总胆汁酸检测专家讲座.pptx

总胆汁酸检测第1页血清总胆汁酸检测酶比色法测定总胆汁酸循环法测定胆汁酸总胆汁酸检测第2页酶比色法测定总胆汁酸【原理】在3-羟类固醇脱氢酶(3-HSD)作用下，各种胆汁酸C3上位烃基(3-OH)脱氢形成碳基(3=O)。同时NAD还原成NADH。随即，NADH上氢由黄递酶催化转移给碘化硝基四氮唑(INT)，产生红色甲臢。甲臢产量与总胆汁酸(TBA)成正比，在500nm波长比色。反应式以下：3-羟基胆酸+NAD+3-氧代胆酸+NADH+H+NADH+H+INT NAD+甲臢 (红色)总胆汁酸检测第3页酶比色法测定总胆汁酸【试剂】1试剂 黄递酶 1 000U，NAD+1 mmol，碘化硝基四氮唑(INT)0.5 mmol,丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 磷酸缓冲液1 L中，加表面活性剂适量。2试剂 3-羟类固醇脱氢酶(3-HSD)2 000U溶于0.1mol pH 7.5磷酸缓冲液中1 L中。3终止液 1 mol/L HCl。4标准液(50mol/L)24.38 mg甘氨胆酸溶于1 L经透析混合血清中。总胆汁酸检测第4页酶比色法测定总胆汁酸【操作步骤】1手工法按表 加入物加入物(ml)测定测定 测定对照测定对照 标准标准 标准对照标准对照血清血清 0.1 0.1 a标准液标准液 0.1 0.1 b试剂试剂 0.3 0.3 0.3 0.3 c试剂试剂 0.1 0.1 d 去离子水去离子水 0.1 0.1 e 混匀，37水浴10min，加终止液0.1ml，摇匀，500nm波长，以水校零，读取各管A值。2自动分析法 普通无法做对照管，而是设置两点终点法，读取前后两个吸光度A1和A2。详细按说明书要求。总胆汁酸检测第5页酶比色法测定总胆汁酸【计算】手工法：TBA(mol/L)=A测定-A测定对照/A标准-A标准对照C标准 自动分析法：TBA(mol/L)=A测定2-A测定1/A标准2-A标准1C标准【参考范围】60名健康成人空腹TBA为4.92.38mol/L,中餐后2h TBA为8.222.91mol/L。总胆汁酸检测第6页酶比色法测定总胆汁酸 -临床意义 胆汁酸生成和代谢与肝脏生理关系亲密，血清胆汁酸水平是反应肝实质损伤一个主要指标。血清总胆汁酸(TBA)测定对肝病诊疗有十分主要价值。1急性肝炎：急性肝炎时血清TBA显著增高，可达正常人水平10100倍，甚至更高，急性肝炎初愈患者血清TBA由最初高值几乎与AST在同一时间降至正常水平，若连续不降或反而上升者则有发展为慢性可能。2慢性肝炎：慢性肝炎分为轻度、中度和重度三个类型，空腹总胆汁酸(F-TBA)和餐后2h总胆汁酸(P-TBA)测定对慢性肝炎分型、监测、预后及疗效有着主要意义。总胆汁酸检测第7页酶比色法测定总胆汁酸 -临床意义3肝硬化：肝硬化时，肝脏对胆汁酸代谢能力减低，血清TBA在肝硬化不一样阶段均增高，增高幅度普通高于慢性活动性肝炎。即使在肝硬化晚期亦如此。当肝病活动降至最低时，胆红素、转氨酶及碱性磷酸酶等指标转为正常，血清TBA仍维持在较高水平。4乙醇性肝病：乙醇性肝病血清TBA可增高，当乙醇性肝病(包含肝硬化)发生严重肝损伤时，血清TBA显著增高，而轻、中度损伤增高不显著。有报道认为，血清TBA测定对乙醇性肝病肝细胞损伤诊疗可信度和灵敏度远优于各种酶学检验和半乳糖耐量试验等指标，甚至提议将血清TBA再加上-氨基己糖苷酶作为乙醇性肝病诊疗指标。有些人认为，餐后60min-TBA测定对乙醇性肝病诊疗更有意义。总胆汁酸检测第8页酶比色法测定总胆汁酸 -临床意义5中毒性肝病：在中毒性肝病时血清TBA也将异常。6胆汁淤积：血清TBA测定对胆汁淤积诊疗有较高灵敏度和特异性。肝外胆管阻塞及肝内胆汁淤积包含急性肝炎、早期胆管性肝硬化、新生儿胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等均可引发TBA增高。在胆管阻塞早期，胆汁分泌降低，使血清中TBA显著增高，且在阻塞不一样阶段几乎保持不变；而血清胆红素水平则随不一样阶段而改变。胆汁淤积患者肝组织中胆汁酸含量显著高于正常人。肝外阻塞经引流缓解后，血清TBA水平快速下降，而其它指标则迟缓恢复。总胆汁酸检测第9页酶比色法测定总胆汁酸 -临床意义 全部肝病中，餐后血清TBA水平及异常率均比空腹时测定更灵敏，有些人甚至认为餐后测定TBA对各种肝病诊疗灵敏度和特异性高达100%，而同时测定空腹血清胆汁酸有40%患者在正常范围。急性肝炎是否转为慢性，连续监测餐后血清TBA能够观察慢性过程，慢性活动性肝炎是否发生纤维化改变，连续监测餐后血清TBA能够了解纤维化过程，不做肝活检即可取得肝损伤程度。总胆汁酸检测第10页酶比色法测定总胆汁酸 -注意事项因为血清中TBA含量低，样品中存在干扰物质影响相对就大，乳酸脱氢酶(LD)是主要干扰物质，由LD反应中生成NADH往往比TBA反应中生成量要大得多，所以测定前往除血清中LD影响至关主要，方法有：血清67加温30min；加草氨酸作为LD封闭剂；碱或酸处理；用丙酮酸钠抑制LD活性。上述5种方法中丙酮酸钠法最好，可免去前处理步骤，直接加入反应体系，不影响体系pH，且对反应无干扰。血清中还存在其它脱氢酶(有对应底物存在时)和还原性物质，如不除去，测定结果会偏高。据无选择40例肝功效标本测定结果来看，平均干扰相当于TBA 18mol/L，范围在5.545mol/L之间。所以自动分析设计成双试剂二步法，样品先和不加3-HSD体系孵育，使样品中干扰物质先反应，然后再加入3-HSD，开启TBA反应。总胆汁酸检测第11页酶比色法测定总胆汁酸 -注意事项脂肪酶、胆固醇(包含HDL-C、LDL-C)和甘油三酯测定试剂中均加有胆酸盐，自动分析时会引发携带污染，必须引发注意。一些先进仪器能够设定试剂针、样品针和反应杯补充清洗程序，亦可将TBA编排在上述有污染项当前测定。对一些不具备上述功效仪器，最好将TBA单批测定。试剂中加适量表面活性剂可预防甲臢 沉淀。总胆汁酸检测第12页酶比色法测定总胆汁酸（H)【方法学评价】u1手工法测定TBA需做标本、标准对照管，样品和试剂用量大，试剂价格高，费用昂贵。分析仪测定能防止以上缺点，但去干扰能力不如手工法分析。u血清TBA、尤其是正常血清TBA浓度低，因而检测灵敏度至为关键，本法测定TBA50mol/L(标本/试剂比为1：10)标准液，A500nm(1cm)为0.1左右。所以低浓度时重复性较差，对31mol/L和157mol/L样品各1份，用手工法天天上下午双份测定，测10天，结果总CV分别为5.46%和2.79%。本法线性上限为300mol/L。总胆汁酸检测第13页循环法测定胆汁酸【原理】胆汁酸被3-羟基类固醇脱氢酶及Thio-NAD+（二核苷酸氧化型）特异性地氧化，生成3-酮类固醇及Thio-NADH（二核苷酸还原型），另外，生成3-酮类固醇在3-羟基类固醇脱氢酶及还原性辅酶（NADH）存在下，生成胆汁酸和NAD+。如此循环往复从而放大微量胆汁酸量，在405nm处测定生成Thio-NADH吸光度改变，求得胆汁酸量。总胆汁酸检测第14页循环法测定胆汁酸【试剂】1试剂 硫代-NAD 2mmol/L，Goods缓冲液 200mmol/L，pH7.0。2试剂 3-HSD 15kU/L，NADH 3mmol/L,Goods缓冲液200mmol/L,pH8.0。3标准液 同比色法。【操作步骤】自动化分析法。反应类型：速率法；反应温度：37；波长：405nm(主)/660nm(次)样品3l；R200l；35min后加R50l,延迟时间1min读数时间4min。总胆汁酸检测第15页循环法测定胆汁酸【计算】TBA(mol/L)=A A测定测定2 2-A-A测定测定1 1/A/A标准标准2 2-A-A标准标准1 1CC标准标准【参考范围】40名健康成人空腹TBA为3.712.98mol/L。【注意事项】血清TBA测定酶循环法是一个经过脱氢酶-辅酶体系来循环底物方法，所以要求这种酶对硫代-NAD和NADH都应有高亲和力；反应体系pH和缓冲液应允许正反应(底物氧化)和逆反应(底物还原)都能进行；还要求硫代-NAD和NADH浓度百分比适当。这些条件使反应循环速率相当快(约100次/min),在一定反应时间内经过胆汁酸重复反应来增加硫代-NADH量,提升反应灵敏度。总胆汁酸检测第16页循环法测定胆汁酸【评价】1干扰试验结果表明 胆红素850mol/L，血红蛋白5g/L，抗坏血酸2.84mmol/L，乳酸24mmol/L，乳酸脱氢酶10 000U/L时，偏差均5%，说明几乎不存在内源性干扰,但外源性干扰如仪器携带污染一样存在,可用比色法中阐述方法排除。2本法灵敏度 TBA50mol/L(标本/试剂体积比为1：83)样品，A410nm(1cm)为0.22左右。Beckman DU-640分光光度计手工操作批内CV2.0%，总CV4.0%，日立7170自动分析仪批内CV1.5%。本法(y)与比色法(x)比较y=0.921x1.426，r=0.9982，n=64。本法线性上限180mol/L。总胆汁酸检测第17页胆汁酸在肝内合成、分泌、加工、转化。当肝细胆汁酸在肝内合成、分泌、加工、转化。当肝细胞损伤或胆道阻塞时，会引发胆汁酸代谢障碍，胞损伤或胆道阻塞时，会引发胆汁酸代谢障碍，出现血清胆汁酸增高出现血清胆汁酸增高 。所以测定血清中总胆汁酸能够作为判断肝胆系统所以测定血清中总胆汁酸能够作为判断肝胆系统正常是否主要信息。血清中正常是否主要信息。血清中TBATBA诊疗价值已得到广诊疗价值已得到广泛重视，它不但用于临床诊疗，而且还能反应病泛重视，它不但用于临床诊疗，而且还能反应病情和预计疾病预后。情和预计疾病预后。TBA 临床意义回顾临床意义回顾总胆汁酸检测第18页临床意义简述 急性肝炎时，血清急性肝炎时，血清TBATBA浓度和浓度和ALTALT活力同时升高，活力同时升高，分别在正常高限分别在正常高限3 3、4 4倍和倍和3030倍，二者呈高度正相倍，二者呈高度正相关关;慢性肝病时升高幅度虽不大，但均在正常值上慢性肝病时升高幅度虽不大，但均在正常值上限或限或2 2倍左右倍左右;肝硬化时肝硬化时ALTALT和肝功效指标未发生显和肝功效指标未发生显著改变时，血清著改变时，血清TBATBA浓度显著升高。浓度显著升高。TBATBA是反应肝是反应肝细胞损害非常灵敏指标。细胞损害非常灵敏指标。肝硬化时，血清肝硬化时，血清TBATBA比慢肝升高幅度大，而比慢肝升高幅度大，而ALTALT和和常规肝功效指标未显著改变，说明常规肝功效指标未显著改变，说明TBATBA浓度和浓度和ALTALT活力无相关关系，在肝硬化后期，活力无相关关系，在肝硬化后期，TBATBA浓度改变更浓度改变更为显著，表明为显著，表明TBATBA比比ALTALT能更敏感地反应肝硬化患能更敏感地反应肝硬化患者病情者病情。总胆汁酸检测第19页孕妇测定孕妇测定TBA主要性主要性妊娠期肝内胆汁淤积症（妊娠期肝内胆汁淤积症（ICPICP）是发生在妊娠中晚是发生在妊娠中晚期以皮肤瘙痒和黄疸为特征疾病，胆汁淤积可造期以皮肤瘙痒和黄疸为特征疾病，胆汁淤积可造成胆小管内形成胆栓，血清中成胆小管内形成胆栓，血清中TBATBA浓度升高，如不浓度升高，如不能早期诊疗及时对症处理，可引发早产、胎儿窘能早期诊疗及时对症处理，可引发早产、胎儿窘迫、死胎、新生儿死亡及产后出血等母婴不良后迫、死胎、新生儿死亡及产后出血等母婴不良后果，列入高危妊娠范围。临床对经典果，列入高危妊娠范围。临床对经典ICPICP诊疗以出诊疗以出现皮肤瘙痒或不伴黄疸，血清现皮肤瘙痒或不伴黄疸，血清TBATBA、ALTALT和和ALPALP升高升高为依据，其中为依据，其中TBATBA测定作为测定作为ICPICP敏感指标，对敏感指标，对ICPICP有有主要和早期诊疗价值。主要和早期诊疗价值。总胆汁酸检测第20页胆汁酸测定常见问题胆汁酸测定常见问题 结果出负值结果出负值 试剂正常时，此现象出现几试剂正常时，此现象出现几率应该很低；但也不能率应该很低；但也不能100%100%排除排除（尤其是标本中（尤其是标本中TBATBA含量很低时）含量很低时）定时做试剂空白校准是必要。定时做试剂空白校准是必要。总胆汁酸检测第21页 交叉污染交叉污染u多项目同时测定时，多项目同时测定时，TBATBA结果经常会偏高；单独结果经常会偏高；单独复查时，结果又正常：是当前较常见现象。这是复查时，结果又正常：是当前较常见现象。这是因为：有些试剂组分中添加了较高浓度胆酸盐因为：有些试剂组分中添加了较高浓度胆酸盐,胆酸盐含有胆汁酸反应特征胆酸盐含有胆汁酸反应特征,自动分析仪器试剂自动分析仪器试剂针引发携带污染针引发携带污染 u较多研究发觉：较多研究发觉：CHOCHO、TGTG、CrCr、UAUA试剂对试剂对TBATBA测定测定有不一样程度正干扰。有不一样程度正干扰。CrCr较轻，较轻，CHOCHO、TGTG较重，较重，UAUA最为严重。最为严重。而且不一样厂家上述项目中胆酸而且不一样厂家上述项目中胆酸盐含量也有差异。盐含量也有差异。u处理自动生化分析仪试剂针携带污染所致干扰方处理自动生化分析仪试剂针携带污染所致干扰方法有法有:安排项目次序时要求两个项目间最少要有一个非安排项目次序时要求两个项目间最少要有一个非干扰项目，或将被干扰项目放在干扰项目之前；干扰项目，或将被干扰项目放在干扰项目之前；设定试剂针、样品针和反应杯补充清洗程序设定试剂针、样品针和反应杯补充清洗程序,也可也可大大减低试剂之间交叉污染。大大减低试剂之间交叉污染。降低胆酸盐含量高试剂盒使用降低胆酸盐含量高试剂盒使用总胆汁酸检测第22页总胆汁酸检测第23页