生物制药技术专题宣讲.pptx

第三章第三章 生物制药基本技术生物制药基本技术Chapter 3 Basic Technique For Biopharmacon生物制药技术专题宣讲第1页第三章第三章 生物制药基本技术生物制药基本技术 生物制药生物制药是把生物体内含有生物活性基本物质，是把生物体内含有生物活性基本物质，保保持原来结构和功效持原来结构和功效，又能在含有各种物质，又能在含有各种物质液相或固相液相或固相中较高纯度中较高纯度分离出来。它是一项严格、细致、复杂工分离出来。它是一项严格、细致、复杂工艺过程，包括物理、化学、生物学、工程等方面知识艺过程，包括物理、化学、生物学、工程等方面知识和操作技术。和操作技术。问题：问题：1、标准化方法？、标准化方法？2、怎样发觉或研制新药？、怎样发觉或研制新药？对于一个新研制生物药品，从查阅文件开始，到探索试验、对于一个新研制生物药品，从查阅文件开始，到探索试验、条件考查（统计客观）、总结制订工艺规程、制订分析判定方条件考查（统计客观）、总结制订工艺规程、制订分析判定方法，再进行中试放大，全方面考查工艺是否成熟，是否稳定等。法，再进行中试放大，全方面考查工艺是否成熟，是否稳定等。生物制药技术专题宣讲第2页1、提取法(Extraction)2、发酵法（Zymotechnics）3、化学合成（Chemical synthesize）4、组织培养法（Tissue culture）5、当代生物技术(Modern Biotechnics):Gene engineering,Enzyme engineering,Cell engineering,protein Engineering,Fermentation engineering 基本制造方法基本制造方法第三章第三章 生物制药基本技术生物制药基本技术生物制药技术专题宣讲第3页生化制药六个阶段生化制药六个阶段 1.原料选择和预处理原料选择和预处理 2.原料粉碎原料粉碎 3.提取：从原料中经溶剂分离有效成份，制成粗品工提取：从原料中经溶剂分离有效成份，制成粗品工 艺过程。艺过程。4.纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制工艺、膜分离、结晶等步骤进行精制工艺 过程。过程。5.浓缩、干燥及保留浓缩、干燥及保留 6.制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针 剂、冻干剂、粉剂等供临床应用各种剂型。剂、冻干剂、粉剂等供临床应用各种剂型。第三章第三章 生物制药基本技术生物制药基本技术生物制药技术专题宣讲第4页 一一.Raw Material Selecting and Pretreatment 原料原料选择和预处理选择和预处理原料选择基本准则原料选择基本准则：1、在大量信息资料和实践经验基础上，选择目标原料。、在大量信息资料和实践经验基础上，选择目标原料。2、选择有效成份含量高新鲜材料；、选择有效成份含量高新鲜材料；3、起源丰富易得；、起源丰富易得；4、制造工艺简单易行；、制造工艺简单易行；5、成本比较低；、成本比较低；6、原料采集不破坏生态环境、原料采集不破坏生态环境,选择对环境友好原材料资选择对环境友好原材料资 源，预防生物入侵。源，预防生物入侵。生物制药技术专题宣讲第5页预处理方法预处理方法：1 1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。基本操作。便于贮存和运输。2 2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保留或低温保留，方便、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保留或低温保留，方便抑制微生物和酶作用。抑制微生物和酶作用。3 3、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。有利于贮存。生物制药技术专题宣讲第6页二、原料粉碎Comminution of Raw Material原料粉碎原料粉碎：在提取前先将大块原料粉碎或绞碎成适度粒度，或在提取前先将大块原料粉碎或绞碎成适度粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。提取或吸附。动物脏器组织：惯用绞肉机机械法粉碎；动物脏器组织：惯用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织：惯用磨碎法；植物肉质组织：惯用磨碎法；微生物：惯用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等微生物：惯用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等 处理方法。处理方法。生物制药技术专题宣讲第7页1.1.机械法机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。2.2.物理法物理法 A A、重复冻融法、重复冻融法：把待破碎样品冷至把待破碎样品冷至-20-20-15-15 ，使，使 之凝固，然后迟缓溶解，如此重复操作，大部分动物性之凝固，然后迟缓溶解，如此重复操作，大部分动物性 细胞及细胞内颗粒能够破碎。细胞及细胞内颗粒能够破碎。B B、冷热交替法：将材料投入沸水中，在、冷热交替法：将材料投入沸水中，在9090左右维持数左右维持数 分钟，马上置于冰浴中，使之快速冷却，绝大部分细胞分钟，马上置于冰浴中，使之快速冷却，绝大部分细胞 被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。生物制药技术专题宣讲第8页 C、超声波处理法超声波处理法：多用于微生物材料，处理效果与多用于微生物材料，处理效果与 样品浓度、使用频率有样品浓度、使用频率有 关。用大肠杆菌制备各种酶关。用大肠杆菌制备各种酶 时，惯用时，惯用50100mg/L菌体浓度，在菌体浓度，在110KC频率下频率下 处理处理1015min。操作时注意防止溶液中气泡存在。操作时注意防止溶液中气泡存在。D、加压破碎法：加气压或水压，达、加压破碎法：加气压或水压，达0.5934.32MPa (210350kgf/cm2)压力时，压力时，可使可使90%以上细胞被以上细胞被 压碎。多用于微生物酶制剂工业制备。压碎。多用于微生物酶制剂工业制备。生物制药技术专题宣讲第9页3.3.生化及化学法生化及化学法：A.A.自溶法：将新鲜生物材料存放在一定自溶法：将新鲜生物材料存放在一定pHpH和适当和适当温度下，利用组织细胞中本身酶系将细胞破坏，使温度下，利用组织细胞中本身酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来方法。自溶温度，动物材料在细胞内含物释放出来方法。自溶温度，动物材料在0-40-4 ，微生物在室温下。自溶时，需加少许防腐，微生物在室温下。自溶时，需加少许防腐剂，甲苯、氯仿，以预防外界细菌污染。剂，甲苯、氯仿，以预防外界细菌污染。*因为自溶时间较长，不易控制，故制造含有活性核酸和蛋白质时因为自溶时间较长，不易控制，故制造含有活性核酸和蛋白质时比较少用。比较少用。生物制药技术专题宣讲第10页B.溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁酶。溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁酶。多用于微生物，对蜗牛酶、纤维酶及植物细胞也适用。如多用于微生物，对蜗牛酶、纤维酶及植物细胞也适用。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采取时，采取pH8.00.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA 制成制成 2 亿亿/ml细胞悬细胞悬液，然后加液，然后加 入入100g1mg溶菌酶，在溶菌酶，在37 C保温保温10min，细菌胞壁即被破坏。细菌胞壁即被破坏。C.表面活性剂处理法：表面活性剂分子中，兼有亲脂性表面活性剂处理法：表面活性剂分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水界面张力，含有乳化、分散、增和亲水性基团，能降低水界面张力，含有乳化、分散、增溶作用。惯用有：溶作用。惯用有：SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠。、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠。生物制药技术专题宣讲第11页 三、提三、提 取取 Extraction提取：提取：也称抽提、萃取，就是利用一个溶剂对物质不一样溶也称抽提、萃取，就是利用一个溶剂对物质不一样溶解度，从化合物中分离出一个或几个组分过程。分为固体解度，从化合物中分离出一个或几个组分过程。分为固体处理（液处理（液固萃取）和液体处理（液固萃取）和液体处理（液液萃取）。液萃取）。提取条件选择提取条件选择：1 1、溶剂、溶剂:惯用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、惯用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取pHpH、温度范围、温度范围较广（较广（pH3-6,-2-40pH3-6,-2-40）。适合用于动植物和微生物原料。）。适合用于动植物和微生物原料。2 2、pH:pH:与溶解度和稳定性有很大关系，普通选择在与溶解度和稳定性有很大关系，普通选择在 pI pI 两侧。两侧。生物制药技术专题宣讲第12页3 3、温度：普通在、温度：普通在5 5 以下，但对温度耐受力较大药品，可适以下，但对温度耐受力较大药品，可适当提升温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。如胃蛋当提升温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择37-50 37-50 提取，效提取，效果很好。果很好。影响提取原因：影响提取原因：1 1、被提取物质溶解度大小：普通极性对极性；非极性对、被提取物质溶解度大小：普通极性对极性；非极性对非极性；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。非极性；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。2 2、扩散作用影响：扩散方程式、扩散作用影响：扩散方程式 G=DF*C/X*t G=DF*C/X*t 3 3、分配作用影响：分配定律、分配作用影响：分配定律 (C1/C2)(C1/C2)恒温、恒压恒温、恒压=K=K生物制药技术专题宣讲第13页四、分离纯化四、分离纯化Separation and Purification1 1、盐析法、盐析法 利用不一样蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不一样程利用不一样蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不一样程度降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度伴随盐浓度度降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度伴随盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不停升高时，不一样蛋升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不停升高时，不一样蛋白质溶解度又以不一样程度下降并先后析出沉淀，称盐析作白质溶解度又以不一样程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。用。优点优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生改变，普通在室温下操作。蛋白质不易发生改变，普通在室温下操作。缺点：缺点：分级分离能力不高。分级分离能力不高。惯用中性盐惯用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。生物制药技术专题宣讲第14页盐析时应注意几个问题：盐析时应注意几个问题：（1 1）盐饱和度：因为蛋白质结构和性质不一样，盐析要）盐饱和度：因为蛋白质结构和性质不一样，盐析要求饱和度也不一样。要按工艺要求，正确计算饱和度。求饱和度也不一样。要按工艺要求，正确计算饱和度。（2 2）pH pH 值选择：蛋白质在值选择：蛋白质在pIpI时溶解度最小。所以，进时溶解度最小。所以，进行盐析时行盐析时pHpH，要选择在被分离蛋白质，要选择在被分离蛋白质pI pI 附近。附近。（3 3）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其它沉淀，使用盐饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其它蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望。选择适当蛋白质浓蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望。选择适当蛋白质浓度，可防止共沉干扰。度，可防止共沉干扰。生物制药技术专题宣讲第15页（4 4）温度：普通在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。）温度：普通在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感，要在低温下进行。但对温度敏感，要在低温下进行。常在常在0-4 0-4 范围内快速操作。范围内快速操作。如尿激酶。如尿激酶。（5 5）盐析沉淀物脱盐：盐析沉淀分离后，经脱盐才能取得）盐析沉淀物脱盐：盐析沉淀分离后，经脱盐才能取得纯品。最惯用脱盐方法是透析，时间普通较长，应常换透析纯品。最惯用脱盐方法是透析，时间普通较长，应常换透析液，注意预防污辱。液，注意预防污辱。2 2、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 利用不一样蛋白质在不一样浓度有机溶剂中溶解度差异利用不一样蛋白质在不一样浓度有机溶剂中溶解度差异而分离目标蛋白质方法。蛋白质沉淀与溶解，与溶剂介电常而分离目标蛋白质方法。蛋白质沉淀与溶解，与溶剂介电常数相关。降低溶液介电常数，使其溶解度变小，同时，还破数相关。降低溶液介电常数，使其溶解度变小，同时，还破坏蛋白质水化膜而使蛋白质沉淀析出。坏蛋白质水化膜而使蛋白质沉淀析出。生物制药技术专题宣讲第16页几个溶剂介电常数几个溶剂介电常数溶剂名称溶剂名称 20 时介电常数时介电常数 溶剂名称溶剂名称 20 时介电常数时介电常数 乙醚乙醚 4.33 甲醇甲醇 33 丙酮丙酮 21.4 水水 80 乙醇乙醇 24 2.5mol/L甘氨酸水溶液甘氨酸水溶液 137介电常数与静电力关系：介电常数与静电力关系：F=Q1Q2/Kr2 式中：式中：K介电常数。指带相反电荷微粒之间静电引力。介电常数。指带相反电荷微粒之间静电引力。F相距为相距为r2个带电量分别为个带电量分别为Q1、Q2点电荷相互作用静电引力。点电荷相互作用静电引力。经验经验：如：如30-40%乙醇沉淀物质，改用丙酮时，其体积分数可降低乙醇沉淀物质，改用丙酮时，其体积分数可降低10%左右。即可用左右。即可用 2030%丙酮；丙酮；而而70-80%乙醇沉淀物质，可用乙醇沉淀物质，可用5060%丙酮即可。丙酮即可。注：水有较高介电常数，含有很好溶剂性能，是一个广谱溶剂。有机溶剂法比注：水有较高介电常数，含有很好溶剂性能，是一个广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引发失活盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引发失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。生物制药技术专题宣讲第17页有机沉淀法应注意问题有机沉淀法应注意问题：（1 1）控制工艺过程温度：整个操作过程应在低温下进行，）控制工艺过程温度：整个操作过程应在低温下进行，而且最好是同一温度。而且最好是同一温度。（2 2）预防溶剂局部浓度过高：加入有机溶剂时搅拌要均）预防溶剂局部浓度过高：加入有机溶剂时搅拌要均匀，速度要适当，防止局部浓度过高，引发沉淀物破坏、匀，速度要适当，防止局部浓度过高，引发沉淀物破坏、变性或失活。变性或失活。（3 3）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要马上）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要马上用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂浓度。用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂浓度。（4 4）pHpH选择：在待沉淀蛋白质选择：在待沉淀蛋白质pIpI附近。附近。（5 5）有机溶剂是酶和蛋白质变性原因，尤其是对敏感酶）有机溶剂是酶和蛋白质变性原因，尤其是对敏感酶类。类。生物制药技术专题宣讲第18页3 3、等电点沉淀法、等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又含利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又含有不一样等电点特征进行分离工艺过程。有不一样等电点特征进行分离工艺过程。因为各种蛋白质在等电点时，仍有一定溶解度而沉淀不因为各种蛋白质在等电点时，仍有一定溶解度而沉淀不完全，多数蛋白质等电点又都十分靠近，所以单独使用效果完全，多数蛋白质等电点又都十分靠近，所以单独使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。生物制药技术专题宣讲第19页4 4、膜分离法、膜分离法 膜分离技术包含膜分离技术包含超滤超滤、反渗透析反渗透析、电渗析、电渗析、微孔过滤微孔过滤、气体渗析和气体渗析和超精密过滤超精密过滤。（1 1）超滤：依据溶质分子和悬浮粒子是否经过多孔膜来）超滤：依据溶质分子和悬浮粒子是否经过多孔膜来进行筛分。在液压驱动下，能经过超滤膜分离粒子范围，进行筛分。在液压驱动下，能经过超滤膜分离粒子范围，普通在普通在0.0010.01m0.0010.01m。即利用一个特制膜对溶液中各种。即利用一个特制膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤。溶质分子进行选择性过滤。优点优点：成本低、操作方便、条件温和、能很好地保持药品：成本低、操作方便、条件温和、能很好地保持药品活性、回收率高。适合用于酶和蛋白质药品分离、浓缩、活性、回收率高。适合用于酶和蛋白质药品分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。生物制药技术专题宣讲第20页（2 2）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超出溶液渗）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超出溶液渗透压力情况下，使溶液中溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻透压力情况下，使溶液中溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透截在膜前。这一过程类似于渗透,但方向相反，即溶剂从高浓度但方向相反，即溶剂从高浓度一侧传递到浓度低一侧，故称反渗透。一侧传递到浓度低一侧，故称反渗透。特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。（3 3）微孔滤膜：由高分子材料制成薄膜过滤介质，能够过滤普）微孔滤膜：由高分子材料制成薄膜过滤介质，能够过滤普通介质不能截留细菌和微粒。膜孔径在通介质不能截留细菌和微粒。膜孔径在0.2-10 m0.2-10 m。（4 4）超精密过滤：以聚乙烯醇为主体中空多孔滤膜，分级性能）超精密过滤：以聚乙烯醇为主体中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间。为在超滤膜与微孔滤膜之间。为0.010.2 m0.010.2 m。用于水精制、循环。用于水精制、循环水净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液精制。水净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液精制。生物制药技术专题宣讲第21页 5 5、离子交换层析、离子交换层析 采取不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各采取不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各种生化物质。种生化物质。基本原理：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中基本原理：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中极性基团（活性基团），含有可扩散离子，能与溶液中离子极性基团（活性基团），含有可扩散离子，能与溶液中离子起交换作用；非极性基团作为树脂骨架，使树脂不溶于水并起交换作用；非极性基团作为树脂骨架，使树脂不溶于水并含有网状结构，为离子交换进行及溶液和树脂分离创造了条含有网状结构，为离子交换进行及溶液和树脂分离创造了条件。离子交换层析包含吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、件。离子交换层析包含吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程。离子亲和力等物理化学过程。生物制药技术专题宣讲第22页树脂种类和理化性能：树脂种类和理化性能：（1 1）强酸性阳离子交换树脂：功效团为磺酸基，）强酸性阳离子交换树脂：功效团为磺酸基，pHpH普通普通没有限制。没有限制。（2 2）弱酸性阳离子交换树脂：功效团为羧基、酚基。在）弱酸性阳离子交换树脂：功效团为羧基、酚基。在酸性溶液中不发生交换，酸性溶液中不发生交换，pHpH愈大交换能力愈强。愈大交换能力愈强。（3 3）强碱性阴离子交换树脂：功效团为三甲基季胺基团。）强碱性阴离子交换树脂：功效团为三甲基季胺基团。pHpH没有限制。没有限制。（4 4）弱酸性阴离子交换树脂：功效团为伯胺基、仲胺基、）弱酸性阴离子交换树脂：功效团为伯胺基、仲胺基、叔胺基。叔胺基。pH pH愈低交换能力愈大。愈低交换能力愈大。生物制药技术专题宣讲第23页 影响交换速度原因：影响交换速度原因：（1 1）树脂颗粒大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和）树脂颗粒大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和外部扩散。外部扩散。（2 2）搅拌和流速：加紧搅拌速度或加大液体流速，都能）搅拌和流速：加紧搅拌速度或加大液体流速，都能降低树脂外液膜厚度，从而使液相扩散速度增加。降低树脂外液膜厚度，从而使液相扩散速度增加。（3 3）离子浓度：交换速度随离子浓度上升而增加，到达）离子浓度：交换速度随离子浓度上升而增加，到达一定浓度后交换速度不在升高。一定浓度后交换速度不在升高。（4 4）离子水化半径：水化半径小易被吸附。）离子水化半径：水化半径小易被吸附。（5 5）树脂酸碱性强弱和溶液）树脂酸碱性强弱和溶液pHpH：生物制药技术专题宣讲第24页（6 6）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度愈）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度愈快。但交联度小树脂选择性较差。快。但交联度小树脂选择性较差。（7 7）有机溶剂影响：当有有机溶剂存在时，会降低树脂）有机溶剂影响：当有有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子选择性，而轻易吸附无机离子。对有机离子选择性，而轻易吸附无机离子。6 6、凝胶层析、凝胶层析 指化合物随流动相流经装有凝胶固定相层析柱时，因其各指化合物随流动相流经装有凝胶固定相层析柱时，因其各种物质分子大小不一样而被分离技术。又称凝胶过滤、凝胶种物质分子大小不一样而被分离技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓解，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无离条件缓解，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无需再生处理。需再生处理。生物制药技术专题宣讲第25页 缺点：分离速度慢。缺点：分离速度慢。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药品。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药品。几个惯用凝胶：几个惯用凝胶：（1 1）葡聚糖凝胶：基本骨架是）葡聚糖凝胶：基本骨架是1616糖苷键。由葡聚糖和甘糖苷键。由葡聚糖和甘油以醚桥形式交联而成网状结构。最著名商品为油以醚桥形式交联而成网状结构。最著名商品为SephadexSephadex葡葡聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。低温时，在碱和盐溶液。低温时，在0.1mol/L 0.1mol/L 盐酸中保持盐酸中保持1-2h1-2h不改变性不改变性质；室温时，在质；室温时，在 0.01mol/L 0.01mol/L 盐酸中放置六个月也不改变；在盐酸中放置六个月也不改变；在0.25mol/L 0.25mol/L 氢氧化钠中，氢氧化钠中，60 60 两个月没有发改变。可在两个月没有发改变。可在120120 加热加热 30min 30min 灭菌而不破坏，但高于灭菌而不破坏，但高于 120 120 即变黄。即变黄。湿状贮存易发霉，若长久不用，需加防腐剂。湿状贮存易发霉，若长久不用，需加防腐剂。生物制药技术专题宣讲第26页（2 2）聚丙烯酰胺凝胶：由碳）聚丙烯酰胺凝胶：由碳碳骨架组成。完全为惰性。碳骨架组成。完全为惰性。稳定性比葡聚糖凝胶好，洗脱时不会有凝胶物质下来。稳定性比葡聚糖凝胶好，洗脱时不会有凝胶物质下来。缺点：不耐酸。遇酸时酰胺键会水解为羧基，使凝胶带缺点：不耐酸。遇酸时酰胺键会水解为羧基，使凝胶带有一定离子交换基团。有一定离子交换基团。（3 3）琼脂糖凝胶：天然凝胶，不是共价交联，是以氢）琼脂糖凝胶：天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联。空隙度以契纸糖浓度来改变，化学稳定性不如葡键交联。空隙度以契纸糖浓度来改变，化学稳定性不如葡聚糖凝胶。没有干凝胶，必须在溶胀状态保留，遇脱水剂、聚糖凝胶。没有干凝胶，必须在溶胀状态保留，遇脱水剂、冷冻和一些有机溶剂即破坏，丙酮和乙醇对它无影响。在冷冻和一些有机溶剂即破坏，丙酮和乙醇对它无影响。在pH 4.5-9,pH 4.5-9,温度温度0-40 0-40 稳定。对硼酸有吸附，不能用硼酸稳定。对硼酸有吸附，不能用硼酸缓冲液。他能分离及万到几千万相对分子质量物质，填补缓冲液。他能分离及万到几千万相对分子质量物质，填补了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶不足。了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶不足。瑞典商品名瑞典商品名SepharoseSepharose，美国称生物凝胶，美国称生物凝胶AA（Bio-Bio-Gel-AGel-A）,英国称英国称Sagavac.Sagavac.生物制药技术专题宣讲第27页 (4)4)疏水性凝胶：惯用为聚甲基丙烯酸酯疏水性凝胶：惯用为聚甲基丙烯酸酯（PolymethacrylatePolymethacrylate）凝胶、聚苯乙烯凝胶（如）凝胶、聚苯乙烯凝胶（如Styrogel,Styrogel,Bio-Beads-SBio-Beads-S）7 7、亲和层析、亲和层析 生物活性物质都有亲和作用，如酶与底物、激素与受体、生物活性物质都有亲和作用，如酶与底物、激素与受体、核酸互补链间，多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物核酸互补链间，多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物大分子特异亲和力而设计层析技术。可逆结合特异性物质称大分子特异亲和力而设计层析技术。可逆结合特异性物质称为配基，与配基结合层析介质称为载体。为配基，与配基结合层析介质称为载体。亲和层析亲和层析能从粗提液中，经过一次简便处理，便可得到高纯度活性物能从粗提液中，经过一次简便处理，便可得到高纯度活性物质，既可分离一些生物材料中含量极微物质，又能分离一些质，既可分离一些生物材料中含量极微物质，又能分离一些性质十分相同物质。性质十分相同物质。生物制药技术专题宣讲第28页优点优点：设备要求不高，操作简便，适用范围广，特异性强，：设备要求不高，操作简便，适用范围广，特异性强，分离速度快，效果好，条件温和。分离速度快，效果好，条件温和。缺点缺点：通用性较差，洗脱条件要求苛刻。：通用性较差，洗脱条件要求苛刻。几个惯用载体几个惯用载体：（1 1）纤维素：自然界中数量最大大分子生物材料，取材）纤维素：自然界中数量最大大分子生物材料，取材十分方便。但因为其结构紧密、均一性差，不利于大分子十分方便。但因为其结构紧密、均一性差，不利于大分子渗透。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间渗透。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。当前主要用于分位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。当前主要用于分离与核酸相关物质。如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固离与核酸相关物质。如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中定相分离细胞提取液中mRNA.mRNA.市售商品有市售商品有：无定型微纤维、微晶纤维素、珠状纤维素。：无定型微纤维、微晶纤维素、珠状纤维素。生物制药技术专题宣讲第29页（2 2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析主要为交联珠状凝胶。其琼脂）琼脂糖凝胶：用于亲和层析主要为交联珠状凝胶。其琼脂糖质量浓度为糖质量浓度为20g/L(2%)20g/L(2%)、40g/L(4%)40g/L(4%)、60g/L(6%)60g/L(6%)几个，对应商几个，对应商品称为品称为Sepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B(Pharmacia)6B(Pharmacia)和和Ultrogels A-2,A-Ultrogels A-2,A-4,A-6)4,A-6)。这类载体能使吸附物质保持活性，能快速活化并接上。这类载体能使吸附物质保持活性，能快速活化并接上各种功效基团，结构疏松孔径大，流速快。各种功效基团，结构疏松孔径大，流速快。（3 3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，尤其是经配）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，尤其是经配基偶联后，凝胶膨胀度会深入边小，所以应用受到限制。基偶联后，凝胶膨胀度会深入边小，所以应用受到限制。（4 4）聚丙烯酰胺凝胶：碳）聚丙烯酰胺凝胶：碳碳骨架，有丙烯酰胺和甲叉双丙烯碳骨架，有丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，含有网状三维空间结构。商品名为酰胺聚合而成，含有网状三维空间结构。商品名为Biogel PBiogel P。注意防止接触强氧化剂，配基偶联后会使它网格缩小，在一定注意防止接触强氧化剂，配基偶联后会使它网格缩小，在一定程度上限制了它应用。程度上限制了它应用。生物制药技术专题宣讲第30页（5 5）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵抗酶及微生物作用，还能耐受高温灭菌和较猛烈反但能抵抗酶及微生物作用，还能耐受高温灭菌和较猛烈反应条件。应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接化学活性基团也少。异性吸附，而且可供连接化学活性基团也少。改良方法：为了克服其缺点，市售改良方法：为了克服其缺点，市售Bio-GlassBio-Glass商品都已事商品都已事先连接了氨烷基（烷基胺）。用葡聚糖包被玻璃珠，则可先连接了氨烷基（烷基胺）。用葡聚糖包被玻璃珠，则可改进其亲水性，并增加化学活性基团。用抗原涂布玻璃珠改进其亲水性，并增加化学活性基团。用抗原涂布玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNADNA连接玻璃珠上纯化了连接玻璃珠上纯化了大肠杆菌大肠杆菌DNADNA和和RNARNA聚合酶。聚合酶。生物制药技术专题宣讲第31页（6 6）其它载体：）其它载体：由聚丙烯酰胺和琼脂糖混合组成载体，商品名为Ultrogels ACA。它特点是载体上现有羟基又有酰胺基，而且都能与配基单独作用。但不能接触强碱，以免酰胺水解，使用温度不超出40 C。在丙烯酰胺和琼脂糖混合胶中加入7%四氧化三铁，则可制得一个称为磁性胶（Magnogels ACA44）载体。当悬浮液中含有不均匀粒子时，依靠磁性能将载体与其它粒子分离。磁性胶载体惯用于酶免疫测定、荧光免疫测定、放射免疫测定、免疫吸收剂和细胞分离等微量测定和制备。生物制药技术专题宣讲第32页影响吸附亲和力几个原因影响吸附亲和力几个原因：（1 1）配基浓度；）配基浓度；（2 2）空间障碍；）空间障碍；（3 3）配基与载体结合位点；）配基与载体结合位点；（4 4）载体孔径；）载体孔径；（5 5）微环境（化学原因）。）微环境（化学原因）。生物制药技术专题宣讲第33页Concentration 浓缩浓缩浓缩：低浓度溶液经过除去熔剂边为高浓度溶液过程。常在浓缩：低浓度溶液经过除去熔剂边为高浓度溶液过程。常在提取后和结晶前进行，有时也贯通与整个制药过程。提取后和结晶前进行，有时也贯通与整个制药过程。蒸发装置设计原理：加热、扩大液体表面积、低压。蒸发装置设计原理：加热、扩大液体表面积、低压。薄膜蒸发浓缩薄膜蒸发浓缩Film evaporation concentration Film evaporation concentration 卧式喷淋卧式喷淋降膜蒸发器、降膜蒸发器、RoseRose蒸发器、板式蒸发器蒸发器、板式蒸发器减压蒸发浓缩减压蒸发浓缩Decompression evaporation concentration Decompression evaporation concentration 减压抽真空（真空浓缩），适用不耐热药品和制品。减压抽真空（真空浓缩），适用不耐热药品和制品。薄膜蒸发流程图薄膜蒸发流程图生物制药技术专题宣讲第34页 吸收浓缩吸收浓缩Absorbing concentration 经过吸收剂直接吸收除去溶液中溶剂分子使溶液浓缩方法。吸收剂与溶液不起化学反应，对生化药品不起吸附作用，易与溶液分开。吸附剂除去溶剂后可重复使用。惯用吸收剂惯用吸收剂：聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝胶。凝胶可直接投入待浓缩溶液中，溶剂和小分子被吸收到凝胶内，大分子留在溶液中，然后离心过滤。使用聚乙二醇时，先将溶液装入半透膜袋内，扎紧袋口，外加聚乙二醇覆盖，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇吸去。生物制药技术专题宣讲第35页 Crystallization 结晶结晶结晶结晶：利用一些药品含有形成晶体性质是目标药品（溶质）呈晶态从溶液中析出过程。结晶条件结晶条件：（1）纯度purity：各种物质在溶液中均需到达一定纯度才能析出结晶。蛋白质和酶，纯度不低于50%。总趋势是越纯越易结晶，但已结晶制品不表示到达了绝正确纯化，只能说到了相当纯程度。有时纯度不高，但加入有机溶剂和制成盐，也能到达结晶。生物制药技术专题宣讲第36页（2）浓度consideration：结晶液浓度要较高，以利于分子间碰撞聚合。但浓度过高，对应杂质和溶液黏度增大，反而不利于结晶，或生成纯度较差粉末结晶。（3）pH：选择pH在pI附近，有利于晶体析出。（4）温度 temperature：通常在低温条件进行，活性物质不易变性，又可防止细菌繁殖。（5）时间Time：结晶生成和生长需要时间。但生物药品要求在几小时内完成，时间不宜过长。（6）晶种 Crystal seed：不易结晶药品常加晶种。生物制药技术专题宣讲第37页干干 燥燥 Desiccation干燥干燥：是从湿固体生物药品中，除去水分或溶剂而取得相对或绝对干燥制品工艺过程。它也是一个蒸发，但不一样于浓缩。通常包含原料药干燥和制成临床制剂干燥。（1）常压干燥 Normal press desiccation：通风与加热结合。成本低干燥量大。但时间长，易污染。（2）减压干燥 Decompression desiccation：利用专用设备减压加速，使溶剂快速蒸发。时间短，温度低。制药惯用方法。生物制药技术专题宣讲第38页（3）喷雾干燥 Spray desiccation：将液体经过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速热气流中，快速蒸发干燥方法。从理论推算：每升液体，假如喷成10m直径雾滴，约有1.91*1012多个，表面积有600m2。试验表明：把含水量为80%1L溶液，喷成直径约10-60 m雾滴，当与热空气接触时，仅3-5s可使雾滴水分气化而得到干燥产品。优点优点：快速高效，可在无菌条件下操作，应用广泛。缺点缺点：热利用率不高，设备费用投资大。生物制药技术专题宣讲第39页 （4）冷冻干燥Freezing desiccation：在低温（-60-10 ）及高真空6.67-40Pa（0.05-0.3mmHg）下，将物料与溶液中水分直接升华干燥方法。适合用于高度热敏生物药品。制剂应含有多孔性、疏松、易溶特点，普通含水量在1%-3%。设备投资及维护费用高，生产能力不大。改进干燥设备改进干燥设备 环型喷射干燥器 振动流动干燥器 涡流干燥器生物制药技术专题宣讲第40页Sterilization 灭菌灭菌灭菌：指杀灭或除去一切微生物操作技术。干热空气灭菌干热空气灭菌：通常在烘箱里利用热空气杀灭微生物，在100，1h可杀死繁殖细菌。但一些细菌在一定情况下能够变成芽孢，有较强耐热力，普通需160-170 灭菌1h以上或140 灭菌3h以上。灭菌时间应自全部进行灭菌物品到达灭菌温度时算起。待灭菌物品温度常落后于烘箱室温度，尤其是导热性能差或装量大待灭菌物品。要确保灭菌完全，应测定温度延后时间，将延后时间考虑到要求灭菌时间内。生物制药技术专题宣讲第41页湿热灭菌湿热灭菌：常压灭菌常压灭菌，即在常压下用100 流通蒸汽或在水内煮沸来杀灭细菌。减压灭菌减压灭菌：在热压灭菌器中，用超出101.325kPa饱和蒸汽杀灭细菌。热压灭菌所需温度、相对压力和时间热压灭菌所需温度、相对