3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家重点研发项目子课题(2021YFC3201005);安徽省高校省级自然科学研究项目-创新团队(2022AH010019);国家自然科学基金资助项目(21677001).第一作者:张颖(1998),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail:awm_ *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221026001张颖,张瑾,周娜娜,等.3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估J.生态毒理学报,2023,18(3):465-477Zhang Y,Zhang J,Zhou N N,et al.Quantitative evaluation of combined toxicity interactions of three plasticizers on phtobacterium Q67 J.Asian Journalof Ecotoxicology,2023,18(3):465-477(in Chinese)3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估张颖1,张瑾1,2,拾,周娜娜1,陈如荔1,申慧彦1,21.安徽建筑大学环境与能源工程学院,合肥 2306012.安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室,合肥 230601收稿日期:2022-10-26 录用日期:2022-12-24摘要:增塑剂(plasticizers,PLAs)是工业生产中广泛使用的高分子材料助剂,伴随着主产品的使用而进入环境中,很可能会对环境中的生物甚至人类的健康产生危害。因此,以 3 种常见的 PLAs:双酚 A(bisphenol A,BPA)、双酚 S(bisphenol S,BPS)和三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBEP)为研究对象,运用直接均分和均匀设计射线法分别设计二元和三元混合物体系,应用时间微板毒性分析方法系统测定 3 种污染物及其混合物体系对淡水发光菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensissp.-?Q67,Q67)的毒性,应用浓度加和(concentration addition,CA)分析混合物的毒性相互作用,采用绝对残差(deviation from CAmodel,dCA)定量评估毒性相互作用强度,并结合热图法分析相互作用强度变化规律。采用电镜扫描分析 Q67 细胞形态,二苯胺显色法和考马斯亮蓝法测定 Q67 细胞的 DNA 和可溶性蛋白质大分子的泄露情况来探究3 种 PLAs 及其混合物可能的毒性作用机理。结果表明,BPA、BPS、TBEP 对 Q67 均具有明显的急性毒性,且急性毒性均大于长期毒性;以半数效应浓度负对数值为毒性指标,3 种 PLAs 在同一暴露时间的毒性顺序:BPABPSTBEP;混合物体系 BPA-BPS 呈现协同作用,而 BPS-TBEP、BPA-TBEP、BPA-BPS-TBEP 呈现拮抗作用,且相互作用强度均受暴露时间和混合物浓度的影响;BPA-BPS-R4 射线的协同作用强度最强,dCA 绝对值为 0.411,BPA-BPS-TBEP-R1 射线的拮抗作用最明显,dCA 绝对值为 0.670;3 种 PLAs 及其混合物对Q67 的作用主要通过破坏细胞的结构和形态,使其 DNA 和可溶性蛋白质大量流失,造成细胞大量死亡。关键词:增塑剂;青海弧菌;拮抗作用;协同作用;时间依赖性,热图文章编号:1673-5897(2023)3-465-13 中图分类号:X171.5 文献标识码:AQuantitative Evaluation of Combined Toxicity Interactions of Three Plasti-cizers on Phtobacterium Q67Zhang Ying1,Zhang Jin1,2,*,Zhou Nana1,Chen Ruli1,Shen Huiyan1,21.College of Environment and Energy Engineering,Anhui Jianzhu University,Hefei 230601,China2.Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province,Hefei 230601,ChinaReceived 26 October 2022 accepted 24 December 2022Abstract:Plasticizers(PLAs)are widely used in industrial production as additives to polymeric materials,whichenter the environment along with the main product and are likely to be hazardous to organisms in the environmentand even to human health.Therefore,three common PLAs,bisphenol A(BPA),bisphenol S(BPS)and tris(2-bu-466 生态毒理学报第 18 卷toxyethyl)phosphate(TBEP),were selected as research objects and their binary and ternary mixtures were designedby direct equipartition and uniform design ray methods,respectively.The toxicity of the three contaminants andtheir mixture systems to a freshwater luminescent bacteriumVibrio qinghaiensissp.-Q67(Q67)was systematicallydetermined by the time-dependent microplate toxicity analysis(t-MTA).The concentration addition model(CA)was applied to analyze the toxic interactions of mixtures and the deviation from CA model(dCA)combined withthe heatmap method used to analyze the intensity and variation of toxic interactions.To investigate the possiblemechanisms of toxic effects of three PLAs and their mixtures,the cell morphology of Q67 was analyzed by scan-ning electron microscope,and the leakage of DNA as well as soluble protein macromolecules from Q67 cells weredetermined by diphenylamine colorimetry and the Coomassie Brilliant Blue methods,respectively.The resultsshowed that BPA,BPS and TBEP were all of acute toxicity to Q67,and the acute toxicity was stronger than theirlong-term toxicity.By selecting the negative logarithm of median effect concentration(pEC50)as the toxicity index,the toxicity order of the three PLAs was:BPABPSTBEP in the same exposure time.The mixture system BPA-BPS showed synergistic effects,while BPS-TBEP,BPA-TBEP and BPA-BPS-TBEP showed antagonistic effectswhose interaction strength was influenced by exposure time and concentration.The strongest synergistic effect dis-played in BPA-BPS-R4 ray with the maximum absolute value of dCA(0.411),whereas the strongest antagonisticeffect showed in BPA-BPS-TBEP-R1 ray with an absolute dCA value of 0.670.The effects of the three PLAs andtheir mixtures on Q67 were mainly through the destruction of the structure and morphology of the cells,causingmassive loss of their DNA and soluble proteins,resulting in massive cell death.Keywords:plasticizer;Vibrio qinghaiensissp.-Q67;antagonism;synergism;time-dependence;heatmap 增塑剂(plasticizers,PLAs)是工业生产中广泛使用的高分子材料助剂,是一类重要的化工产品添加剂,作为助剂普遍应用于塑料制品、混凝土、泥灰、水泥、石膏、化妆品及清洗剂等材料中1。在长期使用与储存过程中,这些 PLAs 进入环境中,随环境介质发生迁移,不仅污染了环境,还有可能危害生物与人体健康。陈寒嫣2的研究表明磷酸三苯酯、三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBEP)和磷酸三(1,3-二氯丙基)酯 3 种磷酸酯类 PLAs 即使在低浓度下,也会导致斑马鱼凋亡途径下游基因Cas3、Cas9的表达增加,从而诱发凋亡相关蛋白的?凋亡途径。Xu 等3研究发现邻苯二甲酸酯类增塑剂可能会使非洲爪蟾胚胎发育异常、死亡率升高。因此,PLAs 作为新兴有机污染物所可能带来的潜在风险引起了广泛关注。双酚 A(bisphenol A,BPA)、双酚 S(bisphenol S,BPS)、TBEP 和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(bis(2-eth-ylhexyl)phthalate,DEHP)是生活中常用的 PLAs,其中 BPA 是一种常见的环境雌激素,常作为化妆品、食品的包装材料以及其他产品的 PLAs4。然而,有研究者发现 BPA 对斑马鱼的繁殖具有显著的抑制效应,长期接触 BPA 可对其繁殖性能及后代品质产生一定的影响5,BPA 还可引起甲状腺激素水平变化、肝脏机能变化、生育能力下降、流产等6。BPS是目前最常用的 BPA 替代物,在塑料制品包装等领域得到了广泛的应用7。BPS 和 BPA 的结构相似,已有研究显示 BPS 有类似 BPA 的作用,对动物的生殖、免疫、神经和代谢都有毒性8-9。BPS 能影响幼鼠的取食和幼仔的早期发育10-11。刘倩等12的研究表明 BPS 暴露导致斑马鱼仔鱼视网膜受损,随着BPS 浓度的增加,BPS 对斑马鱼仔的毒性作用也将显著增加。TBEP 作为常用有机磷酸酯类的 PLAs广泛添加于家具、清漆、塑料、纺织品和电子材料等工业产品中13。在中国北京(308.1 ngL-1)和加拿大安大略省(约 10 gL-1)的废水处理厂中的曾检测出较高浓度的 TBEP14-15。TBEP 广泛存在于环境中,然而 TBEP 对生物体有一定的内分泌干扰、神经毒性等,甚至含量很低时都会对环境和生态系统的稳定性有负面影响16。蔡凤森17进行的急性毒性试验以鲤鱼为指示性生物,探究 TBEP 毒性,TBEP 的 LC50为10.04 mg L-1。以上研究表明,系统开展 PLAs 的环境安全性研究具有重要的实际环境意义。目前关于 PLAs 的单一毒性研究已有报道18,但有关 PLAs 对生物的联合毒性研究报道较少。因此,本文拟以 3 种 PLAs(BPA、BPS 和 TBEP)为研究第 3 期张颖等:3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估467 对象,应用直接均分射线法(direct equipartition ray,EquRay)和均匀设计射线法(uniform design ray,UD-Ray)分别设计 3 种 PLAs 的二元混合体系(BPA-BPS、BPS-TBEP、BPA-TBEP)和三元混合物体系(BPA-BPS-TBEP),每个混合体系分别设计 5 条不同浓度配比的射线(R1、R2、R3、R4、R5),以青海弧菌(Vibrio qinghaiensissp.-Q67,Q67)为指示性生物,采?用时间微板毒性分析法(time-dependent microplatetoxicity analysis,t-MTA),测定不同暴露时间(0.25、2、4、8 和12 h)Q67 的发光值,采用浓度加和(concentra-tion addition,CA)模型和绝对残差(deviation from CAmodel,dCA)模型进行混合物毒性相互作用的定性与定量分析,所得结果可为 PLAs 毒性风险评估提供一定的理论与数据参考。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 材料与仪器实验所用菌种为青海弧菌 Q67,从北京滨松光子技术股份有限公司采购,菌种的培养与保存参照文献19。3 种增塑剂 BPA、BPS、TBEP,纯度均99%,均购于国药集团化学试剂有限公司,其基本理化性质列于表 1。3 种试剂的储备液均采用 Milli-Q 水配制,保存于 4 冰箱中,备用。本实验过程中所用到主要实验仪器有 Synery 2Multi-Mode 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、UV-2600i 紫外可见分光光度计和 AURIGA 冷场发射扫描电子显微镜(德国 ZEISS 公司)等。1.2 微板毒性分析法3 种 PLAs 及其混合物对 Q67 的毒性测定采用t-MTA 法20。按预实验的稀释因子设置 12 个浓度梯度,配制好的各浓度100 L 加入到标准的白色不透明微板中,最终在每个微孔中加入100 L 处于对数生长期的 Q67 菌液使得每孔总体积为200 L,置于(221)培养箱中,在不同暴露时间(0.25、2、4、8和12 h)取出,用酶标仪测定 Q67 的发光值数据。为减少实验误差,每个实验组均设置 3 个平行样减少误差,详细过程见文献20。表 1 3 种增塑剂的基本理化性质及 Weibull 函数的拟合参数Table 1 Basic physicochemical properties and fitting parameters of the Weibull function for three plasticizers化合物Name分子式MolecularformulaCAS 号CASnumber分子量Molecularweight储备液浓度/(mol L-1)Stockconcentration/(mol L-1)时间/hTime/hRMSErEC50/(mol L-1)pEC50双酚 A(BPA)Bisphenol A(BPA)C15H16O280-05-7228.298.76E-050.257.591.550.0330.99287.36E-065.1326.801.430.0420.98549.74E-065.0146.211.390.0420.97961.86E-054.7386.521.490.0590.95862.39E-054.62127.691.770.0410.97852.81E-054.55双酚 S(BPS)Bisphenol S(BPS)C12H10O4S80-09-1250.274.79E-030.258.112.110.0410.98959.61E-054.0227.322.060.0350.99461.86E-043.7348.192.420.0460.99202.91E-043.5488.082.530.0500.99014.59E-043.34128.762.720.0770.98254.41E-043.36三丁氧基乙基磷酸酯(TBEH)Tris(2-butoxyethyl)phosphate(TBEH)C18H39O7P78-51-3398.475.00E-030.2510.503.150.0250.99793.55E-043.4528.992.820.0510.99024.81E-043.3248.672.680.0420.99334.25E-043.37810.463.310.0470.99255.36E-043.271211.833.820.0490.99206.41E-043.19注:RMSE 表示均方根误差,r表示相关系数。Note:RMSE stands for root mean square error;rrepresents the correlation coefficient.468 生态毒理学报第 18 卷1.3 毒性机理探究为了探究 3 种 PLAs 及其混合物作用后 Q67 细胞发生的变化,采用电镜扫描分析 Q67 细胞形态,二苯胺显色法和考马斯亮蓝法测定 Q67 细胞的DNA 和可溶性蛋白质大分子的泄露情况。受药物作用,菌细胞形态可能会发生改变。通过扫描电镜观察其微观机构,能够直观地观察到细胞在药物作用下的形态变化,具体操作过程见文献21-22。在菌细胞正常生长的情况下,蛋白质和 DNA 等大分子物质贯穿于整个细胞膜和细胞质中,DNA 和蛋白质等大分子物质的外溢表明胞膜完整性遭到了破坏23。菌液中蛋白质溶出量和 DNA 溶出量的测定方法具体见参考文献24-27。1.4 混合物的实验设计为有效地考察混合物随浓度和时间的毒性变化规律,实验采用直接均分射线法(EquRay)28设计了3 个二元混合物体系(BPA-BPS、BPA-TBEP、BPS-TBEP),应用均匀设计射线法(UD-Ray)29设计了一个三元混合体系(BPA-BPS-TBEP),每个混合物体系均安排了 5 条不同浓度比的射线(R1、R2、R3、R4、R5),各组分浓度比(pi)见表 2。1.5 浓度-效应曲线拟合Weibull 函数能较好地拟合在不同暴露时间点的 S 型-浓度-效应关系30,表达式见式(1):Weibull 函数E=1-exp(-exp(+log10(c)(1)式中:E表示效应(0E1),c表示单一化合物或者?混合物浓度,和 是模型参数。1.6 混合物毒性相互作用分析1.6.1 浓度加和(CA)模型CA 模型常用来评估污染间的联合毒性相互作用。实验观测数据与 CA 预测结果间的偏差表示混合物存在相互作用(协同或拮抗)31-33。CA 模型公式如下:ni=1ciECx,i=1(2)式中:ci表示混合物产生某一效应x时组分i的浓?度,ECx,i表示混合物中第i个组分单独存在时产生?效应(E)为x时所需要的浓度。1.6.2 绝对残差(dCA)模型dCA 模型基于 CA 模型衍生而来,可用来定量评估混合物体系的联合毒性作用强弱,dCA0、dCA0.9,RMSEBPS(pEC50=3.36)TBEP(pEC50=3.19)。表 2 混合物体系中各物质组分构成及浓度比(pi)Table 2 Composition and concentration ratio of each component in mixture system(pi)射线RaypBPApBPS射线RaypBPApTBEP射线RaypBPSpTBEP射线RaypBPApBPSpTBEPR12.41E-017.59E-01R11.80E-018.21E-01R17.75E-012.25E-01R14.03E-032.81E-017.15E-01R21.13E-018.87E-01R28.05E-029.20E-01R25.79E-014.21E-01R21.16E-026.16E-013.73E-01R35.98E-029.40E-01R34.19E-029.58E-01R34.08E-015.93E-01R31.86E-021.41E-018.40E-01R43.08E-029.69E-01R42.14E-029.79E-01R42.56E-017.44E-01R43.18E-024.23E-015.63E-01R51.26E-029.87E-01R58.68E-039.91E-01R51.21E-018.79E-01R52.53E-023.97E-015.78E-01第 3 期张颖等:3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估469 2.2 3 种 PLAs 二元混合体系对 Q67 的毒性为了更清晰地表述出污染物随时间和组分浓度比的改变,其毒性大小变化规律,采用 pEC50热图来表征,其颜色渐变程度可直接反映出污染物毒性大小变化情况,绘制结果见图 2,随着绿色的加深,毒性逐渐增强,即 pEC50值增大。结合表 2,由图 2(a)可知,除 12 h 外在其他相同暴露时间点下,从 R1 到 R5 混合射线,绿色整体上呈现变浅的趋势,即 BPA-BPS 混合物对 Q67 具有明显的浓度比依赖毒性。此外,在 BPA-BPS 混合物体系中,R1、R2、R3 混合射线在 0.25 12 h 暴露时间段和 R4、R5 混合射线在 0.25 8 h 暴露时间段,绿色随着实验时间的增长而逐渐变浅,说明这 5 条射线整体上对 Q67 时间依赖毒性较为明显。由图 2(b)可知 BPS-TBEP 二元混合物体系同条混合射线对 Q67 表征毒性大小的绿色无明显的渐变规律,说明 BPS-TBEP 的毒性与暴露时间、浓度比无明显的相关性。由图 2(c)可知 BPA-TBEP 二元混合物表现具有明显的浓度比依赖毒性,即在 pEC50热图中表征混合物对 Q67 毒性大小的绿色从混合射线 R1 到R5 呈现逐渐变浅的规律,表明 BPA-TBEP 二元混合物对 Q67 的毒性随着 TBEP 所占浓度比的增大而逐渐减弱。随着暴露时间的延长,只有 R1、R2 和 R4混合射线绿色逐渐变浅,即说明 R1、R2 和 R4 混合射线对 Q67 具有明显的时间依赖毒性,而 R3 和 R5则不具备此特性。2.3 3 种 PLAs 二元混合体系毒性相互作用定量评估结合 CA 和 dCA 这2 种模型,采用 dCA 热图定量分析混合物的毒性相互作用强度,其颜色渐变情况可以直接表现出污染物相互作用强度随浓度和时间因素的变化规律。陈如荔等35也表明,热图在表现相互作用强度上有较大优势。协同和拮抗作用分别用红色和蓝色表示,加和用白色表示。红色/蓝色越深,dCA 绝对值越大,即混合物毒性相互作用强度越大。BPA-BPS、BPS-TBEP、BPA-TBEP 二元混合物协同和拮抗作用强度绘制结果如图 3 所示。图 1 3 种增塑剂(PLAs)对 Q67 的浓度-效应图Fig.1 The concentration-response curves of three plasticizers(PLAs)on Q67图 2 BPA-BPS、BPS-TBEP 和 BPA-TBEP 混合物体系各射线 pEC50热图Fig.2 The heatmap of pEC50for each ray of BPA-BPS,BPS-TBEP and BPA-TBEP mixture system470 生态毒理学报第 18 卷图 3 3 组二元混合物体系各射线的 dCA 热图Fig.3 The dCA heatmap for each ray of three binary mixture systems第 3 期张颖等:3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估471 由图 3(a)可知,在 BPA-BPS 混合物体系中,R1和 R2 混合射线在暴露时间 4 12 h 段呈现协同作用,R3、R4 和 R5 混合射线在暴露时间2 12 h 呈现协同作用,且表征协同作用的红色随着暴露时间的延长而加深。此外,BPA-BPS 二元混合物的 dCA 值受暴露时间和混合物浓度的影响,当混合物浓度相同时,R1 R5 混合射线的红色均随着实验时间的延长而逐渐加深,即 dCA 绝对值随着暴露时间的延长而缓慢增大,即暴露时间越长,协同作用强度越大。暴露时间相同时,R1 R5 混合射线的红色随着混合物浓度的增加而先加深后变浅,dCA 绝对值随着混合物浓度的增加而先增大后减小,即协同作用强度先增强后减弱。R4 射线的协同作用强度最大,其混合物浓度为 2.84E-4 mol L-1,在暴露时间为 12 h 时,dCA 绝对值的最大值为 0.411。由图 3(b)可知,BPS-TBEP 二元混合物存在明显的拮抗作用,且 R1、R2 和 R3 混合射线随着暴露时间的延长,表征拮抗作用的蓝色逐渐变浅。BPS-TBEP 混合物的 dCA 值也受暴露时间和混合物浓度的影响。在同一浓度作用下,随着暴露时间的延长,R1 R3 混合射线蓝色均呈现逐渐变浅的变化趋势,这说明 dCA 值随着暴露时间的延长而缓慢减小,即拮抗作用强度随着暴露时间的延长而不断减弱;而 R4 和 R5 混合射线则很明显不呈现这种规律,蓝色无明显的渐变规律,即拮抗作用强度无明显的变化规律。同一暴露时间,5 条混合射线蓝色均随着浓度的增大而先加深后变浅,说明 dCA 值随着浓度的增加而先增大后减小,即拮抗作用强度先增强后减弱。在 BPS-TBEP 混合物中,R1 射线的拮抗作用强度最大,其混合物浓度为3.52E-4 mol L-1,在暴露时间为0.25 h 时,dCA 绝对值的最大值为0.521。由图 3(c)可知 BPA-TBEP 二元混合物 R1 和 R2射线 0.25 12 h 仅表现出加和作用,R3、R5 射线在0.25 4 h、8 12 h 和 R4 射线在 0.25 12 h 则呈现拮抗作用。BPA-TBEP 混合物的 dCA 值受暴露时间和混合物浓度的影响。在同一浓度作用下,随着暴露时间的延长,R1 R3 混合射线蓝色变化不明显,而 R4 和 R5 均为由深到浅再变深的变化趋势,即拮抗作用强度随着暴露时间的延长出现先增强后减弱,最后再增强的变化规律。同一暴露时间点下,5 条混合射线蓝色均随着浓度的增大变浅,即拮抗作用强度逐渐减弱(dCA 值逐渐减小)。BPA-TBEP混合物中,R5 射线在混合物体系浓度为 7.78E-4mol L-1、暴露时间为 12 h 的拮抗作用强度最大,其dCA 绝对值为 0.404。除了暴露时间和污染物浓度外,组分浓度比对混合物毒性相互作用的影响也尤为重要。结合表2,从组分比看,随着组分中 BPA 的浓度占比降低,BPS 的升高,图 3(a)中 R1 R5 射线的红色部分整体呈现增强趋势,即协同作用强度逐渐增强。图 3(b)中 R1 R5 射线的蓝色部分整体呈现减弱趋势,即随着组分中 BPS 的浓度占比降低,TBEP 的升高,拮抗作用强度逐渐减弱。在图 3(c)中,R1 R5 射线的蓝色部分整体呈现增强趋势,即随着组分中 BPA的降低,TBEP 的升高,拮抗作用强度逐渐增强。2.4 3 种 PLAs 三元混合体系对 Q67 的毒性BPA-BPS-TBEP 三元混合物的混合射线的毒性大小变化规律可用 pEC50热图表示,结果如图 4 所示。结合表 2,由图 4 可知,5 条混合射线(R1 R5)在 0.25 12 h 对 Q67 的时间和浓度比依赖毒性整体上来说都较为明显。混合射线 R1 到 R5,表征混合物对 Q67 毒性大小的绿色总体呈现逐渐变浅的规律,即随着组分浓度比的改变,毒性逐渐减弱。在0.25 12 h 时间段,R1 R3 射线,绿色整体上逐渐变浅,pEC50值呈现逐渐减小的规律,即 R1、R2 和R3 对 Q67 的毒性逐渐减弱。在 0.25 8 h 时间段,R4 和 R5 混合射线与前 3 条射线毒性变化规律类似,但在8 12 h 时间段不存在该特性。R1 R5 的毒性整体上与暴露时间呈现负相关关系,即时间依赖毒性比较明显。R1 R5 混合射线的绿色在相同时间点(0.25 8 h)逐渐变浅,而 8 12 h 相同时间点则无此特点,但 R1 R5 从整体上看呈现时间依赖毒性。图 4 三元混合物体系各射线 pEC50热图Fig.4 The heatmap of pEC50for each ray of theternary mixture system472 生态毒理学报第 18 卷2.5 3 种 PLAs 三元混合体系毒性相互作用定量评估 dCA 热图的颜色渐变情况可以很明显地表述出拮抗作用强度随浓度和时间因素的变化规律36:随着蓝色越深,拮抗作用增强,即 dCA 绝对值增大。由图 5 可知,BPA-BPS-TBEP 混合体系存在明显的拮抗作用。R1、R2 和 R3 混合射线在 0.25 12 h、R4 和 R5 混合射线在 8 12 h 时间段都表现出了拮抗作用。同时还可得知,BPA-BPS-TBEP 三元混合物的 dCA 值受暴露时间和混合物浓度的影响。浓度相同时,R1 至 R5 混合射线中表征毒性大小的蓝色渐变情况与暴露时间呈正相关关系,这说明 dCA值随着暴露时间的延长而增大,即拮抗作用强度随着暴露时间的延长而不断增强。同一暴露时间点下,R1 R5 混合射线蓝色均随着浓度的增大而先加深后变浅,这说明 dCA 值随着混合物浓度的增加而先增大后减小,即拮抗作用强度随着混合物浓度图 5 BPA-BPS-TBEP 混合物体系各射线的 dCA 热图Fig.5 The dCA heatmap for each ray of BPA-BPS-TBEP mixture systems第 3 期张颖等:3 种增塑剂对发光菌 Q67 联合毒性作用定量评估473 的增大而先增强后减弱。与其他混合射线相比,R1射线的拮抗作用强度最大,其混合物浓度为 1.37E-3mol L-1,在暴露时间为 12 h 时,dCA 绝对值的最大值为 0.670。2.6 3 种 PLAs 混合物对 Q67 的毒性作用机理由于混合物的毒性作用机理往往由单个组分的毒性作用机理决定,并且相同组分构成的混合物毒性机理差异性不大37,故仅选取了协同/拮抗作用强度较大的部分混合射线作用 Q67,然后对其进行细胞形态前后的对比分析,采用二苯胺显色法和考马斯亮蓝法对协同/拮抗作用强度较大的部分混合射线进行 Q67 细胞 DNA 溶出量的测定和可溶性蛋白溶出量的测定。2.6.1 3 种 PLAs 及其混合物对 Q67 的细胞结构的影响 3 种 PLAs(BPA、BPS、TBEP)及其混合物代表射线(EC50-12 h 浓度)作用前后对 Q67 细胞形态的影响,采用电镜扫描进行观察。电镜扫描结果如图 6所示,其中 3 个二元混合物体系选择 BPA-BPS-R4和 BPS-TBEP-R3,1 个三元混合物体系选择了 BPA-BPS-TBEP-R1 作 为 代 表,3 种 PLAs(BPA、BPS、TBEP)和它们的混合物代表射线对 Q67 细胞有一定的损伤。由空白对照组可知,正常 Q67 细胞形态为弧形杆状、外形丰满、表面平滑、边缘平坦、结构完整。但BPA、BPS 和 TBEP 作用 Q67 菌体12 h 后,部分 Q67菌体细胞弧杆状外形破裂,每个细胞结构间界限不清晰,细胞间出现粘连,有些菌体之间有粘连现象,细胞膜变得粗糙不平,这表明 3 种 PLAs 对 Q67 的细胞壁及细胞膜有影响,BPA 和 BPS 作用 Q67,使细胞拉长,出现粘连,但仍能维持正常形态。TBEP导致 Q67 不能维持正常的形态,菌细胞发生凹陷、融合。3 种 PLAs 的二元和三元混合物也对 Q67 的细胞有一定的损伤,Q67 细胞在混合物代表射线作用后形态发生改变,开始出现菌体结构破裂,且细胞间出现不同程度的融合现象,细胞结构间界限不清晰。这表明3 种 PLAs(BPA、BPS 和 TBEP)的二元和三元混合物均可作用于 Q67 的细胞壁和细胞膜,破坏了它的菌体,导致它不能维持正常的细胞的形状。值得注意的是,BPS-TBEP 和 BPA-BPS-TBEP 对 Q67图 6 3 种 PLAs 及其混合物代表射线对 Q67 细胞形态的影响Fig.6 Effects of representative rays of three PLAs and their mixtures on the morphology of Q67 cells474 生态毒理学报第 18 卷的破坏情况更倾向于单个物质 TBEP,即菌细胞表面粗糙、凹陷,结构间界限不清。结合表 2 可知,TBEP 在 2 条代表射线中组分占比较高,对菌的影响较大。2.6.2 3 种 PLAs 及其混合物代表射线对 Q67 的DNA 溶出量的影响 3 种 PLAs(BPA、BPS 和 TBEP)及其混合物代表射 线(BPA-BPS-R4、BPS-TBEP-R3 和 BPA-BPS-TBEP-R1)在 EC50-12h 浓度下对 Q67 细胞 DNA 溶出量的影响结果如图 7 所示。由图 7 可知,在 3 种 PLAs(BPA、BPS 和 TBEP)及其混合物代表射线(BPA-BPS-R4、BPS-TBEP-R3和 BPA-BPS-TBEP-R1)对 Q67 作用后,其 DNA 释放量与空白对照组相比有所提高,即 Q67 菌体细胞结构被 3 种 PLAs 及其混合物射线作用破坏后,细胞内大分子 DNA 外流,这说明了 BPA、BPS 和 TBEP及其混合物代表射线破坏了细胞膜的完整性,DNA大分子的流失会破坏细胞的新陈代谢,使细胞丧失保护,从而导致菌体的死亡。在 EC50-12 h 浓度下,培养液中 DNA 溶出量具有差别,但总体差别不明显,其中具有协同作用的 BPA-BPS-R4 混合射线的DNA 溶出量最少,为 46.62 g mL-1。2.6.3 3 种 PLAs 及其混合物代表射线对 Q67 的可溶性蛋白溶出量的影响 采用考马斯亮蓝法测定 3 种 PLAs(BPA、BPS和 TBEP)及其混合物代表射线及其混合物代表射线(BPA-BPS-R4、BPS-TBEP-R3 和 BPA-BPS-TBEP-R1)在 EC50-12 h 浓度时作用于 Q67 前后的可溶性蛋白溶出量的变化,结果如图 8 所示。由图 8 可知,在 BPA、BPS、TBEP、BPA-BPS-R4、BPS-TBEP-R3 和BPA-BPS-TBEP-R1 作用后,培养液中的可溶性蛋白溶出含量均有所提升,即 Q67 菌体细胞结构被药物作用破坏后,细胞内大分子可溶