“不可培养”微生物的分离培养方法研究进展.pdf

综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期11“不可培养”微生物的分离培养方法研究进展赵俊天，张莹*（北京理工大学生命学院，北京，100081）Abstract:In recent years,with the development of microbiology,the exploration of microbial resources has been a topic of interest for researchers globally.This paper introduces the importance of obtaining pure culture of microorganisms in microbiological research,and the fact that most microorganisms in nature are still unable to be cultured in the laboratory.Based on this contradiction,this paper introduces in detail the new microbial culture methods and devices that have emerged in the past decade,their working and success.Finally,the existing microbial culture methods are compared,and some future prospects are presented in a quest to bring inspiration for the innovation and development of future microbial culture methods.This may result in a better exploration as well as utilization of different microbial resources.Key words:New method of microbial pure culture;Microbial germplasm resources;Uncultured microorganismsResearch progress in isolation and culture methods of non-culturable microorganisms ZHAO Juntian,ZHANG Ying*(School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing,100081)摘要：近年来随着微生物学的发展，微生物资源挖掘成为热点问题。本文首先介绍了微生物纯培养在微生物学研究中的重要作用，以及自然界大多数微生物仍然无法在实验室中得到培养的现状；基于这一矛盾，详细介绍了近十年出现的新型微生物培养方法和装置并佐以实例；最后对现有微生物培养方法进行总结和展望，希望可以为未来微生物培养方法的创新和发展带来灵感，助力微生物资源的开发与利用。关键词：微生物纯培养新方法；微生物种质资源；不可培养微生物中图分类号：Q93 文献标识码：A DOI:10.11967/2023210202基金项目：国家自然科学基金项目(32270119)通讯作者：张莹(1986-)，女，博士，北京理工大学，副教授，E-mail:作者简介：赵俊天(1997-)，女，硕士，E-mail:3120201425 综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期120 引言微生物是地球上十分丰富的生物资源，人们利用微生物开发获得了许多衍生资源，如抗生素和酶类等1。然而，绝大多数微生物不能在实验室条件下生长2，已经实现实验室培养的微生物培养效率也并不高3,4。因此，提高微生物的培养效率、开发培养原本不可培养微生物的新方法对我们充分利用微生物资源有重要意义。1 微生物纯培养地球上的微生物种类丰富、数量庞大、分布广泛、繁殖迅速。作为自然界生态系统的重要组成部分,微生物不仅在生态平衡中起着举足轻重的作用,同时也是天然活性物质的重要来源。微生物产生的多种次级代谢产物，具有从通信到防御的重要功能5-7，在人类健康8-10和环境的可持续发展方面也发挥着重要作用11,12。获得纯培养物是微生物学研究的基础，但传统的微生物培养方法越来越无法满足人类开发微生物资源的需求，因此需要探索更加高效的微生物培养方式。1.1 不可培养微生物地球上的微生物数量众多，据统计约有9.210293.21030个，微生物种的数量约为101213，但是目前能培养的微生物占自然界微生物总数不到3%，甚至更少14，表1列举了不同环境中微生物的可培养率15，可见，各种环境中微生物的可培养率普遍很低，绝大多数微生物都是不可培养的。表1 不同环境中微生物的可培养率Tab.1 Culturability of microorganisms in different environments未培养微生物的概念起初是由Colwell等人在1982年提出16。1985年，Staley和Konopka发现在培养基上形成菌落的微生物细胞数量与在显微镜下观察到的数量相差甚远，并将这一现象称为“大平板计数异常”17。随后，1997年，Felske等人将能够通过分子生物学方法检测到，但未能在人工条件下获得纯培养的微生物定义为“至今未培养微生物”18。至此，越来越多的研究人员对这些尚未实现纯培养的不可培养微生物产生兴趣。1.2 获得微生物纯培养的意义和常用手段1881 年，Robert Koch 建立了微生物纯培养的方法，通过平板划线的方法使微生物在培养过程中获得足够的生长优势，获得单菌落19。早在1891年，Kanthack 等人就利用平板划线纯培养方法实现了麻风分支杆菌(Mycobacteriumleprae)的纯培养20。液体稀释法(MPN法)也是常用的微生物培养方法，样品经高度稀释后培养，同一稀释度的多数试管样品中微生物不生长，微生物生长的试管很可能就是纯培养物21。除此之外，利用显微操作仪用毛细管或显微针、钩、环等在显微镜下分离获得单个微生物细胞后培养22也是获得纯培养物的重要方法。其中平板划线法从出现到现在依然是我们分离微生物最常用的重要手段，并且发挥着不可替代的作用。研究微生物的形态结构、生理生化、调控机制和基因分析等重要内容都离不开微生物的纯培养23。在病原菌诊断、致病力模型建立和病原菌药物敏感性试验等方面也均需要纯培养物24。目前投入使用的抗生素，如青霉素、肉毒素等，都是以纯培养微生物为基础发现的。因此，获得微生物的纯培养为我们开发利用微生物资源奠定了基础。例如，2017 年，Girish 等人获得了温泉细菌 Paenibacillus polymyxa 的纯培养物并成功从中分离出了抗生素 Fusaridin B，该抗生素因其抗结核的特性而被赋予了新的价值和用途25。随着微生物纯培养技术的不断发展，微生物中所隐藏的生命奥秘，以及巨大的生物资源也将综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期13会在得到其纯培养后展现出来。1.3 微生物培养的限制因素获得纯培养微生物的限制因素有很多：(1)活的但不可培养(VBNC)状态26。众所周知，产生芽孢是部分微生物抵抗不良环境的策略，Colwell等人发现了不能形成芽孢的细菌的一种抵御不良生存环境的机制VBNC27，大多数进入VBNC状态的微生物在实验室条件下无法培养；(2)微生物自然生境复杂28。自然环境复杂多样，现有技术条件无法完全复刻微生物原生环境；(3)检测技术不够灵敏。缺乏针对低丰度或缓慢生长微生物的检测手段，导致部分微生物培养丢失；(4)培养基富营养化。并非所有的微生物都适合在营养丰富的条件下生长29，高营养的培养基可能会抑制某些生长缓慢微生物的生长30；(5)忽略了微生物间的物质交换与信息交流31，微生物的分离培养很可能是造成微生物不可培养的主要原因之一。为了解除以上微生物培养的限制因素，研究者们开发了许多新型微生物培养装置与技术，助力微生物资源的开发与利用。2 微生物培养新方法2.1 对传统培养方法的改进微生物传统的培养方法包括稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法等，但这些方法无法改变环境中微生物的低培养性，人工创造的生存环境及营养物质并不能满足大部分微生物的生长需要32。经过漫长的探索，我们已经开发出多种微生物培养方法，不断发展和改进现有微生物培养方法也是我们提高微生物培养效率的重要手段。2.1.1 传统培养基的优化培养基的优化主要是调整培养基的成分，在传统培养基中添加某些特殊物质，如添加某些信号物质乙酰高丝氨酸内酯类化合物33、氨基酸、多肽类等等，改善微生物的培养状况，如精氨酸可以诱导白色念珠菌菌丝形成34；添加某些微生物生长因子35、金属离子CuSO45H2O、FeSO47H2O、ZnSO4等促进微生物的生长及其代谢产物产生，如添加CuSO45H2O使枯草芽孢杆菌核黄素的产量有了明显的提高36。2.1.2 寡营养培养过去对微生物的培养人们倾向于为微生物提供丰富且充足的营养物质，但是培养效率却往往达不到我们的预期。这种现象说明并非所有的微生物都适合在营养丰富的条件下生长。在自然环境中占主导地位的许多微生物不适合在含有高浓度复杂碳源的培养基上生长，许多微生物可能需要营养不足或其他苛刻的条件才能培养成功29。2010年，Senechkin 等人定义“oligotrophs”，即能够在(极)低营养素利用率下生长的细菌，也叫寡养菌37。Ilya等人将稀释的样品悬浮液接种到新鲜的低碳和高碳琼脂培养基中，低碳琼脂培养基具有与高碳琼脂培养基相同的组成，但酶促酪蛋白水解物和葡萄糖比高碳培养基低100倍38。孵育后，选择在高碳琼脂培养基上没有形成的菌落但在低碳培养基上形成的菌落，再次转移到新鲜的低碳和高碳琼脂培养基中进行培养，重复上述操作直到第十次转移完成，该方法有效的实现了环境中部分寡养菌的培养。寡养菌不同于其他细菌群体，它们更喜欢低营养环境。因此，可以利用特定限制能源的培养基，如低碳培养基从环境中分离培养寡养菌。2.2 基于共培养的培养方法自然界中的微生物与人类一样都是“群居”生活，微生物间存在十分复杂的联系。微生物共培养模拟了自然界中微生物间的相互作用，允许不同菌体通过释放特殊代谢物质进行交流，从而促进微生物生长。为达到此目的，近些年有以下一些经典的共培养方法。2.2.1 双面培养皿(Double-sided Petri dish，DSPD)2021年，Yuan等人设计并使用了一种真菌共培养装置双面培养皿39(DSPD，图1)，实现了红曲霉和黑曲霉的共培养。DSPD主体由两个直径为9 cm的培养皿组成，每个DSPD包括一个主体部分综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期14和两个盖子。首先，用胶水将两个培养皿的底部粘在一起，然后在培养皿中间钻一个直径2cm的孔，装置主体制作完成。然后将两张直径9 cm的圆形无菌玻璃纸粘贴在DSPD两侧，覆盖培养皿上的孔，防止培养基泄漏。将培养基倒入DSPD中，待培养基固化后接种微生物。代谢产物、信号因子等可以由生长在DSPD一侧的微生物菌株产生并通过培养皿上的孔作用于另一侧的菌株，以此实现不同菌株的共培养。该装置结构简单，便于操作，但目前报道较少，培养效率有待进一步验证。图1 双面培养皿(DSPD)示意图39Fig.1 The structure drawing of Double-sided Petri dish(DSPD)392.2.2 SVCS装置(Submerged volatile co-culture system)图2 SVCS示意图40Fig.2 he schematic diagram of SVCS402020年，Fatemeh等人为了探索挥发性有机化合物对微生物次生代谢产物产生的途径和最终形成的产物的影响，组装了一种新型共培养装置Submerged volatile co-culture system(SVCS，图2)40。该装置将一个100mL玻璃培养瓶作为主培养瓶，连接一个、两个或三个100mL含有不同真菌或细菌的玻璃培养瓶，培养瓶中盛有适于微生物生长的培养基。所有的培养瓶上方均由玻璃细管连通，主培养瓶上方玻璃管口用棉花填充，作为过滤器，只允许挥发性物质通过，防止其他培养瓶中的微生物菌体进入主培养瓶。Fatemeh等人用该装置成功验证了13种真菌和细菌对灵芝胞外多糖生产的影响。该装置可以同时分别验证多种微生物间的相互作用，结构简单，易于操作。不足之处便是该装置具有局限性，只能应用于验证微生物挥发性的代谢产物对其他微生物的影响。2.2.3 海绵-细菌共培养装置2019年，Knobloch等人开发了一种海绵-细菌共培养装置(如图3)，用来分离培养海绵共生细菌41，这是一种依靠半透膜分离海绵外植体和微生物的共培养装置。该装置改良Bio-Dot SF(Bio-Rad)微量过滤器(BioHit)42作为装置的上半部分，先将海绵外植体切碎放入BioHit孔中，再将装置底部每个腔室都充满培养基。待培养基凝固后，将海绵细菌稀释液接种在每个腔室的培养基上，随后在其上方覆盖一层0.2 m的滤膜和七层25 m的滤纸，最后将含有海绵外植体的微滤器上半部分和装置底部固定在一起，放于海水中进行原位培养。该装置对海绵共生微生物有显著的富集效果，可以将其置于实验室环境进行培养，也可以将其放入海绵微生物原生环境进行培养，将共培养与原位培养结合应用，但富集后的分离纯培养还需要继续探索。图3 海绵-细菌共培养装置示意图43Fig.3 The schematic diagram of sponge-bacteria co-cultivation device432.2.4 单菌落共培养装置2015年，Tanaka等人设计了单菌落共培养装置(图4)44，该装置的最外层是培养皿，培养皿内装有聚丙烯隔环和滤膜。开始将1.5%琼脂培养基铺在培养皿最底层，将再0.4%软琼脂培养基(含有某种待共培养的细菌)铺在凝固后的底层培养基上，随后将带有滤膜的聚丙烯隔环即薄膜过滤器铺在上方，最后在过滤器上方倾倒0.4%软琼脂培养基(含有另一种待共培养的细菌)，上综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期15层和下层的菌体共享某些可溶性物质，这些物质可以穿过膜过滤器在各层培养基之间扩散，而菌体则无法穿透膜过滤器，经过一段时间的培养，观察表面菌落的生长状况。利用单菌落共培养装置成功培养出了之前不可培养的副杆状菌(Parabacteroides)并筛选出多组能够相互促进生长的菌株。该装置一定程度上克服了人工培养阻碍微生物间通信交流的问题，但并不适用于好氧菌的培养。图4 单菌落共培养装置示意图44(a)培养皿中膜过滤器整体图(b)共培养系统：1、隔环；2、上层软琼脂培养基；3、0.02 m滤膜；4、下层软琼脂培养基；5、琼脂基层Fig.4 The structure drawing of Single-colony coculture technique44(a)Overview of the membrane filter-bottom ring in a petri dish.(b)Diagram of the coincubation system:1,spacer ring;2,upper layer of soft agar medium;3,0.02 m membrane filter;4,lower layer of soft agar;5,basal layer of soft agar2.3 基于原位培养的培养方法绝大多数微生物只能在其自然生境中生长繁殖，无法实现实验室生长，原因就在于实验室无法满足微生物生长所需的所有条件，原位培养正是解决这一问题的关键。微生物原位培养的重点在于将微生物置于自然栖息地进行培养，利用微生物自然生境为其生长繁殖提供所需条件。近年来，基于原位培养开发的微生物培养装置培养效率可观，挖掘出许多不可培养微生物资源。2.3.1 DHS(Down-flow hanging sponge)生物反应器2022，Hiroyuki等人通过使用Down-flow hanging sponge生物反应器(DHS，图5)和选择性分批培养来富集深海不可培养微生物45。该技术最初由Harada研究组开发，这种反应器最初被研制出来是为了处理发展中国家城市污水，是一种高效的废水处理系统46。DHS主体是长113 cm、直径6.5 cm的玻璃管，管中为多个小海绵块连起的海绵柱，玻璃管下管口附近的气孔可通入CH4、CO2等微生物所需的气体，上管口附近的气孔用于废气的排放。从玻璃管上管口连续灌入培养基，培养基从上至下流经海绵块为微生物供能。装置使用的海绵具有高孔隙率(80%)的网状结构，为微生物生长提供了充足的空间，可以在连续缓慢供给新鲜培养基和能量的同时将细胞保留在海绵中。这种连续流动有助于模拟微生物自然生长环境，人工控制培养基流速，允许持续供应低浓度底物(即稳定的贫营养条件)，同时随着底物的不断流动去除潜在的抑制性废物。但该装置体积较大，只能在实验室进行原位培养模拟实验；目前关于该装置的报道较少，适用范围有待进一步研究。图5 DHS生物反应器示意图45Fig.5 The schematic diagram of DHS Bioreactor452.3.2 Isolation-Tip装置(I-tip)图6 I-tip 装置图47综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期16Fig.6 The schematic diagram of the I-tip472014年，Jung 等人开发了一种微生物原位培养装置Isolation-Tip(I-tip，图6)47，用于从白卡利亚海绵中培养微生物。使用移液器黄色枪头作为装置主体，枪头尖端用玻璃珠填充以防止杂质进入，枪头中加入70 L 0.7%琼脂便于装置内微生物的增殖。将装置中富集的细菌用平板法再进行分离培养，该装置结构简单，小巧方便，可将装置插入海绵的不同组织处进行培养，但富集之后的微生物还需要进一步分离纯化。2.3.3 滤板微捕集器(Filter Plate Micro Trap，FPMT)2008年，Gavrish 等人报道了一种用于分离放线菌的Trap装置(图7)48。装置主体是一个外径56 mm，内径35 mm，厚3 mm的尼龙垫圈，在垫圈底部用0.20.6 m、顶部0.03 m的聚碳酸酯半透膜覆盖形成密闭空间，圈内空间用无菌的琼脂或结冷胶培养基填充。微生物在这个空间内生长，后经平板划线分离纯化。在Trap 技术的基础上，2012年，Jung等人开发一种微生物捕捉器(Filter Plate Micro Trap，FPMT，图8)49，一种用于从土壤中分离细菌的原位培养设备，由多孔板和孔径为0.45 m膜过滤器组成。多孔板有96个相互独立的微型圆柱形微生物培养腔室，每个腔室的顶部呈开放状态，底部有直径1 mm的一个孔，孔上覆盖0.45 m亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜，每个培养腔室最多可以放800 L培养基。该装置可用于分离土壤中不可培养的微生物，充分阻隔装置内的样品与外界土壤样品的接触的同时又实现了利用微生物原生环境提供微生物生长所需的营养物质，不足之处是只能用于土壤中微生物的培养。图7 Trap装置图481、塑料或金属垫圈；2、顶膜过滤器(0.03m孔径)；3、底部膜过滤器(孔径0.2-0.6m)；4、琼脂或凝胶Fig.7 Image of the Trap481,plastic or metal washer;2,top membrane filter(0.03 m pore size);3,bottom membrane filter(0.2 to 0.6 m pore size);4,agar or gellan gum图8 过滤微孔板示意图(A)FPMT示意图(B)49Fig.8 The schematic diagram of filtration microplate(A)The schematic diagram of one well of FPMT(B)492.3.4 扩散室和分离芯片扩散室和分离芯片(ichip)是早期探索环境中不可培养微生物的经典成功尝试，虽然不是近十年出现的新技术，但到目前为止，依然有新的微生物资源被ichip发现。2002 年，Kaeberlein 团队设计了一种扩散室50(diffuse chamber，图9)，用于培养海洋潮汐带沉积物中的微生物。装置由一个有中央通孔的金属环和紧贴在两侧的0.03 m半透滤膜构成。将含有微生物的原生境样品与琼脂混合后注入密封空间内，然后将其返回微生物的自然栖息地培养51。近些年开发的微生物原位培养装置都或多或少受到了扩散室的启发。图9 扩散室示意图50Fig.9 The schematic diagram of diffusion chamber50经过不断优化，该团队于2010年设计了类似于扩散室的高通量分离装置，称为分离芯片(ichip，图10)52。该装置主体由多通孔中心培综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期17养板和半透膜组成，中心板的两侧覆盖聚孔径为0.03 m的碳酸酯薄膜，将带有匹配通孔的盖板拧紧以密封系统并将膜进行固定，防止通孔中微生物细胞随意进出，同时允许环境中营养物质的扩散和微生物间的交流，将ichip放回微生物自然生境培养53。样品采集并悬浮在液体琼脂中,稀释悬浮液，以确保每个ichip通孔中进入一个细胞，待琼脂固化后，微生物细胞便被固定在通孔中。培养板上具有多个相互独立的通孔，每个通孔中只有一个微生物细胞，减少了微生物间的竞争拮抗作用，又保证了微生物间的交流。分离芯片相对于扩散室的进步之处在于ichip是由数百个微型扩散室组成的，具有多个相对独立的培养腔室，可以实现微生物的高通量培养，可以实现单个微生物单独培养，而扩散室只有一个培养腔室。图8 分离芯片ichip示意图52Fig.8 The schematic diagram of ichip 52目前，研究者们已将ichip成功应用到多种环境微生物的分离培养，ichip相比上文中提到的其他微生物培养方法被更广泛的借鉴和应用。2022年ichip成功分离出在生物修复中具有重要作用并且能够耐受和降解三丁基锡(TBT)的Oceanisphaera sp.54；2020年ichip成功培养出原本不可培养的海洋细菌Gallaemonas mangrovi HK-2855；2019年ichip成功驯化1株产生一种新的N-酰基酪氨酸的海绵细菌Alteromona sp.RKMC-009 56；2015年ichip成功驯化1株产生一种新型抗生素Teixobactin的原本不可培养土壤微生物Eleftheria terae 57等等，这些成功的实践证明了ichip在微生物培养中的重要作用，也突显了隐藏在不可培养微生物中的各种新的代谢途径的潜力。2.4 基于细胞分选的培养方法不管是对可培养微生物的培养还是对不可培养微生物的培养，先对微生物细胞进行分选，再根据分选结果有针对性地选择合适的培养方式，这无疑会提高微生物的培养效率。细胞分离后培养通常比混合培养后分离更有效58，细胞分选技术的出现创造了微生物细胞先分选再培养的策略，大大提高了微生物的培养效率。2.4.1 激光喷射单细胞分选目前，细胞分离技术种类繁多，单细胞喷射技术是应用面最广的技术之一。单细胞喷射技术的原理是应用激光诱导前向转移(LIFT)技术59来分离细菌，LIFT技术的原理是当激光脉冲照射在涂层表面时，涂层会吸收激光能量而汽化，涂层上的材料(含有微生物细胞)会在加热引起的气体压力或激波下被推开。为了使细胞尽可能长时间存活，2022年Liang等人提出了一种三层LIFT系统(图11)60，顶层：25 nm铝膜；第二层：厚度为3 m的琼脂培养基；第三层：含细菌的液体。激光束穿过显微镜物镜后聚焦于顶层的铝膜上，铝膜吸收激光脉冲，受热形成推力，推动第三层细胞移动，第二层琼脂可以保护细胞免受铝膜加热的损伤。该装置成功用于分离和培养单一革兰氏阴性(Escherichia coli)、革兰氏阳性(Lactobacillus rhamnosus GG LGG)和真核(Saccharomyces cerevisiae)微生物，优点是可以实现微生物单细胞的分离，不足之处是需要复杂的光学仪器辅助分离。图11 用于单个微生物分离和培养的激光诱导正向转移(LIFT)系统示意图60(a)L1至L：透镜；HP：半波片；PBS：偏振分束器；S：快门；M1至M4：反射镜；DM1：分色镜；MO1至MO2：显微镜物镜。(b)三层结构。第一层，吕膜；第二层，固体综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期18培养基；第三层，液体培养基Fig.11 The schematic diagram of the laser induced forward transfer(LIFT)system used for single-microorganism isolating and culturing60(a)L1 to L4,lenses;HP,half-waveplate;PBS,polarizing beam splitter;S,Shutter;M1 to M4,mirrors;DM1,dichroic mirror;MO1 to MO2,microscopy objectives.(b)Three-layer structure.1st layer,Al film;2nd layer,solid culture medium;3rd layer,liquid culture medium2.4.2 二维细胞分离2022年，Krishna等人利用梯度离心结合串联稀释的方法进行二维细胞分离(图12)61，对分离后的微生物细胞进行培养。具体方法是，将采集的土壤样品涡旋2 min，使微生物细胞与固体颗粒分离，悬浮液在不断增加的离心力下进行连续多轮离心。将从每一轮离心中获得的上清液在更高的离心力下进行下一轮离心，将每次离心后获得的沉淀重新悬浮，连续稀释后进行平板培养。Krishna等人证明，与单独使用串联稀释相比，梯度离心结合串联稀释从环境样本中分离出的微生物属的数量和种的数量明显增多。该方法在不使用复杂仪器的情况下提高了微生物的可培养性，不足之处是操作较为繁琐，需多次重复离心和稀释；目前应用该方法的报道较少，还需要进一步探索。图12 二维细胞分离(2DCS)方法的图示61Fig.12 Graphical representation the 2-dimensional cell separation(2DCS)method612.4.3 自动化微生物微滴培养系统随着对微生物培养方法的深入探索，全自动微流控一体化相关技术出现，实现了微生物从培养、检测到筛选的集成化，大大提高了微生物的培养效率。2021年，清华大学团队成功开发了一款基于液滴微流控技术的全自动高通量微生物微液滴培养系统(Microbial microdroplet culture system,MMC，图13)，该系统包含液滴识别、液滴光谱检测、微流控芯片、进样等多个功能模块，成功地实现了微生物液滴培养过程需要的接种、培养、监测、传代、筛选等功能的集成化62。MMC系统中每个液滴体积为23 L，整个系统有200个液滴培养单元，相当于200个摇瓶培养同时进行。通过微流控芯片T形通道形成精确可控的微液滴，液滴从生成开始，通过液滴识别系统对每个液滴进行编号，根据培养过程微液滴OD检测数据实现目标微生物微液滴的分选，获得的微生物根据需要进行后续培养与分析。MMC系统大大提高了微生物的培养效率，实现了微生物从接种到筛选的一体化培养，设备结构精细复杂，但目前只完成了系统底层单元操作的开发。3 总结与展望本文以实现微生物培养为目标，综述了十余年间微生物培养的创新方法及实例。从这些实例中总结出微生物培养方法发展的三大趋势。一是细胞分离技术在微生物培养中发挥着越来越重要的作用；二是基于微流控技术的微生物高通量培养优势显著；三是多技术联合使用，以原位培养和共培养为原理，出现了多种新型微生物培养装置和反应器，如细胞分离技术结合稀释培养、ichip结合共培养63、高通量原位培养装置等。随着越来越多的新型综合培养技术和装置出现，微生物的培养效率也在不断提高。一些难培养或不可培养微生物的成功分离培养，为微生物资源的开发利用注入了新的活力。未来对于微生物培养方法的探索，我们认为可从以下几方面展开：(1)优化和改进现有的微生物培养方法；(2)开发更有效的不可培养微生物的培养方法。充分研究已经成功培养的原本不可培养微生物的生存机理，寻找不可培养微生物难以培养的原因；(3)多技术多方法联合使用。传统培养法与新型培养法、多种新型培养方法有机结合，取长补短。(4)开发更加成熟的微生物培养、检测和筛选集成化装置，这必将帮助我们探索各种极端无人环境中的微生物，获得更多特殊又珍贵的微生物资源。综述生命科学仪器 2023 第21卷/1期19参考文献1Wohlleben W,Mast Y,Stegmann E,et al.Antibiotic drug discoveryJ.Microb Biotechnol 2016,9(5):541-548.2Munson MA,Banerjee A,Watson TF,et al.Molecular Analysis of the Microflora Associated with Dental CariesJ.Journal of Clinical Microbiology 2004,42(7):3023-3029.3Tanaka T,Kawasaki 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