HCG22靶向miR-17-3p对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响.pdf

靶向 对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响 通讯作者，：四川遂宁 遂宁市中心医院口腔医学中心尹 江，唐 平，张 慧，杨 森【摘 要】目的 探讨 基因复合体（）通过调控微小（）对口腔鳞癌（）细胞生物学行为的影响。方法 通过实时定量（）检测 组织和细胞系中 和 的表达。双荧光素酶报告基因实验检测 和 之间的相互作用。在 细胞 中转染 过表达载体和 模拟物，将细胞分为 组（空白）、组（过表达）、组（过表达）和 组（过表达 和）。、划痕愈合和 法分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过 和 检测基质金属蛋白酶（）和 的表达。结果 组织中 表达下调，而 表达上调，且两者表达呈负相关（，）。与 细胞相比，、和 细胞中 低表达，而 高表达（）。双荧光素酶报告基因实验证实 能够与 靶向作用。组 细胞的 表达水平低于 组（）。与 组比较，组 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制，而 组 细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强。挽救实验显示，可抵消 诱导 细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。组的 和 水平降低（），而 组的 和 水平上调（）。与 组相比，组的 和 水平均升高（）。结论 可能通过靶向抑制 表达调控 细胞的增殖、迁移和侵袭过程。轴在 中可能存在负反馈回路。【关键词】口腔鳞癌；基因复合体；微小；迁移；侵袭中图分类号：文献标识码：文章编号：（），：，：【】（）（）（），（），（），（）（），（）（），（，），（），临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，（）（）（），【】；口 腔 鳞 状 细 胞 癌（，）是头颈部最常见的鳞状细胞癌之一，死亡率很高。的发病机制与饮酒、吸烟等因素有关，但具体发病机制尚不清楚，。虽然 手 术 治 疗 有 效，但 是 对 于 患者的总体生存情况仍然不容乐观。因此，揭示 病变分子机制对探索新的治疗策略至关重要。长链非编码（，）是非编码 家族亚群成员，不能编码蛋白质。最近，被证实参与不同的细胞进程，如细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、耐药等。此外，一系列研究报道了 在包括 在内的多种癌症发生发展中的重要作用。基 因 复 合 体 （，）作为一种肿瘤抑制，已经被发现在某些类型肿瘤中表达异常缺失，并参与调控肿瘤进展。例如，等研究表示 通过破坏 稳定性调控 的表达，介导 效应抑制，对膀胱癌细胞的增殖、迁移和上皮间充质转化产生负面影响。另外，与食管鳞状细胞癌患者的分化程度和临床 分期存在明显相关性，是食管鳞状细胞癌的良好预后指标；同时作为细胞迁移抑制剂，与 和 相互作用，抑制肿瘤进展。值得注意的是，有学者通过转录组测序筛选发现 在 中表达较健康口腔黏膜异常下调。还被发现作为 患者的预后生物标志物具有一定价值。然而，在 中的具体功能尚不清楚。最近 研 究 数 据 表 明，微 小 （，）能够与 通过内源性竞争（，）机 制 参 与 发 展。现 有 研 究 显 示 被、等 海绵化，加速黑素瘤、结 直 肠 癌 进 展。中 与 的相互作用关系尚不清楚。因此，本研究分析 和 在 细胞中表达及其对细胞生物学行为的影响，探讨调控的潜在生物学机制，现将研究结果报道如下。材料与方法 组织、细胞和主要试剂 对 组织和癌旁组织为本院 年 月至 年 月外科手术切除（所有患者均签署知情同意且经本院伦理委员会批准），人 细胞（、）和人正常口腔角质细胞 购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，购自美国 公司，试剂购自美国 公司，培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国 公司，和 检测试剂盒购自南京知了生物科技有限公司，荧光定量 （）试 剂 盒 和反转录试剂盒 合成试剂盒购自碧云天生物技术公司，荧光素酶报告质粒 和双荧光报告基因检测试剂盒购自美国 公司，兔源多克隆基质金属蛋白酶（，）、和 一抗及 标记的羊抗兔二抗购自美国 公司，模拟物（）、空载 、过表 达 载 体 和 引物购自通用生物（安徽）股份有限公司。细胞培养将含有 胎牛血清和 双抗的完全培养基，放置于恒温培养箱中培养细胞，根据细胞生长状态和需要常规换液。按照 操 作 说 明 书 将 、和 转 染 细 胞，分 成 组、组、组 和 组。细胞增殖实验 转染第、向每孔细胞加入浓度为 工作溶液，孵育 后终止反应。酶标仪测定各孔细胞在 波长下的吸光度值。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，细胞迁移实验 将细胞按照 的密度接种至 孔板，每组设置 个重复。使用枪头垂直于孔板划出光滑划痕，显微镜拍照记录划痕宽度，记为 结果。细胞中添加不含血清的培养基继续培养 ，显微镜记录划痕宽度，记为 结果。细胞侵袭实验 将 细胞按照 孔密度接种至 小室上室，下室加入 含胎牛血清的培养基。孵育 ，利用 多聚甲醛固定 ，结晶紫染液工作液染色 。倒置显微镜下观察并拍照。总 提取和 试剂提取细胞总，挑选质量较好的 反转录合成，以此为模板使用 实时系统进行。作为、和 表达的内参，作为 表达的内参。上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：；上游引物：，下 游 引 物：；上游引物：，下游引物：；上游引物：，下 游 引 物：；上 游 引 物：，下 游 引 物：。双荧光素酶报告基因实验 扩增带有 与 结合种子序列，分别构建野生型报告质粒 和突变型质粒，与 和阴性对照 共同转染，后检测细胞荧光素酶的活性。转染处理 后收集细胞，蛋白裂解液 提取细胞总蛋白，法测量蛋白浓度。按照每孔上样 ，电泳分离后湿转法转移至 膜，封闭 后 过夜孵育一抗（稀释比例为 ），在室温条件下，孵育二抗 （稀释比例为 ），加入 显色液，避光环境下用化学发光仪进行曝光拍照。结果以目标条带与 条带光密度值的比值表示。统计学方法采用 版统计学软件进行统计分析。计量资料表示为均数标准误表示，两组均数分析采用 检验，多组均数分析采用单因素方差分析。以 为差异有统计学意义。结 果 组织的 和 表达情况 在 组织中的相对表达水平低于癌旁组织（，），在 组织中表达量高于癌旁组织（，），组织中 和 的相对表达量呈负相关关系（，）。见图。：；：；：线性相关图；图 和 在 组织的表达情况 细胞的 和 表达情况 在 细胞（）、（）、（）和（）中的相对表达水平不同程度地低于 细胞（）；而 在 细 胞 （）、（）、（）和（）中的相对表达水平不同程度地高于 细胞（），上述差异均有统计学意义（）。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：；：；与 细胞比较，图 和 在 细胞的表达情况 对 的靶向调控作用在线 网站预测显示 和 之间具有互补结合位点。抑制野生型 报告载体转染后细胞的荧光素酶活性（），而不影响突变型 报告载体转染后细胞的荧光素酶活性（）。见图。转染效率验证 组 细胞的 相对表达水平高于 组（，），组（）和 组 细胞的 相 对 表 达 水 平 差 异 无 统 计 学 意 义（）；组 细胞的 相对表达水平低于 组（，），组（）和 组 细胞的 相对表达水平差异无统计学意义（）。组 细胞的 相对表达水平高于 组（，），组（）和 组 细胞的 相对表达水平差异无统计学意义（）。见图。：互补结合位点；：相对荧光强度；与其余组比较，图 靶向调控 的验证：；、：；与其余两组比较，图 和 的转染效率 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，通过 对 细胞生物学行为的影响与 组相比，组 细胞活力、划痕愈合率和穿膜数量减少（），组 细胞活力、划痕愈合率和穿膜数量增多（）；组 细胞活力、划痕愈合率和穿膜数量多于 组（），与 组 细胞的差异无统计学意义（）。见图。：增殖曲线；：划痕愈合率；：穿膜细胞数；：划痕实验记录图（）；：小室实验记录图（）；图 各组 细胞增殖和迁移侵袭能力的评估结果 通过 对 细胞相关因子表达 组 细胞 和 的 和蛋白表达水平低于 组（），组 细胞 和 的 和蛋白表达水平高于 组（）；组 细胞 和 的 和蛋白表达水平高于 组（），与 组差异无统计学意义（）。见图。讨 论越来越多的证据表明，在人类疾病进展以及各种癌症的启动和发展中发挥着重要作用。失调的 作为“肿瘤抑制因子”或“致癌因子”参与 细胞的增殖、分化、侵袭和转移等生物学过程。例如，通过海绵化 并调控 来抑制 细胞的增殖和侵袭。改变 信号活性来促进 进展。沉默 可直接上调 引起下游靶标 表达抑制，进而缓解 的恶性表型。口腔黏膜下纤维化作为一种癌前病变，经历一系列组织病理学发展最终可进展为侵袭性，有学者发现 在口腔黏膜下纤维化组织中弱表达。另外，等在 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：水平；：水平；：记录图；：蛋白水平；图 各组 细胞的 和 水平鉴定 候选生物标志物时发现 表达缺失者的生存期较高表达者明显缩短，且 组织中 表达明显低于健康组织。根据先前结果，我们推断 可能参与 恶性发展。本研究发现，在 组织中表达水平明显低于癌旁组织，同时在不同 细胞系中均呈现表达缺失状态，这与 等的检测结果一致。为探究 对 恶性表型的影响，我们在 细胞 转 染 过 表 达 载 体，检 测 发 现 增 强 表达明显抑制 细胞的增殖、迁移和侵袭。同时细胞中 和 的表达水平下降，两者属于 家族成员，可以通过降解细胞外基质、促进血管生成、加速肿瘤侵袭转移进而加深肿瘤细胞恶性化程度。以上结果表明 在 中发挥抑癌基因作用，但是 调控 进展的可能作用机制尚不清楚。目前已知 通过几种不同机制在肿瘤的病理生理过程中发挥调节作用，包括表观遗传修饰、与蛋白质相互作用或 相互作用。在 相互作用中，经常被报道与 结合，而后者是另一类短调控 小分子，长度为 。与 功能相似，参与各种疾病生理过程，在多种恶性肿瘤中发挥致癌或抑癌作用。我们通过在线生物信息学软件预测发现 和 存在互补结合序列，双荧光素酶报告基因检测实验证实了二者的靶向关系。同时，在 组织和细胞系中表达异常上调，并与 的表达呈现明显负相关性。为明确 是否能够通过靶向 影响 细胞生物学过程，我们在 细胞中转染 过表达载体基础上转染，观察 细胞增殖、迁移和侵袭的变化。结果显示，上调 表达明显增强了 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时细胞中 和 的表达水平增加。来源于 簇，在许多人类疾病生理过程中有不同作用，参与心肺的发育和重塑、心脏成纤维细胞衰老和脊髓神经祖细胞形成等。失调的 在肿瘤发生过程中发挥致癌作用。等报道 在多发性骨髓瘤组织中大量表达，并抑制 同时下调 表达，促进多发性骨髓瘤细胞增殖。在结肠癌组织中大量表达，并靶向抑制 表达促进结肠癌细胞增殖和存活。在另一项研究中，等发现 能够通过 机制与 竞争性结合，引起下游靶基因 表达激活，参与葡萄膜黑色素瘤的发生发展。本研究中，我们还发现上调 表达能够逆转 过表达对 细胞增殖、迁 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，移和侵袭过程的抑制并一定程度上调了 和 的水平，表明 能够通过 抑制 细胞增殖、迁移和侵袭，缓解 恶性发展，发挥积极保护性作用。综上所述，本研究通过体外细胞实验证实过表达 可能通过靶向 抑制 细胞的增殖、迁移与侵袭，作为 发展的负调控因子来影响 进程。今后我们将着眼于探究 调控 下游肿瘤相关靶基因及信号通路。参考文献 ，：，：，：，（）：，：，：，（），：，：，：，：，：，：，（）（），：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：收稿日期：；修回日期：临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，