液质联用基础知识（Waters中国培训中心）.pdf

Waters 中国有限公司培训中心中国有限公司培训中心液质联用基础知识2005 Waters Corporation什么是质谱什么是质谱(Mass Spectrum)?不同质荷比的离子经质量分析器分离不同质荷比的离子经质量分析器分离,而后被检测并记录下来的谱图叫作质谱图而后被检测并记录下来的谱图叫作质谱图.简称质谱简称质谱?质谱图的横坐标是质荷比质谱图的横坐标是质荷比(m/z)，纵坐标是离子强度，纵坐标是离子强度?质谱法质谱法(Mass Spectrometry)即质谱分析法即质谱分析法,一般亦简称为质谱一般亦简称为质谱2005 Waters Corporation氯霉素的质谱图氯霉素的质谱图M-H-=321.32005 Waters CorporationMS 检测的是离子质量检测的是离子质量2005 Waters Corporation质谱基础知识质谱基础知识?质谱中采用的质量单位质谱中采用的质量单位 Da=Dalton(道尔顿道尔顿)质量单位质量单位,等于一个碳原子等于一个碳原子(12C)质量的十二分之一，约为质量的十二分之一，约为1.6610-24克克;一克约为一克约为610 23道尔顿道尔顿 amu=atomic mass unit,原子质量单位原子质量单位1amu=1Da2005 Waters Corporation质谱基础知识质谱基础知识?同位素同位素:具有相同的原子序数而又具有不同的质量数具有相同的原子序数而又具有不同的质量数的原子叫作同位素的原子叫作同位素?同位素丰度同位素丰度:自然界中某同位素原子所占的百分数叫做该同自然界中某同位素原子所占的百分数叫做该同位素的天然丰度位素的天然丰度2005 Waters Corporation同位素表示法同位素表示法?质量数质量数=质子质子+中子中子C126C136原子序数原子序数=质子数质子数?具有相同的元素符号具有相同的元素符号,在元素符号的左上角表明其质量数在元素符号的左上角表明其质量数2005 Waters Corporation天然同位素丰度天然同位素丰度氮氮14N 14.0031 99.6415N 15.0001 0.36硫硫32S31.972195.033S32.97150.7634S33.96794.22氯氯35Cl34.968975.7737Cl36.9659 24.23溴溴79Br78.918350.6981Br80.916349.31 原子符号质量原子符号质量,amu%天然丰度天然丰度2005 Waters Corporation怎样计算质量数怎样计算质量数?名义质量数名义质量数 采用元素质量数的整数进行计算采用元素质量数的整数进行计算,例如例如:C=12,H=1,O=16?单同位素质量数或准确质量数单同位素质量数或准确质量数 用丰度最大的同位素准确质量数计算用丰度最大的同位素准确质量数计算 例如：12例如：12C=12，1H=1.0078，16O=15.9948?平均质量数或化学质量数平均质量数或化学质量数 考虑到所有天然同位素丰度的该元素原子量来计算考虑到所有天然同位素丰度的该元素原子量来计算 例如：例如：C=12.001，H=1.00794，O=15.9994?质谱获得的单电荷离子的质谱获得的单电荷离子的m/z值，是单同位素质量数值，是单同位素质量数2005 Waters CorporationMS分子量的计算分子量的计算?利血平利血平,C33H40N2O9,的的MW的计算的计算使用原子量使用原子量:使用单一同位素质量使用单一同位素质量:C:33 x 12.011=396.363 C:33 x 12.0000=396.000 H:40 x 1.0079=40.316 H:40 x 1.0078=40.312 N:2 x 14.0067=28.013 N:2 x 14.0031=28.006 O:9 x 15.9994=143.995 O:9 x 15.9949=143.954 608.687 608.2722005 Waters Corporation质谱名词与术语质谱名词与术语?质荷比质荷比(mass charge ratio):离子的质量离子的质量(以相对原子量单位计以相对原子量单位计)与它所带电荷与它所带电荷(以电子电量为单位计以电子电量为单位计)的比值的比值,叫作质荷比叫作质荷比,简写为简写为m/z?质荷比是质谱图的横坐标质荷比是质谱图的横坐标?质荷比是质谱定性分析的基础质荷比是质谱定性分析的基础2005 Waters Corporation质谱名词与术语质谱名词与术语?离子丰度离子丰度(Abundance of ions):检测器检测到的离子信号强度检测器检测到的离子信号强度?离子相对丰度离子相对丰度(Relative abundance of ions):以质谱图中指定质荷比范围内最强峰以质谱图中指定质荷比范围内最强峰(基峰基峰)的强度为的强度为100,其它离子峰对其归一化所得的强度其它离子峰对其归一化所得的强度?标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标谱峰的离子丰度与物质的含量相关谱峰的离子丰度与物质的含量相关,因此是质谱定量的基础因此是质谱定量的基础2005 Waters CorporationMS是高真空技术是高真空技术?质谱仪之所以在高真空下工作是为了质谱仪之所以在高真空下工作是为了.尽量减少离子尽量减少离子-分子之间的碰撞分子之间的碰撞(即即,得到最大平均自由程得到最大平均自由程)?碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通道碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通道?碰撞可能导致产生意外的离子或反应碰撞可能导致产生意外的离子或反应?平均自由程平均自由程:1 atm10-6m;10-4torr 0.5 m 防止在高电压防止在高电压(用于某些离子聚焦用于某些离子聚焦)下生成电弧下生成电弧 减少污染减少污染/化学噪音化学噪音2005 Waters CorporationMS的历史的历史?1910年世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥年世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥Cavendish实验室出现实验室出现?1917年电喷雾年电喷雾(Electrospray)物理现象被发现物理现象被发现(并非并非为了为了 MS)?1918年世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥年世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥大学实验室出现大学实验室出现(扇型磁场扇型磁场MS)?1943年世界上第一台商业质谱仪年世界上第一台商业质谱仪?1953年四极杆质量分析器质谱仪年四极杆质量分析器质谱仪?1955年飞行时间质量分析器质谱仪年飞行时间质量分析器质谱仪?1960s 开发开发GC/MS2005 Waters CorporationMS的历史的历史?60s-70s 大气压电离大气压电离(APcI)源被发现源被发现(但并未被广泛但并未被广泛应用应用)?70s-80s 开始广泛研究开始广泛研究 LC/MS?1979年传送带式年传送带式 LC/MS 接口成为商业产品接口成为商业产品?1982年离子束年离子束LC/MS接口出现接口出现?1984年第一台电喷雾年第一台电喷雾 MS仪宣告诞生仪宣告诞生?1988年电喷雾离子源年电喷雾离子源 MS 首次应用于蛋白质的分析首次应用于蛋白质的分析?.2005 Waters Corporation质谱的分类质谱的分类?按离子源的种类分按离子源的种类分 EI(电子轰击源电子轰击源)质谱质谱(常用于常用于GC-MS系统系统)API(大气压电离源大气压电离源)质谱质谱(常用于常用于LC-MS系统系统)MALDI(基质辅助激光解吸电离源基质辅助激光解吸电离源)质谱质谱(常用于生物大分子分析常用于生物大分子分析)?按质量分析器的种类分按质量分析器的种类分 四极杆四极杆(Quadrupole)质谱质谱 离子阱离子阱(Ion Trap)质谱质谱 飞行时间飞行时间(Time of Flight,TOF)质谱质谱 扇形磁场扇形磁场(Magnetic Sector)质谱质谱 2005 Waters Corporation什么是液质联用什么是液质联用(LC/MS)LC/MS=LC+MS2005 Waters CorporationLC/MS中的液相色谱中的液相色谱?High Performance Liquid Chromatography(HPLC)-高效液相色谱高效液相色谱?Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)-超高效液相色谱超高效液相色谱 液质联用的前提和基础液质联用的前提和基础=进样进样+分离分离 根据化合物的化学特性分离样品根据化合物的化学特性分离样品(比如极性化合物，非极性化合物，酸性化合物，碱性化合物等等比如极性化合物，非极性化合物，酸性化合物，碱性化合物等等)?LC的特点的特点:分离技术分离技术 分离效率高分离效率高 流动相参与分离流动相参与分离 连续流出连续流出,峰宽有限峰宽有限 有时需要使用缓冲盐提高分离度有时需要使用缓冲盐提高分离度 高压环境工作高压环境工作(1000 psi)2005 Waters CorporationLC/MS中的质谱中的质谱?Mass Spectrometry-质谱质谱 质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱 分析物被转化为气相离子而被分析分析物被转化为气相离子而被分析 这些离子按其质荷比这些离子按其质荷比(m/z)被分离而被检测被分离而被检测 质谱图即是相关的离子流对质谱图即是相关的离子流对m/z的图的图?MS的特点的特点 灵敏度高灵敏度高 定性定性/定量定量 脉冲扫描采集数据脉冲扫描采集数据 高真空环境工作高真空环境工作 溶剂参与反应溶剂参与反应(API电离源电离源)2005 Waters CorporationLC/MS 数据形式数据形式HO HOOO HO HG a m a b u f o t a lin (III)m/z1001502002503003509110712314517519132379201341402384366M-18M+M-36M-79M-162241TIC保留时间TIC色谱色谱2005 Waters Corporation为什么使用为什么使用 LC/MS?丰富的结构信息丰富的结构信息(1)Min12141618202224262830124357500600700800695100 200 300 400 500 600 700 800219.0696.7EIHOCH CH O222COCH CH 22NHCONaugardAPI2005 Waters Corporation为什么使用为什么使用 LC/MS?极高的灵敏度极高的灵敏度(2)2005 Waters Corporation为什么使用为什么使用 LC/MS?极佳的定量结果极佳的定量结果(3)5 个数量级的动态线性范围个数量级的动态线性范围(0.1pg-1000pg)实验系数实验系数=0.9975,样品样品:磺胺二甲氧哒嗪上柱分析磺胺二甲氧哒嗪上柱分析2005 Waters Corporation为什么使用为什么使用 LC/MS?进一步增加进一步增加HPLC的分离能力的分离能力(4)如果让您来选择，您满意那一种分离度?如果让您来选择，您满意那一种分离度?2005 Waters Corporation为什么使用为什么使用 LC/MS?解决无解决无UV吸收样品分析问题吸收样品分析问题(5)LC_MS_OK5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00Time0100%0100%TaiyuanLC_MS52:Diode Array 254 1.00Da1.71e6x36TaiyuanLC_MS51:Scan AP+BPI8.29e45.844.812.912.272.044.007.229.1211.599.9814.8713.1519.1217.4025.1621.42 22.5233.7833.3228.8426.8235.0438.2639.522005 Waters Corporation两种两种 LC/MS 系统示意图系统示意图液质联用接口至真空液质联用接口至真空离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器离子源离子源液质联用接口至真空液质联用接口至真空质量分析器质量分析器检测器检测器高真空部分高真空部分EI电离源电离源样品引入样品引入高真空部分高真空部分样品引入样品引入API电离源电离源2005 Waters CorporationLC/MS联用的难点联用的难点?LC/MS 接口必须使接口必须使LC流出的液流达到流出的液流达到 MS 可接受的压可接受的压力力(10-5-10-6torr)同时以极小的谱带展宽尽可能多地输同时以极小的谱带展宽尽可能多地输送样品离子到送样品离子到MS进样方式比较对真空泵的要求进样方式比较对真空泵的要求*(liters/sec)毛细管毛细管 GC,1mL/min(气体气体)400微柱微柱 LC,10 L/min5,000填充柱填充柱 LC,1 mL/min50,000*为了保持为了保持 3 x 10-6torr(4 x 10-6mbar)的真空的真空2005 Waters CorporationLC/MS联用关键技术接口联用关键技术接口?液相色谱的出口情况液相色谱的出口情况:从液相色谱流出的组分存在于大气压条件下的溶液之中从液相色谱流出的组分存在于大气压条件下的溶液之中?质谱的入口情况质谱的入口情况:在高真空工作条件下的质谱仅接受气相离子在高真空工作条件下的质谱仅接受气相离子?因此液质联用的接口必须完成因此液质联用的接口必须完成三个转变三个转变:物态转变物态转变:液态液态-气态气态 带电状态带电状态:“中性中性”-离子离子 真空变化真空变化:760 torr-10-510-8torr(乇乇)?要求要求:雾化雾化,去溶剂和电离同时完成去溶剂和电离同时完成2005 Waters CorporationAPI LC/MS 的的 Z-Spray接口接口2005 Waters CorporationZ-Spray 接口技术接口技术苯海拉明苯海拉明,10mM 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液第第 1 次进样次进样第第 509次进样次进样25小时小时2005 Waters CorporationMS的电离技术的电离技术HPLCHPLC离子源离子源分析器分析器检测器检测器数据处理数据处理离子化质子过滤器离子检测器质谱图离子化质子过滤器离子检测器质谱图接口接口色谱分离色谱分离样品引入样品引入数据采集及控制数据采集及控制质量过滤器质量过滤器样品引入样品引入2005 Waters Corporation质谱的种类及相关联用技术质谱的种类及相关联用技术GCLCCEFlow InjProbeFB/EIESIAPCITSPFABMALDIQuadrupoleMagnetic SectorTime of FlightIon TrapFT-MSElectron MultiplierPhotomultiplierMicrochannel PlateTurbo Mechanical离子分离模式离子分离模式质量分析器质量分析器离子检测离子检测数据的采集及处理数据的采集及处理样品的引入模式样品的引入模式溶剂的去除或抽真空方式溶剂的去除或抽真空方式质子化模式质子化模式2005 Waters Corporation同一个样品的质谱图可能不一样同一个样品的质谱图可能不一样Sample Description80859095100105110115120125130135140145150m/z0100%SALICYLAMIDE 1(0.067)Cn(Cen,2,80.00,Ar)Scan ES+1.19e8138.0137.0121.2100.290.188.185.293.995.8114.0110.2102.0133.0123.9138.9143.0149.32-Hydroxybenzamide MW:137 Form:C7H7 NO2 CAS Reg No:65-45-2255075100125150175200225250162839658092120137CONH2OHFigure 1.Wiley Library Reference Spectrum of Salicylamide 2005 Waters Corporation传统的样品电离方式：传统的样品电离方式：EI源源?EI源：电子轰击电离源源：电子轰击电离源?可得经典的质谱谱图可得经典的质谱谱图?可查询质谱库，质谱结果可用工业标准谱库检索，是绝对的化合物鉴定可查询质谱库，质谱结果可用工业标准谱库检索，是绝对的化合物鉴定?相对易得，耐受性好相对易得，耐受性好?谱图可解析谱图可解析,阐明结构信息阐明结构信息?但是但是,电离效率较差，测定的分子量范围、流速范围有限；可测的化合物类型有限电离效率较差，测定的分子量范围、流速范围有限；可测的化合物类型有限M样品进入灯丝集电极离子聚焦透镜样品进入灯丝集电极离子聚焦透镜离子去离子去分析器分析器-挡板挡板+2005 Waters CorporationEI 谱库谱库:几十年积累的宝贵财富几十年积累的宝贵财富HOHOOOHOHGamabufotalin(III)M -18+M+M -36+3414023843669110712314517519179201135M -162+2419110712314517519179201341384366M -18+M+M -36+M -162+241402High Res Mass Spec,Brown,Kamano,Pettit,Org.Mass Spec.,1972Waters Integrity LC/MS System,Pfizer,19962005 Waters Corporation大气压电离大气压电离(API)技术技术?电喷雾电离电喷雾电离(Electrospray Ionization-ESI)?大气压化学电离大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization-APCI)2005 Waters Corporation电喷雾电喷雾(ESI)离子化过程离子化过程?电喷雾离子化可分为三个过程电喷雾离子化可分为三个过程:形成带电小液滴形成带电小液滴溶剂蒸发和小液滴碎裂溶剂蒸发和小液滴碎裂最终形成气相离子最终形成气相离子2005 Waters CorporationESI的特点的特点?低分子量化合物一般产生单电荷离子低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得到一个质子失去或得到一个质子)?高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子?几乎没有碎片离子几乎没有碎片离子?可能生成加合物和可能生成加合物和/或多聚体或多聚体;常见的是溶剂加合物和常见的是溶剂加合物和NH4+(M+18),Na+(M+23),和和K+(M+39)加合物加合物?灵敏度取决于化合物本身和基质灵敏度取决于化合物本身和基质2005 Waters CorporationESI+电离模式电离模式1201401601802002202402602800100%163185M+H+M+Na+M+K+CH3SCH3NOCH3O灭多虫灭多虫MW 162产生产生 M+H+准分子离子峰准分子离子峰2005 Waters Corporation大气压化学电离大气压化学电离(APCI)过程过程?大气压化学电离可分为以下两个步骤大气压化学电离可分为以下两个步骤:快速蒸发快速蒸发 气相化学电离气相化学电离(电晕放电电晕放电)2005 Waters CorporationAPCI的特点的特点?一般而言一般而言,只生成单电荷离子只生成单电荷离子?几乎没有碎片离子几乎没有碎片离子?可能生成加合物和可能生成加合物和/或多聚体或多聚体;一般是溶剂加合物及一般是溶剂加合物及NH4+(M+18),Na+(M+23),和和 K+(M+39)加合物加合物?基质影响较小基质影响较小(相对于相对于ESI),质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响2005 Waters CorporationAPI与传统电离技术的区别与传统电离技术的区别液质联用接口至真空液质联用接口至真空离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器离子源离子源液质联用接口至真空液质联用接口至真空质量分析器质量分析器检测器检测器高真空部分高真空部分EI电离源电离源样品引入样品引入高真空部分高真空部分样品引入样品引入API电离源电离源2005 Waters Corporation不同电离技术的适用范围不同电离技术的适用范围分子量化合物极性分子量化合物极性API(APcI-ESI)ParticleBeam(EI-CI)GC/MS(EI-CI)非极性非极性极性极性(离子离子)102103104105APPI2005 Waters Corporation液质联用系统的质量分析器液质联用系统的质量分析器HPLCHPLC离子源离子源分析器分析器检测器检测器数据处理数据处理离子化质子过滤器离子检测器质谱图离子化质子过滤器离子检测器质谱图接口接口色谱分离色谱分离样品引入样品引入数据采集及控制数据采集及控制质量过滤器质量过滤器样品引入样品引入2005 Waters CorporationA.磁质谱磁质谱?通过磁场和电场来传输和选择离子通过磁场和电场来传输和选择离子+离子源电场磁场离子源电场磁场2005 Waters CorporationB.飞行时间质谱飞行时间质谱+离子源离子源?所有离子一同起跑所有离子一同起跑?质量小的跑得快质量小的跑得快?时间分辨时间分辨2005 Waters CorporationC.四极杆质量分析器四极杆质量分析器SourceDetectorNonresonantIonResonant Iondc and Rfvoltages被分析离子由被分析离子由DC和和RF电压控制电压控制2005 Waters CorporationD.离子阱离子阱?原理与四极杆类似原理与四极杆类似?离子被离子被 RF&DC 电场所储存电场所储存?扫描电场可以释放特定的扫描电场可以释放特定的m/z离子离子2005 Waters Corporation质量分析器特性质量分析器特性分析器分析器m/z范围分辨率质量精度动态范围真空四极杆范围分辨率质量精度动态范围真空四极杆1031030.1%105 10-5离子阱离子阱103103-1040.1%10410-3飞行时间飞行时间106103-1040.1-0.01%10410-6扇形磁场扇形磁场104 105 5ppm10710-6回旋共振回旋共振105106 10ppm10410-92005 Waters Corporation质谱分辨率的定义质谱分辨率的定义?分辨率分辨率:质谱上是指分开相邻离子的能力质谱上是指分开相邻离子的能力 分辨率越高分辨率越高,越能区分小的质量差越能区分小的质量差传统分辨率的计算公式传统分辨率的计算公式:分辨率分辨率R=m/m m于于 5%峰谷处测定现今峰谷处测定现今:m=FWHM处处2005 Waters Corporation什么是单位质量分辨率什么是单位质量分辨率半峰高处的峰宽为半峰高处的峰宽为 0.5-0.8 amum/m=133/0.6=222Peak width at half height=0.6m/m=1009/0.5=2018Peak width at half height=0.52005 Waters Corporation什么是高分辨质谱什么是高分辨质谱m/z260m/z260m/z260m/z260M/z260.1560M/z260.1560M/z260.1560M/z260.1560C C C C20202020H H H H2 2 2 20 0 0 0260.1197260.1197260.1197260.1197C C C C19191919H H H H16161616O O O O2005 Waters Corporation单级质谱四极杆质谱单级质谱四极杆质谱2005 Waters Corporation串联质谱三重四极杆质谱串联质谱三重四极杆质谱2005 Waters CorporationMS的检测技术的检测技术HPLCHPLC离子源离子源分析器分析器检测器检测器数据处理数据处理离子化质子过滤器离子检测器质谱图离子化质子过滤器离子检测器质谱图接口接口色谱分离色谱分离样品引入样品引入数据采集及控制数据采集及控制质量过滤器质量过滤器样品引入样品引入2005 Waters Corporation光电倍增器光电倍增器dynodedynodephosphorphosphorphotomultiplierphotomultiplier?配有高压打拿极的光电倍增器，灵敏度高，线性范围广配有高压打拿极的光电倍增器，灵敏度高，线性范围广,可快速地检测 正、负离子可快速地检测 正、负离子?10年的使用寿命年的使用寿命