不同复苏方式对冻存外泌体的影响.pdf

2023 年8 月 第 44 卷 第 4 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Aug.2023Vol.44 No.4基金项目:国家自然科学基金资助项目(82274447),北京市自然科学基金资助项目(7212172),北京市高层次公共卫生技术人才建设资助项目(2022-2-024),北京市属医学科研院所公益发展改革试点项目(2019-6,2021-10)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(82274447),Natural Science Foundation of Beijing(7212172),Special Project for the Construction of High-Level Health Technical Personnel in Beijing Health System(2022-2-024),Public Welfare Development and Reform Pilot Project of Beijing Municipal Medical Research Institutes(2019-6,2021-10).Corresponding author,E-mail:xeh001 ;liweihua #邢恩鸿和李伟华对本文有同等贡献网络出版时间:2023-07-19 1742 网络出版地址:https:/ 俐2 罗淑敏1 徐 芳1 陈 静1 邢恩鸿2#李伟华1#(1.首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所,北京 100069;2.承德医学院附属医院检验科,河北承德 067000)【摘要】目的 比较 4、37 和室温三种不同复苏方式对冻存外泌体的影响,明确冻存外泌体的最佳复苏方式。方法 将冻存血浆分成三组:4 冰箱过夜融化复苏组、37 水浴箱融化复苏组、室温融化复苏组。采用超速离心法提取外泌体;使用透射电镜检测外泌体大小、形态结构;Amnis 量化成像流式细胞仪检测外泌体的数量和所占总粒子百分比(纯度)。结果三种复苏方式中,37 水浴箱融化复苏组得到外泌体的数量和百分比最高,与 4 冰箱融化复苏组和室温融化复苏组比较,组间差异均有统计学意义(P0.01)。4 冰箱过夜融化复苏组获得外泌体的数量和百分比最低。同时发现,在人的血浆外泌体中,CD9 阳性外泌体的数量明显高于 CD63 阳性外泌体和 CD81 阳性外泌体,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 37 水浴箱融化复苏获得外泌体的数量和百分比最高,是最佳的外泌体复苏方式。在人血浆外泌体中,CD9 阳性外泌体的数量及百分比最高。【关键词】外泌体;复苏;活性【中图分类号】R331 【文献标识码】AEffects of different resuscitation methods on frozen exosomesXiao Li2,Luo Shumin1,Xu Fang1,Chen Jing1,Xing Enhong2#,Li weihua1#(1.Institute of liver Diseases,Beijing Youan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China;2.Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei Province,China)【Abstract】Objective To compare the effects of three resuscitation methods(4,37 and room temperature)on frozen exosomes,to clarify the optimal resuscitation way for frozen exosomes.Methods Frozen plasma was thawed as below three methods:4 refrigerator overnight,37 water bath box,and room temperature.Exosomes were isolated by ultracentrifugation,transmission electron microscope observed exsomes size and morphology,Amnis imaging flow cytometry detected exosome quantity and percentage(purity).Results Among the three resuscitation methods,37 water bath resuscitation group obtained the highest number and percentage of exosomes,which were statistically higher compared to the 4 refrigerator resuscitation group and the room temperature resuscitation group(P0.01).The number and percentage of exosomes obtained from the 4 refrigerator overnight resuscitation group were the lowest.At the same time,it was found that the number of CD9 positive exsomes in human plasma was significantly higher than that of CD63 positive and CD81 positive exsomes,with statistically significant difference(P0.05).Conclusions The 37 water bath resuscitation method was the best method for frozen exosomes.In human plasma exosomes,CD9 positive exosomes was the highest quantity and percentage subgroup.【Key words】exosomes;resuscitation;activity 外泌体(exosome)是由细胞分泌的小囊泡,直径约 30150 nm,广泛存在于各种体液中1,外泌体携带大量特异性的蛋白质以及功能性的脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid,DNA)、信使 RNA(message ribonucleic acid,mRNAs)、微小核糖核酸RNA(microRNAs,miRNAs)等,在细胞信息传递和物质交换中有着重要的生物学功能2,已成为医学和生物学领域研究的热点3-5。在日常科学研究和临床应用中经常将外泌体冷冻保存6,但冷冻保存后哪种复苏方式效果最好以及不同复苏方式对外泌体的数量及生物活性的影响方面的研究报道比较少。为了最大限度保持冻存外泌体的生物学活首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷性、获取最大量的外泌体,明确外泌体的最佳复苏方式具有重要的意义和应用价值。1 材料与方法1.1 材料与仪器外泌体荧光抗体(BD 公司,美国):异硫氰酸荧光素小鼠抗人分化抗原 9(FITC Mouse Anti-Human CD9 antibody,CD9-FITC)(Cat:555 371,LOT:0 188 106),藻红蛋白荧光素小鼠抗人分化抗原 63(PE Mouse Anti-Human CD63 antibody,CD633-PE)(Cat:557 305,LOT:9 143 803),别藻蓝蛋白荧光素小鼠抗人分化抗原 81(APC Mouse Anti-Human CD81 anti-body,CD81-APC)(Cat:551 112,LOT:8 005 529);Amnis 量化成像分析流式细胞仪(Luminex,美国,型号:ImageStream Mk II);0.22 m 过滤器(Millipore,美国);超速离心机(Beckman Coulter,美国,型号:Op-tima XPN-100);透射电子显微镜(Hitachi,日本,型号:JEM-2100);纳米流式检测仪(厦门福流生物科技有限公司,中国,型号:U30E)。1.2 方法1.2.1 血浆样品的制备血浆来自首都医科大学附属北京佑安医院检验科健康查体标本(本研究均取得患者同意并签署知情同意书)。防凝血 500 g 离心 5 min 得到的上清液即为血浆样本,分装至 1.5 mL 冻存管中,每管 1 mL,冻存于-80 冰箱备用。1.2.2 外泌体的提取从-80 冰箱取出冻存血浆,分为 3 种融化复苏方式:4 冰箱过夜融化复苏、37 水浴箱融化复苏以及室温放置融化复苏。外泌体提取方法如下:融化后的血浆加入适量37 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffev sa-line,PBS)10 000 g 离心 30 min,去除细胞碎片。收集上清液至超速离心管中,110 000 g 离心 70 min,得到外泌体沉淀。弃上清液,外泌体沉淀中加入 PBS 110 000 g离心70 min,洗涤一次外泌体。弃上清液,100 L PBS重悬外泌体。所有离心均在4 下进行。1.2.3 Amnis 量化成像流式细胞仪检测外泌体7将超速离心后得到的外泌体转至1.5 mL 离心管中,分别加入外泌体标志物抗体 CD9-FITC、CD63-PE和 CD81-APC 各 2.5L,避光孵育 30 min,加入 1 mL PBS 110 000 g 离心70 min,洗去未结合的抗体。Am-nis 量化成像流式细胞仪检测外泌体表面标志物。Amnis 流式细胞仪采用时间延迟积分(time delay in-tegration,TDI)的电荷耦合装置(charge-coupled de-vice,CCD),具有高通量和高灵敏检测微米级颗粒的优势。Amnis TDI CCD 技术先捕获外泌体表面特异性荧光信号,基于 CCD 的图像采集检测器快速采集外泌体图像且特异性识别、表征外泌体。根据外泌体直径大小和纵横比圈门,从中标记出阳性外泌体直方图,使用 Amnis 检测系统 ImageStreamX 软件收集 100 000 个粒子。使用 Amnis 分析系统 IDEAS 软件(6.2版)对这 100 000 个粒子中 CD9 阳性外泌体(CD9+exosome,CD9+EXO)、CD63 阳性外泌体(CD63+exo-some,CD63+EXO)和 CD81 阳性外泌体(CD81+exo-some,CD81+EXO)的数量以及在总粒子中所占百分比进行分析。每次上机所设电压一致(488 nm 激发光 102.5 mW,642 nm 激发光 150 mW)。1.3 统计学方法应用 SPSS 25.0 统计学软件对数据进行统计分析。所有数据均符合正态性分布,均以均数标准差(xs)表示。组间比较采用单因素方差分析,SNK-q 检验进行两两比较。以 P0.05 为差异具有统计学意义。2 结果2.1 外泌体的鉴定透射电镜观察到外泌体的形态和结构(图 1),纳米流式检测仪检测到外泌体平均粒径约为 115 nm(图 2),Amnis 量化成像流式细胞仪检测到 CD9-FITC、CD63-PE 和 CD81-APC 标记的外泌体(图 3)。图 1 外泌体透射电镜图Fig.1 Exosomes picture of transmission electron microscope046第 4 期肖 俐等:不同复苏方式对冻存外泌体的影响图 2 外泌体纳米流式检测图Fig.2 Exosomes picture of nanometer flow cytometer detection图 3 Amnis 量化成像流式细胞分析仪检测外泌体特异性标志物图Fig.3 The picture of Amnis image flow cytometry detection specific markers of exosomeCh01:bright field;Ch02:CD9-FITC;Ch03:CD63-PE;Ch11:CD81-APC.2.2 Amnis 量化成像流式细胞仪检测外泌体的数量及百分比通过对外泌体表面特异性标志物 CD9、CD63、CD81 抗体染色,Amnis 量化成像流式细胞仪检测和IDEAX 软件分析(图 4),统计得到 3 种不同复苏方式人血浆中 CD9+EXO、CD63+EXO、CD81+EXO 的数量及 3 者在总粒子中所占百分比(表 1)。2.3 4 冰箱过夜融化复苏对外泌体数量及百分比的影响Amnis 量化成像分析结果显示:4 冰箱过夜融化复苏所得 CD9+EXO 数量为(4.271.20)106/mL,占总粒子百分比为(29.675.00)%;CD63+EXO数量为(4.110.68)106/mL,占总粒子百分比为(27.624.17)%;CD81+EXO 数量为(2.600.81)106/mL,占总粒子百分比为(17.403.41)%(图 5 和表 1)。2.4 37 水浴箱融化复苏对外泌体数量及百分比的影响Amnis 量化成像分析结果显示:37 水浴箱融化复苏所得 CD9+EXO 数量为(7.260.78)106/mL,占总粒子百分比为(35.754.75)%;CD63+EXO数量为(5.820.46)106/mL,占总粒子百分比为(32.983.96)%;CD81+EXO 数量为(3.920.67)106/mL,占总粒子百分比为(22.952.65)%(图 5 和表 1)。2.5 室温融化复苏对外泌体数量及百分比的影响Amnis 量化成像分析结果显示:室温融化复苏所得 CD9+EXO 数量为(4.550.96)106/mL,占总粒子百分比为(31.335.89)%;CD63+EXO 数量为(4.240.65)106/mL,占总粒子百分比为(28.50 4.68)%;CD81+EXO 数 量 为(3.33 0.53)106/mL,占 总 粒 子 百 分 比 为(19.00 1.86)%(图 5 和表 1)。图 4 Amnis 量化成像检测人血浆外泌体表面特异性标志物Fig.4 Amnis imaging flow cytometry detection of surface specific markers of human plasma exosomesEvs:extracellular vesicles.146首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷表 1 不同复苏方式对外泌体数量(106/mL)及百分比(%)的影响Tab.1 The effects of different resuscitation methods on the number(106/mL)and percentage(%)of exosomespecific surface markers(xs)Group Number of case4 refrigerator resuscitation group37 water bath resuscitation groupRoom temperature resuscitation groupFPCD910Quantity4.271.207.260.784.550.9613.780.000110Percentage 29.675.0035.754.7531.335.893.490.045CD6310Quantity 4.110.685.820.464.240.6519.170.000110Percentage27.624.1732.983.9628.504.683.150.043CD8110Quantity 2.600.813.920.673.330.536.700.00210Percentage 17.403.4122.952.6519.001.8612.260.0001 图 5 不同复苏方式对外泌体表面特异性标志物数量及百分比的影响Fig.5 The effects of different resuscitation methods on the number and percentage of exosome specific surface markersA:the quantity of CD9+EXO,CD63+EXO and CD81+EXO in different resuscitation methods;B:the percentage of total particles of CD9+EXO,CD63+EXO and CD81+EXO in different resuscitation methods;P0.05,P0.01,P0.001.2.6 三种复苏方式对不同表面标志物外泌体数量及百分比影响的比较在三种复苏方式中,37 水浴箱复苏得到外泌体的数量显著高于 4 冰箱过夜复苏和室温复苏,差异均有统计学意义(P0.01);37 水浴箱复苏得到外泌体的百分比显著高于 4 冰箱过夜复苏和室温复苏,差异有统计学意义(P0.05)(图 5 和表 1)。2.7人血浆中 CD9+EXO、CD63+EXO 和 CD81+EXO 数量及百分比人血浆外泌体表面特异性标志物 CD9、CD63 和CD81 分析结果显示:CD9+EXO 的数量及百分比最高,数量为(5.671.50)106/mL,百分比为(32.335.59)%;CD63+EXO 的数量为(4.780.98)106/mL,百分比为(29.904.74)%;CD81+EXO 的数量及百分比最低,数量为(3.280.85)106/mL,百分比为(19.693.59)%。数量和百分比的组间差异都有统计学意义(P0.01)(图 6 和表 2)。图 6 人血浆中 CD9+Exo、CD63+Exo 和 CD81+Exo数量(A)及百分比(B)表达情况Fig.6 The relative expression of quantity(A)and percentage(B)of CD9+EXO,CD63+EXO and CD81+EXO in human plasma P 0.01,P 0.001;CD9+EXO:CD9+exosome;CD63+EXO:CD63+exosome;CD81+EXO:CD81+exosome.246第 4 期肖 俐等:不同复苏方式对冻存外泌体的影响表 2 人血浆中 CD9+EXO、CD63+EXO 和 CD81+EXO 数量及百分比情况Tab.2 The quantity and percentage of CD9+EXO,CD63+EXO and CD81+EXO in human plasma(xs)ItemNumber of caseCD9CD63CD81FPQuantity/106 mL-1305.671.504.780.983.280.8533.400.000 1Percentage/%3032.335.5929.904.7419.693.5960.830.000 1 CD9+EXO:CD9+exosome;CD63+EXO:CD63+exosome;CD81+EXO:CD81+exosome.3 讨论研究8报道,外泌体的最佳储存方式是-80 冷冻保存。在外泌体复苏过程中,由于温度变化或冰晶影响,可能导致外泌体膜破裂或表面蛋白丢失。因此选择一种快速恢复外泌体活性又能获得最大量外泌体的复苏方式非常关键。为了明确不同复苏方式对外泌体数量和活性的影响,本研究9使用高灵敏度的 Amins 量化成像流式细胞仪对不同方式复苏后的外泌体表面特异性蛋白进行检测。实验结果显示 37 水浴箱复苏得到的外泌体数量和活性最高。主要原因可能是一方面 37 水浴箱复苏比其他两种复苏方式所用时间短,减少了冰晶对外泌体内部及外膜的损伤,减少了外泌体膜破裂,复苏了最大量的外泌体;另一方面,外泌体在 37 水浴箱中快速融化,使外泌体的生物活性物质短时间内快速恢复到最佳状态,在稳定外泌体结构的同时,最大限度的保持了外泌体中各种蛋白、核酸和脂类的生物活性。37 水浴箱复苏外泌体,既省时有效,又能提高外泌体活性和稳定性,从而增加了外泌体的回收率,获得了最大量外泌体,是冻存外泌体的最佳复苏方式。外泌体表面标志物有 CD9、CD63、CD81 等10,不同表面标志物的外泌体在人血液中所占比例的相关报道较少。为了明确人血液中不同标志物外泌体的浓度,本文分析了冻存复苏后人血浆中 CD9、CD63、CD81 阳性外泌体的数量及百分比。结果发现:在人血浆外泌体中,CD9 阳性外泌体的数量及百分比最高,CD81 阳性外泌体的数量及百分比最低,CD63 阳性外泌体的数量及百分比居中。CD9 是由CD9 基因编码的 4 次跨膜蛋白,是跨膜四超家族成员之一,可以调节细胞黏附和迁移11,并对重组慢病毒载体的释放和感染性有重要作用12。CD8 与中枢神经系统损伤病理生理学有关13。外泌体另一种标志性膜蛋白 CD63 可通过调节:铁应答原件-铁调节蛋白(iron responsive element-iron regulatory protein,IRE-IRP)系统参与铁蛋白的分泌14。以上报道表明,不同外泌体表面标志物可能有着不同的生物学功能。因此,明确血液中不同标志物外泌体的浓度为探索外泌体生物学功能及临床和实验室应用提供了依据,具有重要的意义。本研究发现,37 水浴箱复苏冻存外泌体获得的外泌体数量和活性最高,是最佳的复苏方式。同时发现,人血浆中 CD9 阳性的外泌体数量和百分比最多。本文为外泌体的研究和临床应用提供了一定的理论及实验室依据。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。作者贡献声明 肖俐:设计实验方案进行实验,撰写论文;罗淑敏、徐芳:数据获取和分析,陈静:协助实验;邢恩鸿:审定论文;李伟华:提出研究方法和命题设计,总体把关,审定论文。参考文献 1 Tenchov R Sasso J M Wang X M et al.Exosomesnatures lipid nanoparticles a rising star in drug de-livery and diagnostics J.ACS Nano 2022 16 11 17802-17846.2 Liang Y Duan L Lu J et al.Engineering exosomes for targeted drug delivery J.Theranostics 2021 11 7 3183-3195.3 Cully M.Exosome-based candidates move into the clin-ic J.Nat Rev Drug Discov 2021 20 1 6-7.4 Xu Z J Zeng S S Gong Z C et al.Exosome-based immunotherapy a promising approach for cancer treat-ment J.Mol Cancer 2020 19 1 160.5 Pegtel D M Gould S J.Exosomes J.Annu Rev Bio-chem 2019 88 487-514.6 Cheng Y R Zeng Q Y Han Q et al.Effect of pH temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes J .Protein Cell 2019 10 4 295-299.7 Tertel T Grgens A Giebel B.Analysis of individual extracellular vesicles by imaging flow cytometry J.Methods Enzymol 2020 645 55-78.8 Zhang Y Bi J Y Huang J Y et al.Exosome a re-346首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷view of its classification isolation techniques storage diagnostic and targeted therapy applications J.Int J Nanomedicine 2020 15 6917-6934.9 李榕 陈静 李传云 等.过滤对超速离心法提取外泌体的影响 J.首都医科大学学报 2021 42 6 1007-1013.10 Kalluri R LeBleu V S.The biology function and bi-omedical applications of exosomes J.Science 2020 367 6478 eaau6977.11 阚宠 黎建昌 黄小程 等.外泌体相关跨膜蛋白上调整合素促进肝细胞癌中细胞迁移的研究 J.右江医学 2020 48 3 188-193.12 Bker K O Lemus-Diaz N Rinaldi Ferreira R et al.The impact of the CD9 tetraspanin on lentivirus infectiv-ity and exosome secretion J.Mol Ther 2018 26 2 634-647.13 Khan N Z Cao T X He J Y et al.Spinal cord injury alters microRNA and CD81+exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory po-tential J.Brain Behav Immun 2021 92 165-183.14 Yanatori I Richardson D R Dhekne H S et al.CD63 is regulated by iron via the IRE-IRP system and is im-portant for ferritin secretion by extracellular vesicles J.Blood 2021 138 16 1490-1503.(收稿日期:20221226)编辑 金海政446