Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1364-1371Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究周艳，宿宿露，王云,范韦佟,李洪梅,李蓉涛,刘昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明6 50 50 0摘要：本研究对从蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）和赤芍（PaeoniaeRubra Radix）中分离的一种苯丙素类化合物ferulaldehyde的抗甲型流感病毒的作用机制进行探索。通过加药时间点、免疫荧光实验、红细胞凝集法与神经氨酸酶活力检测等实验，发现化合物ferulaldehyde主要影响流感病毒的复制和释放环节，干扰病毒的生命周期从而发挥抗流感病毒活性。分子对接结果进一步确认流感病毒NP和NA蛋白很可能是它作用的靶点。同时,该化合物还能显著抑制由流感病毒引起的巨噬细胞炎症相关蛋白和趋化因子的表达。综上所述，化合物ferulaldehyde可能通过直接抑制流感病毒复制和释放的过程以及影响免疫细胞的功能从而发挥抗流感的作用。关键词:ferulaldehyde;苯丙素；病毒复制周期；炎性相关蛋白；抗流感病毒中图分类号：R962D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.8.009刘丹*文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)8-136 4-0 8Study on the anti-influenza effect of ferulaldehyde in vitroZHOU Yan,SU Lu,WANG Yun,FAN Wei-tong,LI Hong-mei,LI Rong-tao,LIU DanFaculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,ChinaAbstract:To investigates the mechanism of ferulaldehyde,a phenylpropanoid compound isolated from Valeriana jatamansiJones and Paeoniae Rubra Radix,against influenza A virus.Through experiments such as dosing time point,immunofluores-cence,red blood cell agglutination,and neuraminidase activity detection,it was found that feruladehyde mainly affected thereplication and release of influenza virus,interfering with the life cycle of the virus,thereby exerting its anti-influenza virus ac-tivity.Molecular docking simulation confirmed that NP and NA might be the targets of the compound anti-influenza virus.Inaddition,the compound significantly inhibited the expression of macrophage inflammation-associated proteins iNOS and COX-2 and chemokine IP-10 induced by influenza virus.In conclusion,the compound ferulaldehyde might exert anti-influenzaeffects by directly inhibiting influenza virus replication and release and by affecting the function of immune cells.Key words:ferulaldehyde;phenylpropanoid;virus replication cycle;inflammation-associated proteins;anti-influenza virus流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,具有季节性和流行性的特点。流感病毒属于正粘病毒科,分为A型、B型、C 型和D 型四种类型。预防和治疗流感,疫苗和抗病毒药物仍是最有效的选择。就降低发病率和死亡率而言,疫苗被认为是控制流感病毒大流行最理想的方法2】。然而,流感疫苗只有在疫苗毒株与流行性病毒株相匹配时才有效3。流感最常见的临床治疗药物主要是NA 抑制剂,包括奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦，以及M2质子通道阻滞剂,包括金刚烷胺和金刚乙胺4。不幸的是，一些新出现的甲型流感病毒株，自然携带药收稿日期：2 0 2 2-12-15基金项目：国家自然科学基金（8 2 2 0 42 48）*通信作者 E-mail:物突变基因,导致对这些药物产生耐药性5。因此寻找新型抗流感药物刻不容缓。流感病毒感染机体后可触发各种免疫反应,引起调控细胞因子如肿瘤坏死因子-（T NF-）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)等的释放,而过度的免疫反应也会导致靶器官的炎性损伤,甚至影响脏器功能。据此,降低由流感病毒引起的炎性损伤也是治疗流感的一个主要方面6 苯丙素类是天然存在的一大类化合物,包括苯丙醇、苯丙醛、苯丙酸、香豆素、木质素等,现代药理研究发现这类化合物具有减轻氧化应激损伤、抗肿瘤以及抗流感病毒的作用。有研究证明，中药制剂接受日期:2 0 2 3-0 4-18板蓝根的抗流感的作用也与其中的苯丙素类成分密切相关。苯丙素类小分子化合物ferulaldehydeVol.35（FD E）7 广泛存在于甘草、神经脂草、洋甘菊等植物中，被报道具有抗氧化和抗炎的活性8 。我们从蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）和赤芍（PaeoniaeRubra Radix）中都分离获得了FDE结构，并首次发现了其显著的抗流感病毒的作用。蜘蛛香和赤芍作为我国传统中药,药用历史悠久，在流感治疗方面也有相关的记载，因此从中筛选有效化合物并研究其活性成分的作用机理，对其综合开发和利用具有重要的意义。因此本研究旨在探索 FDE对流感病毒生命过程的影响以及对流感病毒感染引起的炎症反应的作用。1材料与方法1.1 试剂与材料小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；磷酸奥司他韦（Oseltamivir）（安耐吉化学，批号：CK030008）;D M EM 高糖培养基（美国纽约Gibco公司，批号：8 12 2 554）；胎牛血清（FBS）（美国纽约Gib-co公司，批号：2 17 6 40 4）；胰蛋白酶（中国Solarbio公司,批号：510 T0419）；M T T（中国Solarbio公司，批号：530 R0515）；D A PI染料（中国Beyotime公司，批号：0 7 312 0 2 0 10 2 3）；神经氨酸酶测定试剂盒（中国Beyotime 公司，批号:0 7 142 0 2 110 12);CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒（美国Promega公司,批号：0 0 0 0 42 47 2 1）；放射免疫沉淀测定（RI-PA）裂解液（中国Beyotime公司，批号：2 2 30 8 515）；小鼠抗核蛋白（NP）单克隆抗体（英国Abcam公司，批号：GR3397701-3）；山羊抗小鼠IgG结合FITC荧光二抗（中杉金桥生物技术公司，批号：133449）；化合物FDE由本课题组通过各种色谱方法从蜘蛛香和赤芍中分离得到,并通过NMR和MS等波谱方法进行结构鉴定9,10 1.2仪器多功能读板仪SpectraMaxM2（美国MolecularDevices）；光学倒置显微镜CKX41（德国O-lympus）；CO,细胞培养箱3111（美国Thermofisher）;高速冷冻离心机1-14K（德国Sigma）；尼康激光共聚焦显微镜A1R/A1（日本Nikon)。1.3丝细胞毒性实验使用MTT法测FDE的细胞毒性。将FDE倍比稀释成5个浓度（6.2 5、12.5、2 5、50 和10 0 mol/L）,分别加人到已长成单层细胞的9 6 孔培养板中，设正常细胞对照组，每组设置3个复孔，于37、5%CO，培养箱中培养48 h,采用MTT法测定细胞周艳等：Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究噬斑实验MDCK细胞以310 个/孔的数量接种于12孔板中，培养2 4 h，直至长成单层细胞。用WSN（2 50 T CI D s o）感染2 h,用预冷的PBS清洗两遍，洗去未与细胞结合的病毒,加人含有不同浓度药物的无血清培养基，待其完全凝固后，倒置放人37，5%CO2培养箱。培养7 2 h后,4%多聚甲醛固定30min,去除琼脂糖覆盖层,用0.1%结晶紫染色。1.6力加药时间点实验MDCK细胞以310 个/孔接种于12 孔板中,培养2 4 h。用WSN(250 TCIDso）感染细胞,分别在0 2、0 5、0 8 和0 10 h（采用预防给药的方式，WSN和FDE共同作用前2 h,然后洗去WSN,加人FDE,02 h 为WSN和药物共同作用的2 h，下同)进行FDE(60 mol/L)处理。收集裂解细胞,分析NP含量变化14,到达给药时间后,将细胞用8 0L裂解液（含1%的PI和PMSF)裂解40 min，收集裂解液,加人2 0 L的5loadingbuffer变性10 15 min后,用10%SDS-PAGE进行凝胶电泳,后将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭，一抗、二抗孵育后通过化学发光显影并拍摄分析。1.7免疫荧光实验MDCK细胞以110 个/孔的数量接种于共聚焦皿中,培养2 4 h。WSN(2 50 T CI D s o）感染细胞,分别在 0 2、0 5、0 8 和 0 10 h 进行 FDE(60mol/L)处理。处理后细胞经4%多聚甲醛溶液固1365活度1,使用SpetraMaxM2检测波长为49 0 nm的吸光度。1.4体外抗流感病毒活性筛选取对数生长期的MDCK细胞以310 4个/孔接种于9 6 孔板中,待细胞的汇合率达到9 5%以上用PBS清洗细胞2 次，之后按照实验分组分别加药并于37、5%CO培养箱中培养,其中活性实验组的细胞加人不同浓度的待测样品与10 0 TCIDso病毒等比例混合后的溶液,阴性对照组细胞只加病毒,而不做任何处理的孔为对照组。待培养48 h后,用CellTiter-Glo?发光法细胞活力检测试剂盒检测其荧光值12 。病毒株A/WSN/33/2009 H1N1（WSN)的扩增方法：把病毒原液稀释后注射至培养10 11 d的鸡胚尿囊腔中,气室朝上置于35培养箱中孵育48 h。48 h 后用一次性无菌注射器缓慢吸出尿囊液,即为我们扩增的病毒，最后采用Reed-Muench法,计算细胞半数感染量TCID%。1.51366定10 min,0.1%Triton X-100打孔10 min 后，一抗孵育过夜,二抗孵育1h,DAPI 染核 10 min 后用共聚焦显微镜进行拍摄。1.8血凝素活性抑制试验根据病毒血凝滴度稀释病毒。将一系列浓度（6.2 5、12.5、2 5、50 和10 0 mol/L）的化合物与稀释后的病毒涡旋混匀后加人到V型9 6 孔板中,之后加入等体积1%的红细胞悬液，室温静置30 min，观察并记录V型9 6 孔板中红细胞的凝集效果。1.9神经氨酸酶抑制剂筛选实验通过神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测化合物对NA活性的抑制作用。将7 0 L NA缓冲液和10LNA溶液混合均匀,然后分别加人10 L梯度稀释的待测化合物,混合均匀后。加人10 L显色底物，混合均匀后室温震荡1min,37恒温培养箱中孵育30 min,使用多功能酶标仪检测激发波长32 2nm和发射波长450 nm的荧光信号。根据荧光值计算化合物对NA活性的抑制作用。1.10FELISA检测流感病毒感染巨噬细胞中 IP-10表达量巨噬细胞细胞以510 个/孔的数量接种于12孔板中,将15、30、6 0 mol/L三个浓度的FDE与100 TCIDso的WSN共同作用细胞2 4h,收集细胞上清，使用ELISA试剂盒检测上清溶液中IP-10趋化天然产物研究与开发因子的含量。2结果2.1FDE对流感病毒感染的MDCK细胞具有明显的保护作用研究发现,FDE（见图1）在6.2 5 10 0 mol/L浓度范围对WSN感染的MDCK细胞具有明显的保护作用（见图2 A、2 C），WSN感染MDCK细胞48 h，只加病毒的WSN组与未加病毒和FDE的对照组（c o n t r o l 1,C o n 1）相比,细胞发生明显病变,当用6.25100mol/L的FDE与WSN共同作用时,细胞病变率显著降低,其ECso为19.8 32.0 3mol/L,阳性药奥司他韦（oseltamivir,OST)ECso为6.8 50.12 mol/L,MTT 法证实该化合物在该浓度范围内对MDCK细胞活度几乎没有影响（见图2 B），CCso大于10 0 mo/L。同时，噬斑实验结果也证实了FDE的这一作用（见图2 D），WSN感染48 h后细胞大面积脱落形成较多空斑,未加WSN和FDE的对照组只有边缘有部分细胞脱落,FDE治疗组中空斑的数量随药物浓度的增加而减少。H3COCHOHO图1 Ferulaldehyde 的化学结构Fig.1 The chemical structure of ferulaldehydeAB150150100-500Vol.3510050-2-50ConIWSN6.2512.52550100FDE(mIol/L)CCon16.25 12.5FDE(mol/L)5010040XWSN(100TCIDso)FDE(mol/L)D+12.52550100WSN(100TCIDso)FDE(umol/L)Fig.2The anti-influenza virus activity and cytotoxicity of MDCK cells of FDE注：A：与Con1组比较，#P0.001；与WSN组比较，*P0.001;C:40：于40 倍光学倒置显微镜下拍摄。Note:A:Comparedwiththe Con 1 group,*p 0.001;Compared with the WSN group,*P 0.001;C:40 :Photographed under 40 optical inverted microscope.+12.5图2 FDE的抗流感病毒活性和对MDCK的细胞毒性+2550100Vol.352.2FDE对流感病毒生命周期的影响为了确定FDE作用于病毒感染受体细胞生命周期的哪一个阶段，我们设计了加药时间点实验，分别在WSN感染的0 2、0 5、0 8、0 10 h时间段A接种细胞Seed cells周艳等：Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究24h加药时间点设置Dosingtime point setting(h)1367（见图3A）进行FDE(60mol/L）处理，药物作用时间分别覆盖了病毒吸附、人核、复制和子代病毒释放过程。免疫印记实验结果（见图3B)显示,在该化合物作用的各时间段内，MDCK细胞内病毒NP蛋白oh2h0-20-50-80-105h8h10hBFDEDMSO细胞内NP表达量IntracellularNPexpressionGAPDHOSTDMSO0-2h0-5hFDE80-OST60-DMSO40-20-DMSO0-8hFDE0-10hDMSO0-2hCDAPIDMSO600-5hTRITC-NPMerge0-8hDAPIDMSO0-10hTRITC-NPMergeFDEFDE0-2h0-5hDMSODMSOFDEFDE0-8h图3FDE对流感病毒复制周期的影响Fig.3Effects of FDE on replication cycle of influenza virus in cells注:B:与DMSO组比较，*P0.01,*P0.001;C60：于6 0 倍激光共聚焦显微镜下拍摄。Note:B：Co m p a r e d w i t h t h e D M S0group,*P 0.01,*P 0.001;C:60 :Photographed under a 60 laser confocal microscope.0-10h1368的量与对照组（DMSO组：加人与FDE组等量WSN且加人了和FDE组所加药物溶剂等量DMSO的对照组,DMSO)相比都具有不同程度的减少,在0 8h内,FDE组与DMSO组和OST组相比 NP蛋白的含量降低最为显著。用2 50 TCIDso的WSN感染MDCK细胞,在同样给药时间处理条件下,通过免疫荧光法显示细胞内NP蛋白的定位从而追踪病毒的活动（见图3C），发现给药2 h后,DMSO组和FDE组的病毒均可以吸附到宿主细胞上,FDE组病毒量略少于DMSO组。给药5 h 和8 h后,病毒进细胞核进行复制,此时 FDE组细胞核内的病毒量明显少于DMSO组。而给药8 h 后,DMSO 组中病毒依然大量复制并开始从细胞核输出释放到细胞质中，此时FDE组中感染病毒的细胞数量和细胞中的病毒量明显要少,这也与免疫印迹结果相互印证,因此猜测该化合物可能抑制了流感病毒的复制。给药10 h后,病毒大量从胞质释放到细胞外,从免疫印迹的结果只能看出 FDE组的病毒量显著少于DMSO组,具体FDE对WSN的出胞是否有影响还需进一步研究。综上可知,FDE对WSN的进入过程略有影响，但主要还是抑制了其复制过程2.3FDE对流感病毒HA和NA的影响血凝素HA是流感病毒上的一种包膜蛋白,在天然产物研究与开发病毒人侵细胞中起关键作用。成熟的HA由两个亚基HA1 和HA2 组成。HA1 主要介导病毒与细胞表面唾液酸受体的结合,HA2主要介导膜融合和vRNP脱壳过程。血凝素活性抑制实验常用于确认药物的作用靶点是否为HA115。血凝素活性抑制试验结果如图所示（见图4A），未加入WSN的对照组（control 2,Con 2）,红细胞沉降于孔底呈点状，当加人以1:12 8 倍稀释的WSN后,红细胞发生凝集在孔底平铺呈网状，而当有FDE和WSN共同作用时，100 mol/L FDE处理能在一定程度上抑制红细胞的凝集,2 5、50 mol/LFDE有微弱的作用但并不显著。结果表明,该化合物在高浓度时（10 0 mol/L)可能会对流感病毒与宿主细胞的结合有一定的抑制作用,可能是通过与流感病毒的表面抗原 HA1 结合，抑制WSN的早期吸附过程，但浓度低于50mol/L其影响作用有限。甲型流感病毒的子代病毒颗粒从细胞表面出芽后,病毒表面的神经氨酸酶能使病毒本身从细胞表面脱落,能切割细胞表面与糖结合的 N-乙酰神经氨酸,释放子代病毒,完成感染周期16 。神经氨酸酶抑制实验结果显示（见图4B），化合物FDE具有一定的抑制神经氨酸酶作用,且抑制效果呈现剂量依赖关系。Vol.35ACon2WSN6.25FDEWSN+FDE2.4FDE能与NP和NA功能域结合为了进一步探索 FDE与流感病毒的相互作用,我们用AutoDock进行分子对接,模拟FDE与NP和NA蛋白质氨基酸残基之间的相互作用。FDE与NP蛋白分子对接结果显示（见图5A）,FD E能以氢键与NP蛋白342 位精氨酸（Arg342）、417 位天冬酰胺（Asn417)结合,以II-烷基作用（疏水作用力的一种）与419 位赖氨酸(Pro419)结合,这3个位点刚好处于核定位信号（Nuclear localization signal，NLS3）B索啤VN12.525图4FDE对流感病毒HA和NA的影响Fig.4Effect of FDE on influenza virus HA and NA域之中17 。另外有研究报道，le408、Pr o 410、Phe412、Va l 414和Pro419的疏水侧链位于核蛋白尾环中,该处的环结合腔可能是小分子药物的理想靶点,并且尾环的结构特征预计会干扰核蛋白的寡聚18 。因此,说明FDE可能通过与NP蛋白的结合干扰NP蛋白的功能从而抑制病毒的复制。FDE与NA蛋白分子对接结果显示（见图5B），FDE能以氢键与NA蛋白9 7 位丝氨酸（Ser97）、2 4780-604050100(mol/L)20-00320400残基和NP-NP结合区37 1 46 5残基的区204060FDE(umol/L)80100Vol.35位丝氨酸（Ser247）、2 9 5位天冬酰胺（Asn295）结合，以II-烷基作用(疏水作用力的一种)与10 6 位缬氨酸（Val106）、110 位异亮氨酸（Ile110)结合，以碳氢键与111位甘氨酸（Gly111）、112 位丝氨酸周艳等：Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究1369（Se r l 12)结合。已有研究报道NA蛋白的2 47 位的丝氨酸突变可能具有很高的抵抗流感病毒的作用19 。因此,说明FDE很可能通过与NA蛋白的结合干扰流感病毒的出胞。A3DArg342GLUA:484SERA:486ASP24212DPHEC420PROA:453GLYA485SERASNPROB:482C419租互作用interactions花德华力Vanderwaals常ttCoaventional hydrogen boad-烧基作用Pi-alkylNal106BNe110Sly111Ser112SERC112GLYC111Asn295Ser247Ser97ASN344ASN8-7487952DHOHB:622HOHD:96SR相互件用inderactionsR德fiVanderwaals不利tUafavonablebamp本xuz WaterhydrogenbondC110TYRVAL2-106C109HOHC336SERARG247C:108理uConventionailhiydrogenbondwutCarbon bydrogen bood1-综练作川Pi-alky图5FDE与NP(A)和NA(B)的分子对接结果Fig.5Molecular docking results of FDE with NP(A)and NA(B)2.5FDE能降低流感病毒感染的巨噬细胞的炎症相关蛋白和趋化因子的表达FDE曾被发现在LPS诱导的巨噬细胞炎症模型中抑制NO的产生2 0 。巨噬细胞在流感病毒感染后也会被激活并激发免疫反应,抵抗流感病毒的同时也可能造成机体的损伤。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶(COX-2）在炎症发生中是影响NO和PGE2生成的关键酶，我们检测发现FDE处1370理影响WSN感染的巨噬细胞中iNOS、CO X-2（见图6A)的表达,如图所示,与Con1（与结果2.1中对照设置方法一样，也为未加WSN和FDE）相比，WSN感染后巨噬细胞中iNOS、CO X-2 表达显著增加,而FDE处理剂量依赖性明显抑制细胞中的iNOS和A250-200-(%)uogae-d/SONiNOSCOX-2B-actionWSN(100TCIDs0)FDE(umol/L)天然产物研究与开发COX-2的表达。同时,我们还发现,FDE还影响趋化因子IP-10的分泌（见图6 B）。W SN感染引起的巨噬细胞中IP-10表达量的增加可以被FDE有效的抑制,提示FDE还可能影响进一步的炎性细胞的招募聚集。200-#(%)*150-150-*100-+1530Vol.35#100-*50-50-60Con1WSN153060B0.12(ots-0Fao)o1-dl0.08-*0ConIWSN153060#*水0.04-0.00Con1WSN15FDE(amol/L)图6 FDE治疗对流感病毒感染的巨噬细胞的iNOS、CO X-2 蛋白和趋化因子IP-10的影响Fig.6 Effect of FDE treatment on iNOS,COX-2 protein and chemokine IP-10 in influenza virus-infected macrophages注：与Con1组比较,#P0.001;与WSN 组比较，*P0.001。No t e:Co mp a r e d w i t h t h e Co n 1g r o u p,#P0.0 0 1;Co mp a r e d w i t h3讨论与结论以与 NP蛋白的活性位点结合,NP有可能是FDE的我们从蜘蛛香和赤芍两种药材中都分离获得了有效靶点,另外,我们通过神经氨酸酶活抑制实验发苯丙素类化合物FDE，含量分别为0.0 2%和现了FDE对NA活性的影响,分子对接实验也支持0.012%,尽管苯丙素类成分并不是蜘蛛香和赤芍的这一结果,提示FDE很可能还抑制了流感病毒的出主成分，但其在这两种中药的抗流感应用中很可能胞过程。此外,流感病毒本身并不是导致重症及致发挥了重要的作用,本研究就发现FDE具有显著的死的关键,病毒导致的肺组织损伤或更加严重的急抗流感病毒的作用。高浓度的 FDE 能够影响红细性呼吸窘迫综合征是流感病毒尤其是高致病性流感胞的凝集,提示其可能干扰流感病毒与受体细胞的病毒的高致病力和致死的主要原因 6 。我们检测结合,但其在低浓度时作用并不显著。进人宿主细发现FDE可减弱流感病毒感染的巨噬细胞中iN-胞的流感病毒借助宿主细胞的多种元件进行转录和OS、C O X-2 的表达,还抑制了病毒引起的巨噬细胞复制,病毒vRNP是流感病毒最基本的复制单位,是中 IP-10的表达量,提示FDE还可能影响进一步的由病毒 RNA 和碱性聚合酶1（PB1）、碱性聚合酶2炎性细胞的招募聚集,降低炎性反应。以上结果说（PB2）酸性聚合酶（PA）及核蛋白（NP）组成的复明FDE发挥抗流感病毒活性可能不止一个作用靶合体。vRNP通过运输进人细胞核,并通过引物依点，小分子化合物存在多个作用靶点有可能使其更赖的方式进行转录合成病毒mRNA,mRNA出核翻高效和更不易产生耐药现象，但也往往使其在体内译合成病毒蛋白 4。通过加药时间点实验我们发的作用也更为复杂甚至可能有更多的毒副作用。现FDE可以降低病毒NP蛋白的生成,很可能干预综上所述,本研究发现蜘蛛香和赤芍中的苯丙了病毒的复制过程,分子对接结果显示FDE确实可素FDE在体外具有抗流感病毒活性。通过探索3060the WSN group,*p 0.001.Vol.35FDE对流感病毒的生命周期的影响,发现其抗流感机制主要是干扰了流感病毒的复制和释放过程,流感病毒NP和NA蛋白很可能是它作用的靶点。同时,该化合物还能抑制由流感病毒引起的炎症相关蛋白和趋化因子的表达,从而缓解病毒感染引起的机体的免疫损伤。参考文献1Zhen RL,Chen MY,Chen DY,et al.Research progress ofpolysaccharidea against influenza virus J.Nat Prod ResDev（天然产物研究与开发）,2 0 2 2,34:16 7-17 2.2Yu DH,Wang LL,Wang Y.Recent advances in applicationof computer-aided drug design in anti-influenza A virus drugdiscovery J.Int J Mol Sci,2022,23:4738.3Syrjanen RK,Jokinen J,Ziegler T,et al.Effectiveness of pan-demic and seasonal influenza vaccines in preventing laborato-ry-confirmed influenza in adults:a clinical cohort study dur-ing epidemic seasons 2009-2010 and 2010-2011 in FinlandJ.PLoS One,2014,9:e108538.4Noshi T,Kitano M,Taniguchi K,et al.In vitro characteriza-tion of baloxavir acid,a first-in-class cap-dependent endonu-clease inhibitor of the influenza virus polymerase PA subunit J.Antiviral Res,2018,160:109-117.5Lin CY,Yang ZS,Wang WH,et al.The antiviral role of ga-lectins toward influenza A virus infection-an alternative strat-egy for influenza therapy J.Pharmaceuticals（Ba s e l),2021,14:490.6Wang YT,Zhou BX,Lu JG,et al.Inhibition of influenza virusvia a sesquiterpene fraction isolated from Laggera pterodontaby targeting the NF-kB and p38 pathways J.BMC Comple-ment Altern Med,2017,17:25.7Brllatz T,Kubo M,Takahashi S,et al.Metabolite profiling ofJavanese ginger Zingiber purpureum and identification of an-tiseizure metabolites via a low-cost open-source zebrafish bio-assay-guided isolation J.J Agric Food Chem,2020,68:7904-7915.8Liu JH,Wang SW,Tan WX,et al.Dual-screening of anti-in-flammatory and antioxidant active ingredients of shenxiangsuhe pill and its potential multi-target therapy for coronaryheart disease J.Biomed Pharmacother,2020,129:110283.9Fan WT,Liao CC,Zhou Y,et al.Chemical constituents of周艳等：Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究1371Paeoniae Radix Rubraand their anti-inflammatory activitiesJ.J Kunming Univ Sci Technol:Nat Sci(昆明理工大学学报：自科版）,2 0 2 2,47:117-12 2.10 Wang Y,Liu ZY,Zhou Y,et al.The chemical constituentsfrom Valeriana jatamansi and their anti-influenza virus andanti-inflammatory effects J.Phytochem Lett,2022,52:20-26.11 Wang S,Liu F,Zhu JY,et al.DNA repair genes ERCC1 andBRCA1 expression in non-small cell lung cancer chemothera-py drug resistance J.Med Sci Monit,2016,22:1999-2005.12 Jiang N,Quan LQ,Zhou Y,et al.Exploring the anti-influenzavirus activity of novel triptolide derivatives targeting nucleo-proteins J.Bioorg Chem,2022,129:106118.13 Karakus U,Crameri M,Lanz C,et al.Propagation and titra-tion of influenza viruses J.Methods Mol Biol,2018,1836:59-88.14 Yu MR,Si L,Wang YF,et al.Discovery of pentacyclic triter-penoids as potential entry inhibitors of influenza viruses J.J Med Chem,2014,57:10058-10071.15 Wu WJ,Li RC,Li XL,et al.Quercetin as an antiviral agentinhibits influenza A virus(IAV)entry J.Viruses,2015,8:6.16 Avila G,Cruz-Licea V,Rojas-Espinosa K,et al.Influenza AH1N1 virus 2009 synthetic hemagglutinin and neuraminidasepeptides for antibody detection J.Arch Med Res,2020,51:436-443.17 Bullido R,Gomez-Puertas P,Albo C,et al.Several protein re-gions contribute to determine the nuclear and cytoplasmic lo-calization of the influenza A virus nucleoprotein J.J GenVirol,2000,81:135-142.18 Das K,Aramini JM,Ma LC,et al.Structures of influenza Aproteins and insights into antiviral drug targets J.NatStruct Mol Biol,2010,17:530-538.19 Tran-Nguyen VK,Le MT,Tran TD,et al.Peramivir bindingaffinity with influenza A neuraminidase and research on itsmutations using an induced-fit docking approach J.SARQSAR Environ Res,2019,30:899-917.20 Jin CS,Jin M,Li R,et al.Isolation of a new natural kingisideaglucone derivative and other anti-inflammatory constituentsfrom Syringa reticulata J.Nat Prod Res,2020,34:518-524.