丰度监测 潜水员和设备按GB/T 12763.6的规定进行潜水员配备和设备准备。 潜水断面设置直线距离50 m，断面设置方法为：在监测海域内，通过潜水设定起点，沿礁石走向拉皮尺至终点，起点到终点总距离为50 m。 丰度监测与计算潜水员沿皮尺方向进行断面内海参调查，观察到的海参个体均计入海参数量，并根据海参形态辨别海参种类，进行断面内海参数量统计。调查海域的海参丰度计算见公式（1）： Asc = n Si(1.2 50 k) 10000(1) i=1式中：Asc调查海域的海参丰度，单位为头/hm2； n 断面个数；Si 第i个断面内观察到的海参数量，单位为头。 11 效果评估基于海参丰度的增殖效果评估11.1.1 生态增殖实施一年后，潜水调查海参丰度，基于海参丰度的生态增殖效果评估值（RQ）计算见公式（2）： RQ = (AQ2 AQ1)/AQ1 100(2) 式中：RQ 生态增殖效果评估值，用表示； AQ2实施一年后生态增殖海域的海参丰度，单位为头/hm2； 4 在生态增殖海域每平方公里设置1个监测断面，断面应均匀分布于生态增殖海域，每个断面宽1.2 m，AQ1生态增殖海域的本底海参丰度，单位为头/hm2。 11.1.2 按照表 4 的分级标准，进行海参生态增殖效果的分级评估。 表4 基于海参丰度的生态增殖效果评估分级指标 增殖效果评估分级 优 良 一般 差 RQ 20 10,20) 5,10) 5 基于环境 DNA 的增殖效果评估11.2.1 生态增殖实施一年后，调查增殖海域底层海水中的生态增殖种类海参 DNA 丰度（方法见附录B），基于环境DNA 的海参生态增殖效果评估值（RE）计算见公式（3）： RE = (AE2 AE1)/AE1 100(3) 式中：RE 生态增殖效果评估值，用表示； AE2实施一年后生态增殖海域底层海水中的生态增殖种类海参DNA丰度，单位为拷贝/mL； AE1生态增殖海域底层海水中的生态增殖种类本底海参DNA丰度，单位为拷贝/mL。 11.2.2 按照表 5 的分级标准，进行海参生态增殖效果的分级评估。 基于增殖群体回捕占比率的增殖效果评估11.3.1 海参底播增殖实施一年后，在增殖海域进行海参增殖群体回捕，按照基于微卫星分子标记的海参增殖群体回捕占比率的计算方法（见附录 C）计算增殖群体回捕占比率(RH)。 11.3.2 按照表 6 的分级标准，进行海参生态增殖效果的分级评估。 表6 基于增殖群体回捕占比率的海参生态增殖效果评估分级12 管 理海参增殖放流后，应定期巡查放流海域，防止非法捕捞生态增殖海域的海参资源。 5 表5 基于环境 DNA 的海参生态增殖效果评估分级指标 增殖效果评估分级 优 良 一般 差 RE 20 10,20) 5,10) 5 指标 增殖效果评估分级 优 良 一般 差 RH 20 10,20) 5,10) 5 附 录 A（规范性）海参生态增殖放流情况记录表海参生态增殖放流情况记录表见表A.1。 表A.1 海参生态增殖放流情况记录表增 殖 放 流 单 位 ： 记 录 日 期 ： 海参种类pH盐度水温（）放流数量（头）规格放流人员放流海域边缘坐标 1放流海域边缘坐标 2放流海域边缘坐标 3放流海域边缘坐标 4放流海域边缘坐标 5放流海域边缘坐标 6放流海域边缘坐标 7放流海域边缘坐标 8放流海域边缘坐标 9放流海域边缘坐标 10放流海域边缘坐标 11放流海域边缘坐标 12记 录 人 ： 核 对 人 ： 6 附 录 B（资料性）基于环境 DNA 的海参丰度计算B.1 特异性 qPCR 扩增引物设计分别针对所有用于生态增殖的海参种类的线粒体COI基因或基因组DNA特异区域设计种特异性qPCR 扩增引物，引物设计的原则为：引物特异性强，长度19 bp22 bp，GC含量4060，碱基分布均匀， 扩增片段长度为150 bp200 bp。 B.2 PCR 扩增、质粒构建及质粒标准模板制备分别以每种海参的DNA为模板，进行特异性PCR扩增。纯化PCR扩增产物后，采用常规的方法进行PCR 产物克隆与质粒转化，提取质粒，溶于50 L ddH2O中，-20 保存，测量每种海参质粒的浓度。质粒浓度计算见公式（B.1）： ST = 6.02 1023 CON(660 NT) 106(B.1) 式中：ST质粒浓度，单位为拷贝/L； 6.021023阿伏伽德罗常数，单位为拷贝/mol； CON质粒检测浓度，单位为g/L； 660碱基对平均分子量，单位为g/mol/bp； NT质粒碱基数量，单位为bp。 B.3 DNA 标准定量曲线制作将每种海参的质粒分别稀释至101 拷贝/L、102 拷贝/L、103 拷贝/L、104 拷贝/L、105 拷贝/L、106 拷贝/L、107 拷贝/L和108 拷贝/L，作为标准模板。对于每种海参，取1 L各浓度的质粒模板，利用本文件B.1设计的特异性引物进行qPCR扩增，以测得的扩增循环数(Ct值)为纵坐标，以质粒浓度的对数为横坐标，分别绘制每种海参的DNA标准定量曲线。 B.4 环境 DNA 的 qPCR 扩增及海参丰度计算B.4.1 环境DNA提取使用标准采水器收集海参生态增殖海域的底层海水，每个点采集500 mL海水样品，使用0.22 m滤膜对底层海水进行过滤，剪碎滤膜，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒对滤膜上的生物样本进行DNA提取，提取后的DNA溶于50 L ddH2O中，-20 保存，作为环境DNA。 B.4.2 环境DNA的qPCR扩增及增殖种类海参DNA的定量以1 L上述提取的环境DNA为模板，利用本文件B.1设计的各种海参的特异性引物分别进行qPCR扩增， 扩增体系为20 L，测量样品Ct值，通过标准曲线，求得Ct值所对应的模板中各种海参DNA的丰度。 7 B.4.3 基于环境DNA的海参丰度计算在调查海域至少设置采样点6个，采集采样点海域的底层海水500 mL，提取环境DNA，并按照本文件B.4.2的方法对样品中生态增殖种类海参的DNA进行定量，底层海水中生态增殖种类海参DNA丰度的计算见公式（B.2）： i=1 AE = m(a j=1AEij)m(B.2) 式中：AE 调查海域底层海水中生态增殖种类海参DNA丰度，单位为拷贝/mL； m 调查海域采样点个数； a 生态增殖的海参种类个数； AEij调查海域第i个采样点底层海水中第j种生态增殖种类海参DNA丰度，单位为拷贝/mL。 8 附 录 C（资料性）基于微卫星分子标记的海参增殖群体回捕占比率计算C.1 样本采集对于用于生态增殖的不同种类海参，增殖前分别采集原生种群和增殖苗种群体样本各50头60头， 回捕时分别从每种海参的回捕样本中随机抽取50头60头。 C.2 样本保存样本采集后，用剪刀剪取一块200 mg500 mg的海参体壁组织，置于10 mL离心管中，加入5 mL 95 乙醇，常温运至实验室保存。 C.3 样本 DNA 提取采用常规的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取海参样本DNA， DNA浓度 50 ng/L ， OD260/OD280=1.82.0。 C.4 多态性 SSR 位点的筛选对于每个用于生态增殖的海参种类，分别筛选具有种特异性的高度多态性SSR标记。筛选方法为： 采集不同地理分布的各种海参群体，进行基因组测序并利用MISA软件分别查找具有地理差异的各种海参的SSR位点，采用Primer Premier 5软件设计引物，对具有地理差异的各种海参的基因组DNA分别进行PCR 扩增，采用遗传分析仪对PCR扩增产物进行分型，并利用GeneMapper3.2软件读取等位基因片段的长度， 采用Cervus软件计算期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）及多态性信息含量（PIC），从每种海参基因组中分别筛选出20个30个具有高度多态性的SSR标记。 C.5 PCR 扩增及基因分型利用筛选到的海参种特异性高度多态性SSR标记的特异性引物，分别对每种海参样本进行PCR扩增。PCR反应体系25 L，包括：10PCR buffer 2.5 L、10 mM dNTP 0.5 L、高保真PCR酶1 U、正向引物（10 M）0.5 L、反向引物（10 M）0.5 L、DNA模板1 L，其余由无菌双蒸水补足至25 L。PCR扩增程序为：95 预变性5 min；95 变性30 s，52 58 退火30 s，72 延伸30 s，共32个循环；72 再延伸6 min。采用遗传分析仪对PCR扩增产物进行分型，获得所有海参样本的基因型。 C.6 海参回捕抽样样本的遗传区分及回捕占比率计算C.6.1 海参回捕抽样样本的遗传区分利用本文件C.5的分型结果，通过GenAIEx 6.51b2和MEGA 6.0软件分别对每种海参的3个群体（原生种群、增殖苗种和回捕样本）进行遗传分析，鉴定每种海参的回捕抽样样本与同种类增殖苗种群体和原生种群间的遗传距离，如某一种类海参回捕抽样样本与该种类增殖苗种群体具有相似的分子遗传特征，且聚为一类时，可确定其为该种类增殖群体的回捕个体。 C.6.2 海参增殖群体回捕占比率计算统计每种海参回捕抽样样本中增殖群体的回捕个体数，计算海参增殖群体回捕占比率的方法见公式（C.1）： 9 i=1 RK = (bHi)/(bCi) 100(C.1) i=1式中：RH海参增殖群体回捕占比率，用表示； b 生态增殖海参的种类个数； Hi 第i种类生态增殖海参回捕抽样样本中增殖群体的回捕个体数，单位为头； Ci 第i种类生态增殖海参回捕抽样样本的总个体数，单位为头。 10 参 考 文 献1 汪笑宇,周遵春,关晓燕,姜北,陈仲,董颖,杨爱馥. 仿刺参及养殖环境中溶藻弧菌和灿烂弧菌的 PCR 快速检测J. 中国农业科技导报, 2010,12(3): 125-130. 11