有机小分子荧光探针的研究.pdf

有机小分子荧光探针的研究精品资料有机小分子荧光探针的研究精品资料荧光探针是建立在光谱化学和光 学波导与测量技术基础上，选择性的将分 析对象的化学信息连续转变为分析仪器易 测量的荧光信号的分子测量装置。荧光探针受到周围环境的影响，使其 发生荧光发射发生变化，从而使人们获知 周围环境的特征或者环境中存在的某种特 定信息精品资料*灵敏度图*选择性好*使用方便*成本低 不需预处理*不受外界电磁场影响*远距离发光精品资料荧光分子探针通常 由三部分组成：*识别基团(receptor)*报告基团(fluorophore)连接体部分(spacer)stro ngly fluo rescentAnalyte识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，报告基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。精品资料荧光分子探针的设计原理主要有以下几种:键合-信号输出法、置换法和化学计量计法。1、键合-信号输出法荧光连接体识别被分析物 信号输出基团 基团键合-信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基团 通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。精品资料当识别基团与被分析物结合时会 引起荧光基团的化学环境发生变化，通过 颜色的改变、光谱的移动、荧光强度的增 减等现象来表现，这些变化可被裸眼或者 仪器识别。这是目前为止在设计荧光探针 中应用最广泛的方法。精品资料作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨 基苯硫醴以席夫碱相连，加入锌离子后，与硫醴上的硫原 子、席夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构 2,抑制了席夫碱上ON键的旋转，实现了荧光从无到有的基于键合-信号输出法设计的锌离子荧光探针精品资料识别基团 被分析物 识别基团 荧光基团结合荧光基团 结合被分析物基于置换法设计的荧光探针该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能 力的不同来实现对被分析物的检测。识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由 于识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力,因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的 变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。精品资料化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探 针本身荧光很强，但与铜离子络合后可形成结构3,从而淬 灭了氟硼荧的荧光，加入鼠根离子后，由于铜离子与鼠根离 子的结合常数更大，从而把作为荧光基团的氟硼荧衍生物从 络合状态中置换出来得到结构4,使之进入溶液，荧光恢复,而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对鼠根离子 的检测。精品资料O+O-探针分子 被分析物 新物质A+。一 I HD-多 n探针分子 被分析物 中间体 新物质B 新物质C基于化学计量计设计的荧光探针(I)被分析物和探针分子反应形成了共价化合物;(II)被分析物催化探针分子反应生成两种新物质精品资料化学计量计法是利用探针分子和被分 析物之间发生的特定化学反应(一般是不可逆 反应)来改变探针所处的化学环境，从而对被 分析物进行识别的一种方法。根据化学计量计 法设计的探针可以称为化学计量计，主要包括 两种类型：一、探针分子和被分析物发生化学反应后形成共价化合物;二、被分析物催化探针分子反应生成两种新物质(II)0一般而言，基于化学计量计原理设计的荧光分子探针通常具有 不可逆性和较好的选择性。精品资料基于化学计量计法设计的次氯酸根离子荧光探针根据次氯酸根可以氧化羟胺的特性，设 计合成了化合物5,当次氯酸根存在时可氧化羟胺 结构，使罗丹明开环，从而形成结构6,最终进一 步水解为罗丹明6G本身7,而产生强烈的荧光。而 其它氧化性分子没有这样的特性，因此可以实现 对水相中次氯酸根的高选择性检测。精品资料荧光分子探针主要有如下几种响应机理:1 x光诱导电子转移(PET,photo-induced electron transfer)2、分子内电荷转移(ICT,intramolecular charge transfer)3、荧光共振能量转移(FRET,fluorescence resonance energy transfer)4、激基缔合物(excimer/exciplex)精品资料光诱导电子转移是指电子给体或 电子受体受光激发后，激发态的电子给体 与电子受体之间发生电子转移的过程。识别基团与被分析物结合之前，荧光基团受激发，最终被光激发到激发态 的电子不能跃迁到基态，使得荧光基团的 荧光淬灭。而识别基团与被分析物结合后，PET过程受阻，荧光基团的荧光得以恢复。精品资料PET识别分析物理论示意图PET过程可以用前线轨道理论具体解释：当识 别基团不存在时，荧光团被光激发后，其最高占据轨道(HOMO)的一个电子跃迁到最低空轨道(LUMO)5能够产 生荧光；若外来识别基团的HOMO或LOMO轨道介于荧光团 两轨道能量之间，此时就可以发生识别基团与荧光团之间 的电子转移而导致荧光的猝灭。即PET过程阻止了荧光团 的一个电子从激发态到基态的非辐射跃迁途径，降低了荧 光团的量子产率，表现为荧光强度的减弱或淬灭。精品资料LOIOL13I0HOMOHOMOLL3IOhomo-|-|-HOMOLUMOPET1荧光团未结合的受体荧光淬灭HOMO荧光团结合的受体荧光恢复4 41I|-j-HOMOHOMO-1-1-1 HOMOHOMO-f-1-PET1识别基团对荧光团的PET过程发生和受阻的前线轨道理论解释第一种是识别基团对荧光基团的电子转移（PET1）,如图1.9所示，即识别基团的HOMO轨道介于荧光基团的HUMO和LUMO轨道之间，当被 分析物不存在时，荧光基团被激发后，识别基团的HOMO轨道的电子转移 到荧光基团的HOMO轨道，致使荧光基团被激发到LUMO轨道上的电子无 法回到基态而难以产生荧光，导致荧光淬灭，即PET1过程发生。当识别基团与被分析物结合后，识别基团HOMO轨道能量降低，使 PET过程受阻，这样荧光基团的激发态电子可以返回基态，荧光恢复。精品资料总的来说，识别基团对荧光基团 的电子转移，即识别基团的HUMO轨道上的 电子占据了荧光基团的HOMO轨道；荧光基 团对识别基团的电子转移(PET2),即识别基 团LUMO消耗掉了荧光基团被激发的电子，两者最终导致荧光基团被激发的电子不能 回到基态，使荧光被淬灭。精品资料分子内电荷转移是指分子在激发态时发 生分子内电子转移，造成正负电荷分离，形成分 子电荷转移态。分子内电荷转移荧光探针分子通 常是荧光团上同时连有推电壬基团（电子给体？Donor）和吸电子基团（电子受体，Acceptor），通 过n键提供电子转移的通道，形成强的推-拉作用 的共辗体系，其吸电子基团或推电子基团本身充 当识别基团的一部分。当识别基团和被分析物结 合后，作为识别基团的供电子部分或拉电子部分 的推拉电能力发生的改变，整个体系的的n电子 结构重新分布，从而导致吸收光谱，发射光谱发 生变化，主要是光谱红移或蓝移。精品资料光谱蓝移被分析物与供电子基团（电子给体，D）结合，荧光光谱蓝移V光阳红移被分析物与吸电子基团（电子受体，A）结合，荧光光谱红移.识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT过程光谱移动示意图（其中D、A分别表示电子给体和电子受体）精品资料8 9化合物8是另一类香豆素荧光探针，在香豆素的 3号位以烯键连接了一个苯并拉电子基，7号位修饰了一个 二乙胺基供电子基，构成了推拉电子体系的荧光分子探针。当羟基自由基存在时，能够将化合物8氧化为化合物9,这 样化合物9共粗度大大扩大，氮原子带正电荷增强了其拉 电子能力，使整个体系P电荷离域程度增大，从而导致吸 收光谱和荧光光谱分别红移了60 nm和156 n叫 发射波长 已位于近红外，基本不受样品荧光背景的干扰，荧光颜色 由绿色变为红色，该探针可对细胞中的羟基自由基进行比 率检测，比率信号可达210倍。精品资料 荧光共振能量转移指一个荧光体系含有两个荧光团，一个充当能量供体D,另一个为能量受 体A,当用供体D的激发去激发荧光体系时，可以 发生从D到A的非辐射能量转移，从而发射出受体 荧光团的荧光。荧光共振能量转移发生必须具备 以下几个条件：*(1)能量供体荧光团D的荧光发射位于短波长处，且发射 光谱和能量受体荧光团A的吸收光谱有一定重叠，能量受 体能够在能量供体的发射波长处吸收能量；*(2)能量供体与能量受体相隔的距离必须远大于它们之 间的碰撞直径(有时甚至为70-100A)；*(3)能量供体与能量受体还必须以适当的方式排列。精品资料吸能共硼嗖的荧现 勺的为光氟二荧硼实 谛明准荧为遮硼氟而 短罗琳后菽形时生J 领与氟物，服此发光 利谱，析前硫物荧/光接分之基环转色 肠射连被子氨开量红 开发臂入高使构能的 物决接加汞薛结垂明 梆演逑的加播醐叶罗 航荧通受。存内使出。鼾硼，量现的明终射测 娼氟叠能实子丹最发检 凯干童为能离罗,而里 瑛由围作便汞使明从率 加，范明程，致丹，比 界针大丹过光而罗弱的 心探较罗移荧物给减子 彳光有，转色合递峰离 荧谱体量绿化传射汞 ET光供能的类量发对 FR收量振荧酮能的了精品资料Mooomoc misaioraMonomer and mcihwv nMMioi duo to proumity between the mo nuorophorw*激基缔合物指一些荧光团在激发态与另一相同或不同的基态荧光团接近时往往能生产激基缔合物(通过TT-TT堆积作用形成激基 缔合物)可观察到双重荧光。它的发射光谱不同于单体的荧光，新的 荧光会产生一定的红移工且出现强而宽的，无精细结构发射峰。这种 作用本质上是光致电荷转移作用，在两个相同的荧光分子之间形成激 基缔合物以及在两个完全不同的荧光分子之间形成激基复合物，可以 用卡式表示：*A*+A A*-A(excimer)*A*+B A*-B(exciplex)精品资料激基缔合物对距离的要求更为苛刻，只 有激发态分子和基态分子达到碰撞距离3 A时 才可能形成激基缔合物，因此可以利用各种分子 间作用力改变两个荧光团之间的距离，通过结合 客体前后单体和激基缔合物的荧光光谱的变化来 表达客体被识别的信息。由于蔡、花、蕙等荧光 团具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合 物等特点，因此常常被用于此类探针中。精品资料12 13化合物12基于激基缔合物的荧光探针，加 入汞离子之前两个花分子相距很远，因此发射 的是花单体荧光，当汞离子存在时，O、N原 子与其配位形成化合物13,从而拉近了两个花 分子之间的距离，且让其平行排列，最后产生 二聚体荧光。精品资料*罗丹明罗丹明及其衍生物是一种氧杂葱类荧光 染料，由于苯环间氧桥的存在，从而分子具有刚 性共平面结构，使其分子结构稳定性增强，开环 状态下，在激发光的作用下能产生强烈的吸收和 荧光，其最大发射波长位于500-700 nm之间，为 红色可见光区，可有效的避开生物体系背景荧光,从而能提高探针的灵敏度，因此是生物分析中经常用到的荧光探针，具有很高的研究和应用价值。精品资料内酰胺螺环状结构：无吸收，无色，无荧光14开坏结构：长波长有吸收，有颜色，强荧光15罗丹明内酰胺螺环结构具以下特点：1）罗丹明的内酰胺螺环是非共粗结构的，因此在长波长处无吸收 2 无色，无荧光；2）内酰胺螺环结构在酸性条件或者与被 分析物结合后能够诱导罗丹明内酰胺结构开环，氧杂意结 构电子重新排布，共聊结构恢复，因此在长波长有吸收，有颜色，强荧光。由于此结构的优势，罗丹明内酰胺类衍 生物是一类很好的OFF-ON型荧光传感器荧光团。因此可以 用罗丹明作为母体来进行设计，首先使它形成具有酰胺螺 环结构的化合物，当它与被分析物作用时，内酰胺螺环结 构被打开，信号从无到有，达到对被分析物的识别的目的。精品资料*匕匕花分子由四个苯环构成，是一种四环多 环芳香类物质，有很强的荧光，在丙酮中 量子产率可达0.99,其晶体加电压可发光,最初用于电致发光研究。龙荧光基团是最 有用的荧光化学敏感器之一，花基团附近 连接一氨基已被广泛采用的在选择具体的 金属离子，通过控制信号光诱导电子转移(PET)过程来选择性识别金属离子。精品资料16R=0H17R=H16-17*检测银离子:化合物16和17,加入了Ag+后，该探针荧光由单体荧光变为激基缔合物的荧光，对Ag+有高灵 敏度和高选择性。其中，化合物17对Ag+只有微弱的响应,这是由于化合物16带有羟基与Ag+配位起了决定性的作用。在自由态时，化合物18表现出很强的激基缔合物荧光，Ag+存在时与氮配位，使两个花分子距离变远，激基缔合 物荧光减弱，单体荧光增强，因此可以对银离子进行比率 型检测。精品资料有机荧光探针最新研究进展*随着荧光探针的合成及应用技术的不断改 进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也 不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来 越广阔。精品资料*1 BODIPY类*二氟化硼一2一二毗咯甲烷(BODIPY)是一 类重要的有机荧光染料，由于其分子结构 易于改性，近十年来研究人员合成了一系 列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上 得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产 率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子 检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面 得到重要应用。精品资料L1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展*对金属离子探针的研究早在20世纪七八十 年代就已开始，2008年，Serdar Atilgan11 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离 子荧光探针.清品资料*Wenwu Qin,Mukulesh Baruah2等人合成了 含氮杂冠醴取代基的BODIPY衍生物，这种 基于BODIPY的染料分子表现强烈的依赖溶 剂的荧光发射特征精品资料*Xiaojun Peng13研究组合成了一个能专识别Cd2+离子的荧光探针，该探针具 有较好*的细胞穿透性，并且首次被应用于活体细胞内Cd2+的检测，其机理为分内电 荷转移机理*(IcT)o探针的最大发射波长为656nm与Cd2+络合后蓝移至597nln,而Zn2+及 其它*金属离子没有干扰，结构如图所示精品资料*Yufang Xu和Xuhong Qian则根据PET机理设计合成另一种 高选择性的镉离子荧光探针3探针分子本身在溶液中几 乎无荧光，而且不易受PH的影响。Zn2+,Pb2+,Cr3+,Fe3+,Cu2+,Hg2+,Ag+,Ba2+,Mg2+,Co2+,Cs+,Na+,K+,Ca2+和Ni2+的存在几乎不影响荧光发射广谱，对 Cd2+展示出高度的选择性。精品资料*MingjianYuan 51等设计了一个基于PET和ICT双重机理的 Hg2+荧光探针，该探针包含有两个受体，分别以PET机理 和ICT机理与Hg2+结合。加入Hg2+前荧光较弱，最大发射 波长在668nm,而络合Hg2+后荧光增强超过7倍，最大发射 波长蓝移到578n叫对Hg2+显示出良好的选择性和高度的 敏感性。结构如图所示精品资料*Xuhong Qian6等以B0DIPY为荧光团，以聚酰胺为受体，合成一系列基于PET机理的Hg2+荧光探针，每个探针分子 能够络合两个Hg2+,荧光增强显著，该系列探针拥有专一 的选择性、高灵敏性以及良好的水溶性，也许是因为水溶 性太好所以不能够透过细胞膜，未能做到在细胞内荧光成 像。结构如图所示精品资料1.2基于BODIPY的pH荧光分子探针的研究进展*pH在许多体系扮演重要角色，因而测定pH 具有重大的意义。目前测定pH的方法很多，荧pH荧光探针是其中一种重要手段。相较 其他分析方法，pH荧光探针具有不破坏待 测体系、高灵敏度的特性，故在细胞生物 学、药物学、生物化学上应用广泛。近年 来，人们合成了多种pH荧光探针。精品资料1.3基于BODIPY的染料的其它荧光探针*目前以BODIPY染料为母体结构的荧光探针 多数都是用于检测金属离子及pH的，但研 究人员的兴趣不局限于此，近来利用 BODIPY染料合成了一些可以对某些酸、酸 根离子或氧化物响应的荧光探针。精品资料*Engin U.Akkaya 15合成了一种BODIPY衍生物可以检测溶 液中微摩尔浓度的氧离子。当溶液有氧离子存在时，这种 结构简单的荧光探针的发射强度急剧下降，溶液颜色可逆 的由红色变为蓝色。荧光探针的合成、结构及可能的作用 机理如图&9为天non.fluorescent fluorescentquenched by PET process PET process is prohibited精品资料*Youngkyu Do应将一种三取代硼烷同BODIPY结合制备了对 氧离子具有高度选择性的荧光探针，由于高灵敏的荧光响 应特点，可以检测到低于微摩尔浓度的氧离子的存在。精品资料*Tetsuo Nagano在07年合成了一种新式基于BODIPY的硫醇 探针网，这种探针在可见光下激发，并且在没有硫醇分子 存在时自身不发出荧光。其分子结构上含有马来酰亚胺取 代基，这使得BODIPY自身的荧光被熄灭。当探针与硫醇反 应后，则发出极强的荧光。精品资料*BODIPY衍生物自身也存在一些缺陷，比如 水溶性不好，这对扩大BODIPY应用领域带 来了限制。近两三年来对BODIPY染料的研 究热点是设计和合成新的长波长BODIPY衍 生物，并对光谱特征进行研究。如向 BODIPY母体分子引入芳香基团，增加核心部 分的刚性平面结构和改变取代基等来增加 染料的发射波长。精品资料2基于其它染料的荧光探针*Tetsuo Nagano 19研究小组合成了氨基取代的三碳菁染料 DIPCY作为Zn2+荧光探针2叫这是首次合成近红外区域的 Zn2+荧光探针，具有良好的灵敏度，低浓度的重金属离子 对该探针也几乎无影响。精品资料*2007年，Bo Tang2i开发了一种新式的基于罗丹明染料的 荧光探针用于检测硫醇类物质，并成功应用于活体细胞内 谷胱甘肽的生物成像，表现出良好的灵敏度和选择性，尤 其是对蛋白类硫醇的检测十分灵敏。精品资料*以上概述了部分类型的有机荧光探针的合 成及在生物体内离子或小分子检测方面的 应用情况，其实它的应用远不止于此。随 着荧光探针技术的不断发展和完善,必然会 给目前较为热门的基因组学、蛋白质组学、生物芯片以及等药物作用机制等领域带来 新的发展契机,提供非常有价值的方法和信 息。精品资料ENDTHE精品资料有机小分子荧光探针的研究谢谢精品资料