半夏泻心汤调控TLRs_NF-κB_MyD88信号通路干预溃疡性结肠炎的实验研究.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究半夏泻心汤调控TLRs/NF-B/MyD88信号通路干预溃疡性结肠炎的实验研究李室箕1，张林1，2，牟永旭1，朱烔依1，罗文晔1，王杰1，谢田炜1，陈兰秋1（1.辽宁中医药大学 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学中医学院 沈阳 110847）摘要：目的观察半夏泻心汤对溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）大鼠肠道粘膜中的Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）/核转录因子B（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-B）/髓样分化蛋白88（Myeloid differentiation factor SS，MyD88）信号通路及抑制因子基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）MMP-1、MMP-2 表达影响，并探讨其作用机制。方法建立葡聚糖硫酸钠盐（Dextran sulphate sodium salt，DSS）诱导产生 UC 模型，根据随机数字表法，将 35只无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）级大鼠进行分组，分为正常组、模型组、低浓度给药组（0.473 gmL-1）、中浓度给药组（0.945 gmL-1）和高浓度给药组（1.890 gmL-1）。除正常组外，其余4组大鼠连续10天使用2.5%浓度的葡聚糖硫酸钠盐溶液每天2 mL进行灌胃，造模成功后，连续给药1周，观察大鼠疾病活动指数（Disease activity index，DAI）变化；采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色法，确认结肠组织病变损伤程度；同时应用蛋白质免疫印迹试验（Western blot）法，检测TLR4、NF-B、MyD88蛋白在各组大鼠结肠中的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）技术则测定了大鼠结肠黏膜TLR4、NF-B、IB-（人核因子B抑制蛋白，NF-B inhibitor）、MMP-1、MMP-2的mRNA的表达。结果造模后大鼠体质量、食欲、被毛、活动度、尿量较造模前均出现不同程度的下降，同时部分大鼠出现腹泻、便血的症状。模型组与正常组相比，大鼠结肠组织中TLR4、NF-B、MyD88蛋白的表达，及TLR4、NF-B、IB-、MMP-1、MMP-2的mRNA表达均显著升高（P15%隐血/血便隐血阴性隐血阳性肉眼血便DAI得分012341134 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究症状，则提示造模成功。2.3给药方法造模成功后，低浓度给药组、中浓度给药组和高浓度给药组大鼠分别给予0.473 gmL-1、0.945 gmL-1、1.890 gmL-1 3种浓度半夏泻心汤灌胃，每次2 mL，每天1次，连续1周。造模组与正常组大鼠灌胃等量生理盐水，每天1次，连续1周。2.4取材方法半夏泻心汤灌胃给药1周后处死全部大鼠，每只大鼠取5 mL动脉血液样本以及结肠组织，对血液样本进行离心备用。将每只大鼠结肠组织分为3部分，分组标记清晰后于-20冰箱保存备用。2.5疾病活动指数（DAI）评分DAI=（体质量下降评分+大便性状评分+大便隐血评分）/3。DAI评分标准见表1。2.6苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色观察结肠组织病理将4%多聚甲醛固定的大鼠结肠组织，常规脱水、包埋后，切成5 m左右的切片。使用苏木素染色液染3-5 min，然后流水冲洗，分色液进行分化，再用流水冲洗并返蓝切片。放入乙醇中梯度脱水，伊红染色5 min，最后使用中性树胶封片，显微镜下观察。2.7蛋白质免疫印迹实验（Western blot）法检测各组大鼠结肠组织TLR4、NF-B、MyD88蛋白表达情况首先，每组按照60 g进行电泳，浓缩胶120 V电泳，分离胶80 V电泳，然后在100 V恒压下湿转。转膜后，将其置于5%脱脂牛奶中，室温下封闭1 h。然后一抗在4下孵育过夜，洗膜，二抗孵育，二抗稀释比例为1:5000，洗膜，最后曝光灰度值分析。2.8 实 时 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测大鼠结肠黏膜 TLR4、NF-B、IB-、MMP-1、MMP-2 mRNA表达情况用 TRIzol试剂，按照试剂盒操作步骤，处理各组结肠组织，提取总 RNA，逆转录成 cDNA，然后设定PCR 反应条件，用 SYBR Green Mater Mix 试剂重复检测3次待测基因的mRNA水平（引物序列见表2）。用CT法对Real-time PCR结果进行相对定量分析。2.9统计学方法本研究采用 Prism 统计软件对数据进行分析处理，计量资料以均值标准差（x s）表示，单因素方差分析多组间比较，最小显著性差异法（Least-Significant Difference，LSD）检验组间两两比较。3 结果 3.1一般体征造模成功后，大鼠饮食饮水明显减少、体质量显著下降、皮毛凌乱、颜色暗淡、精神萎靡等，且出现腹泻、便血的症状；给药2-3天开始，低浓度给药组、中浓度给药组、高浓度给药组较模型组体质量回升、食欲增强、被毛光亮湿润、活动度加强、尿量增加，且腹泻、便血情况有所改善；给药7天后，大鼠状态虽与正常仍有部分差异，但较模型组有明显改善。3.2半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型大鼠的DAI评分与正常组相比，模型组 DAI 评分明显增加（P0.01），大鼠出现体质量下降、腹泻、便血等症状；与模型组相比，低浓度给药组、中浓度给药组、高浓度给药组DAI评分要低于模型组（P0.01），大鼠体质量下降、腹泻、便血等症状有所改善。与中浓度给药组相比，低、高浓度给药组DAI评分虽有升高趋势，但无明显表2引物序列基因TLR4MYD88IB-MMP-1MMP-2GAPDH引物序列上游：5-AGAGCATAGAAGCCCATGTCA-3 下游：5-TGCTAGTCCTCCTTGCTGAT-3上游：5-AAGTGATCCGCCAGGTGAAG-3 下游：5-GCAATTTCTGGCTGGTTGGT-3上游：5-TGGACGACCGCCACGACAGCGGCCTGGACT-3 下游：5-GCTGGCTGTGATCCTGAGCTCCGAGACTTT-3上游：5-AAAATTACACGCCAGATTTGCC-3 下游：5-GGTGTGACATTACTCCAGAGTTG-3上游：5-GCTGATACTGACACTGGTACTG-3 下游：5-CAATCTTTTCTGGGAGCTC-3上游：5-CACCAACTGCTTAGCACCAAC-3 下游：5-TCTTCTGGGTACCAGTGACG-3表3各组大鼠DAI评分数值组别正常组模型组低浓度组中浓度组高浓度组DAI分值02.72 0.25*2.06 0.251.72 0.392.11 0.27注：与正常组相比，*P 0.01；与模型组相比，P 0.05）。见表3。3.3半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠形态的影响HE染色结果显示，正常组大鼠结肠粘膜完好，黏膜下层无明显炎性浸润；模型组大鼠结肠粘膜不完整，黏膜下层有大量炎细胞浸润，细胞有脱落坏死；低浓度给药组、中浓度给药组、高浓度给药组大鼠结肠组织部分区域粘膜腺体肠上皮有化生现象。见图1。3.4半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织TLR4、NF-B、MyD88蛋白表达的影响与正常组相比，模型组大鼠结肠组织中 TLR4、NF-B、MyD88蛋白表达显著升高（P0.01）；与模型组相比，低浓度给药组、中浓度给药组大鼠结肠组织中TLR4蛋白表达显著降低（P0.01），高浓度给药组大鼠结肠组织中TLR4蛋白表达则降低（P0.05）；低浓度给药组、中浓度给药组、高浓度给药组大鼠结肠组织中NF-B蛋白表达降低（P0.01）；中浓度给药组大鼠结肠组织中MyD88蛋白表达降低（P0.05）；与中浓度给药组相比，低浓度给药组中大鼠结肠组织中TLR4蛋白表达相对增加（P0.05）、NF-B 蛋白表达相对降低（P0.05）、MyD88蛋白表达升高（P0.01）；高浓度给药组大鼠结肠组织中TLR4蛋白表达明显升高（P 0.01）、NF-B蛋白表达略降低（P0.05）。结果见表4。3.5半夏泻心汤对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织中TLR4、NF-B、IB-、MMP-1、MMP-2 mRNA表达的影响与正常组相比，模型组大鼠结肠组织中 TLR4、NF-B、IB-、MMP-1、MMP-2 表达显著升高（P 0.01）；与模型组相比，低浓度给药组中大鼠结肠组织中TLR4、IB-、MMP-1表达显著降低（P0.01），NF-B、MMP-2表达降低（P0.05）；中浓度给药组中大鼠结肠组织中 TLR4、IB-、MMP-2表达显著降低（P 0.01），NF-B、MMP-1表达降低（P0.05）；高浓度给药组中大鼠结肠组织中 TLR4、NF-B、IB-、MMP-1、MMP-2表达显著降低（P0.05）、IB-、MMP-2表达相对升高，但无明显差异（P0.05）、MMP-1表达明显降低（P0.01）；高浓度给药组MMP-1表达相表5各组大鼠结肠组织中TLR4、NF-B、IB-、MMP-1、MMP-2表达变化组别正常组模型组低浓度给药组中浓度给药组高浓度给药组TLR41.000.005.650.52*2.980.363.560.543.510.28NF-B1.000.002.440.39*1.470.101.490.191.440.42IB-1.000.005.430.41*2.750.242.070.331.870.18MMP11.000.003.340.10*1.800.31#2.810.111.820.27#MMP-21.000.006.580.84*4.070.773.660.352.771.10注：与正常组相比，*P0.01；与模型组相比，P0.05，P0.01；与中浓度给药组相比，#P0.01。图1各组大鼠结肠病理形态学改变（200）注：Z：正常组；M：模型组；LL：低浓度给药组；ML：中浓度给药组；HL：高浓度给药组。表4各组大鼠结肠组织中TLR4、NF-B、MyD88蛋白表达的变化组别正常组模型组低浓度给药组中浓度给药组高浓度给药组TLR40.830.071.150.05*0.800.04#0.630.071.020.06#NF-B0.890.061.090.04*0.660.05#0.820.030.720.05#MyD880.760.060.970.04*0.980.03#0.810.060.960.04注：与正常组相比，*P0.01；与模型组相比，P0.05，P0.01；与中浓度给药组相比，#P0.05，#P0.01。1136 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究对降低（P0.05）。结果见表5。4 讨论 溃疡性结肠炎也被称为“慢性非特异性溃疡性结肠炎”13，根据我国2018年修订的炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见14，属于炎症性肠病范畴。现今其病因和发病机制未明确，多数学者认为该病的发生和遗传、免疫调节、感染以及环境等因素有关。UC病变常呈现连续、弥漫、非节段性，可主要累及直肠、结肠粘膜的不同部位，临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重，并且伴随着不同程度的全身症状等1。因为近年来该病发病率明显增加，病情易反复发作，严重急性患者甚至可能危及性命等原因，被公认是现代难治性疾病。目前UC的治疗主要是西医药物治疗，药物以糖皮质激素（Glucocorticoids，GCS）、氨基水杨酸制剂主要为5-氨基水杨酸制剂（5-ASA）、柳氮磺胺吡啶（Sulfasalazine，SASP）、免疫抑制剂如硫唑嘌呤（Azathioprine，Aza）、环孢素（Cyclosporine A，CsA）等、生物治疗剂（如TNF-单克隆抗体）等为主。传统的中医药治疗方法往往侧重于中药口服、灌肠治疗或两者相结合、同时还可以配合针灸治疗，以其表现出治疗效果好、能够有效解决UC治疗方法的瓶颈且毒副作用小的优点，得到了越来越多人的重视15，针对UC的中西医结合治疗也成为热门研究课题。根据UC的临床表现与病情特点，在2017年制定的“溃疡性结肠炎中医诊疗共识意见”1，将其归属中医“久痢”范畴，主要病位在大肠，同脾胃关系密切，久病有可能影响肝肾16，其中医病因是在素体脾气虚弱的基础之上，受到感受外邪、饮食不节、情志失调等诱因影响而发病，多为热、寒、湿等多种邪气互结17，导致脾不升清，胃不降浊，湿浊稽留大肠，郁而化热，湿热内蕴，气血瘀滞，壅而为病。病理性质多为本虚标实证18，在临床上多见寒热虚实错杂之证。半夏泻心汤出自东汉医学家张仲景所著的 伤寒杂病论，首载于 伤寒论19第149条“伤寒五、六日，呕而发热，柴胡汤证具，而以他药下之，心下但满而不痛者，此为痞”。金匮要略20又补充其主治为：“呕而肠鸣，心下痞者”。本方原本用于治疗小柴胡汤证误用泻下，中阳损，寒气生，少阳邪热乘虚内入，以致寒热邪气互结，气机升降失常而成心下痞。其组成由小柴胡汤去柴胡、生姜，加黄连、干姜而成，方中以半夏为君药，配伍黄芩、黄连、炙甘草、干姜、人参、大枣，寒热并用以和其阴阳，辛开苦降以复其升降，补泻兼施以顾其虚实，适用于寒热错杂之痞证，现代临床上广泛应用于脾胃消化系统中多种寒热互结证的治疗21，越来越多的实验及临床研究显示9,22-25，半夏泻心汤及其加减方在治疗UC方面有一定的优势，其作用机制可能包括：调节胃肠道分泌和运动、抑制炎症性腹泻、保护肠道黏膜、减少黏膜炎性细胞浸润、促进溃疡愈合，本实验研究结果与之相似。Toll样受体（TLRs）是人体内免疫识别受体之一，能够参与配体识别，诱导特异性抗微生物免疫；也能结合病原相关分子，从而转导信号26。髓样分化蛋白88（MyD88）是一种胞质可溶性信息传导蛋白，是Toll样受体家族的通用转接蛋白27。NF-B是一种控制转录的蛋白质复合物，能够调节感染免疫应答，其异常调控与常常炎症和自身免疫性疾病等有关28。近年来，国内外均有研究29-32认为，肠道黏膜中的TLRs通过影响髓样分化因子启动MyD88信号传导通路，激活NF-B，释放炎症因子，最终造成溃疡性结肠炎的发生。相关研究还表明，阻断此信号通路中的某些环节能有效降低 UC 的炎性反应24,33-34。基质金属蛋白酶（MMPs），是一类含有二价锌离子，且蛋白结构相似的酶活性中心，其编码基因与胶原酶基因同源，是机体内参与细胞外基质降解与重建的重要的蛋白分解酶之一35，常被用作评估UC病情严重程度的指标。有关研究显示36，MMPs与黏膜损伤密切相关，其产生过多和活性抑制失败，可能是溃疡形成的主要原因。在病变结肠组织中，MMP-1表达增加与组织损伤程度有关，MMP-2存在于黏膜下层细胞外基质37-38。本次实验研究表明，与正常组相比，模型组大鼠出现体质量显著下降、皮毛凌乱、精神萎靡、腹泻、便血等症状，DAI评分升高，大鼠结肠粘膜破损，有大量炎细胞浸润，细胞有脱落坏死，结肠组织中TLR4、NF-B、MyD88蛋白及炎症因子MMP-1、MMP-2表达均显著升高，与造模标准相同6,39，证明造模成功。与模型组相比，给药组大鼠体质量回升、食欲增强、腹泻明显改善，出现黑便情况减少，结肠组织部分区域粘膜腺体肠上皮有化生现象，符合恢复状态，大鼠结肠黏膜组织 TLR4、NF-B、MyD88蛋白及炎症因子 MMP-1、MMP-2的表达均有不同程度的降低，提示半夏泻心汤1137 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 对UC具有防治作用。半夏泻心汤实验组之间，DAI评分无明显差别，相较于中浓度给药组，低浓度给药组中大鼠结肠组织中TLR4蛋白、MyD88蛋白表达相对增加，NF-B 蛋白、MMP-1 表达相对降低；而 TLR4、NF-B、IB-、MMP-2表达虽有所不同，但无明显差异；高浓度给药组中大鼠结肠组织中TLR4蛋白表达明显升高，NF-B蛋白、MMP-1表达相对降低；MyD88蛋白、TLR4、NF-B、IB-、MMP-2表达虽有降低趋势，但无明显差异。综合看来，3组之间无明显变化，作用效果和途径基本一致。揭示了半夏泻心汤对溃疡性结肠炎防治作用的机制，很可能是通过抑制MMP-1、MMP-2以及 TLR/MyD88/NF-B信号通路的表达来达到的抗炎效果，同时保护并修复肠道粘膜。本项目以中医“寒热平调，辛开苦降”治法为指导，以结肠粘膜的异常变化作为切入点，从结肠粘膜组织相关基质金属蛋白酶及与免疫调控相关的细胞通路水平上，探索半夏泻心汤对溃疡性结肠炎的治疗作用及其作用机制，旨在解析“寒热平调，辛开苦降”治法治疗UC的现代生物学内涵，为临床推广半夏泻心汤治疗UC提供了实验依据。参考文献 21中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组.炎症性肠病外科治疗专家共识.中华炎性肠病杂志,2020,4(3):180-199.2马清林,杜丽东,臧凯宏,等.溃疡性结肠炎研究进展概述.医药论坛杂志,2020,41(1):175-177.3张声生,沈洪,郑凯,等.溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见(2017).中华中医药杂志,2017,32(8):3585-3589.4Gao F,Liu J,Lu M,et al.Nile tilapia Toll-like receptor 7 subfamily:Intracellular TLRs that recruit MyD88 as an adaptor and activate the NF-B pathway in the immune response.Dev Comp Immunol,2021,125:104173.5谢晶日,徐婷,李贺薇.溃疡性结肠炎的中医辨治研究进展.中医药信息,2014,31(4):191-192.6刘明明,李爱玲,修瑞娟.基质金属蛋白酶的研究进展.中国病理生理杂志,2018,34(10):1914-1920.7黄继汉,黄晓晖,陈志扬,等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学,2004,9(9):1069-1072.8崔国宁,刘喜平,董俊刚,等.溃疡性结肠炎模型建立方法研究进展.今日药学,2018,28(4):280-284.9Hu Y,Ye Z,Wu M Q,et al.The communication between intestinal microbiota and ulcerative colitis:An exploration of pathogenesis,animal models,and potential therapeutic 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Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China)Abstract:ObjectiveThis study was conducted to investigate the effects of Banxia Xiexin Decoction on the expression of TLRs/NF-B/myD88 signaling pathway and the inhibitory factors MMP-1 and MMP-2 in the intestinal mucosa of rats with ulcerative colitis(UC),and to explore the mechanisms of their effects.MethodsThe UC model induced by dextran sulphate sodium salt(DSS)was established and 35 Specific pathogen Free(SPF)rats were divided into normal group,model group,low concentration group(0.473 gmL-1),medium concentration group(0.945 gmL-1)and high concentration group(1.890 gmL-1)according to random number table method.Except for normal group,rats in the other four groups were given 2.5%DSS solution 2 mL/day for 10 consecutive days.After modeling,rats were given DSS solution 2 mL/day for one week,and DAI changes were observed.HE staining was used to confirm the extent of lesion damage to the colonic tissue by observation.Meanwhile,the expression of TLR4,NF-B and MyD88 in the colon of each group of rats was also detected by Western Blot.The mRNA expression of TLR4,NF-B,IB-,MMP-1 and MMP-2 in rat colon mucosa was detected by Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsAfter modeling,the weight,appetite,coat,activity and urine volume of the rats decreased to varying degrees compared with before modeling,and some of the rats showed symptoms of diarrhea and hematoia.The expression of TLR4,NF-B and MyD88 protein,as well as mRNA expression of TLR4,NF-B,IB-,MMP-1 and MMP-2 were significantly higher in the model group compared with the normal group(P0.01).After treatment with Banxia Xiexin Decoction,weight loss,diarrhea,hematochezia and other symptoms of UC rats were significantly alleviated.The expressions of TLR4,NF-B and MyD88 proteins in the colonic mucosa of rats in the low,medium and high doses of Banxia Xiexin Decoction were decreased to varying degrees compared to the model group.The levels of MMP-1 and MMP-2 have also declined.ConclusionsBanxia Xiexin Decoction may affect the expression of TLRs/NF-B/MyD88 signaling pathway and related factors,improve the degree of colonic injury in rats with ulcerative colitis,and prevent and treat UC.Keywords:Banxia Xiexin decoction,Ulcerative colitis,TLRs/NF-B/MyD88 signaling pathway,Toll-like receptors,Matrix metalloproteinases（责任编辑：李青）1139