核酸分子杂交技术.pptx

第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术第1页u按按碱基互补配对碱基互补配对标准，含有一定同源性标准，含有一定同源性两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链u杂交过程含有杂交过程含有高度特异性高度特异性（即使有一个（即使有一个碱基不配对都不能杂交）。碱基不配对都不能杂交）。u经过经过检测探针检测探针是否发生了杂交及杂交量是否发生了杂交及杂交量多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和定量分析。定量分析。u核酸分子杂交成败，核酸分子杂交成败，关键在于探针关键在于探针。核酸分子杂交技术基本原理核酸分子杂交技术第2页 1.1.探针概念：探针概念：在化学及生物学意义上在化学及生物学意义上探针探针(Probe)(Probe)，是指能，是指能与特定靶分子发生特异性相互作用分子，并可与特定靶分子发生特异性相互作用分子，并可被特殊方法所探知被特殊方法所探知核酸分子探针核酸分子探针则是指带有标识物，能与互补核则是指带有标识物，能与互补核酸序列退火杂交特定已知核酸片段。酸序列退火杂交特定已知核酸片段。探针设计和选择探针设计和选择影响核酸杂交试验结果高度特影响核酸杂交试验结果高度特异性、正确性。异性、正确性。(一一)探针概念、种类及其选择、探针标识探针概念、种类及其选择、探针标识核酸分子杂交技术第3页2.探针种类、选择及特点探针种类、选择及特点种类：种类：基因组基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、RNA探探 针、针、寡核苷酸探针寡核苷酸探针选择：选择：寡核苷酸探针是指寡核苷酸探针是指人工合成人工合成短链核苷短链核苷 酸片段，并带有标识物酸片段，并带有标识物特点：特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低以用于点突变检测；缺点是灵敏度低 核酸分子杂交技术第4页 设计寡核苷酸探针遵照标准：设计寡核苷酸探针遵照标准：探探针针长长度度：普普通通要要求求101050bP50bP。过过短短则则特特异异性性降降低低，过过长长，则则合合成成困困难难、杂杂交交时间延长，亦会出现非特异性杂交时间延长，亦会出现非特异性杂交 G G：C C碱碱基基对对含含量量应应占占40406060；过过少少，则则不不易易杂杂交交，或或杂杂交交双双链链不不稳稳定定；过过多，则会产生非特异性杂交多，则会产生非特异性杂交 探探针针内内部部互互补补碱碱基基对对不不应应大大于于4bP4bP，不然会形成探针内部不然会形成探针内部“发夹发夹”结构。结构。核酸分子杂交技术第5页同一碱基同一碱基连续出现次数不应超出连续出现次数不应超出4次次探针设计完后，最好利用基因库软件进探针设计完后，最好利用基因库软件进行分析，并行分析，并与已知各种基因序列进行同源与已知各种基因序列进行同源性比较性比较，探针与非目标基因序列有，探针与非目标基因序列有70以以上同源性，或上同源性，或连续有连续有8个以上碱基序列相同个以上碱基序列相同，则放弃。则放弃。核酸分子杂交技术第6页一个理想标识物应具备特征：一个理想标识物应具备特征：高度高度灵敏性灵敏性；标识物不影响探针标识物不影响探针碱基配对特异性、碱基配对特异性、杂交特异性、杂交稳定性及杂交特异性、杂交稳定性及Tm值；值；高度高度特异性特异性（发生杂交能检测到，不（发生杂交能检测到，不然检测不到）；然检测不到）；3.探针标识物与标识探针标识物与标识核酸分子杂交技术第7页较高较高化学稳定性化学稳定性，保留时间较长；，保留时间较长；标识方法及检测方法简单标识方法及检测方法简单；对人体无损伤，对环境无污染；对人体无损伤，对环境无污染；价格低廉。价格低廉。3.探针标识物与标识探针标识物与标识核酸分子杂交技术第8页放射性核素标识：放射性核素标识：p32P、35S、3H、125I、131Ip优点是优点是灵敏度极高灵敏度极高，能够检测到，能够检测到10-14g 10-18g物质；物质；p缺点是对人体有一定影响，对环境有污缺点是对人体有一定影响，对环境有污染。染。核酸分子杂交技术第9页非放射性标识物：非放射性标识物：半抗原（生物素、地高辛）；半抗原（生物素、地高辛）；配体；配体；荧光素；荧光素；化学发光物；化学发光物；产生颜色物质产生颜色物质核酸分子杂交技术第10页p固相杂交固相杂交 膜上印迹杂交膜上印迹杂交 细胞原位杂交细胞原位杂交p液相杂交液相杂交 （二）杂交（二）杂交核酸分子杂交技术第11页用用印印迹迹技技术术将将凝凝胶胶电电泳泳分分离离核核酸酸片片段段转转移移到到特特异异固固相相支支持持物物上上（转转移移后后核核酸酸片片段段将将保保持其原来相对位置不变）。持其原来相对位置不变）。再再用用标标识识核核酸酸探探针针与与固固相相支支持持物物上上核核酸酸片片段进行杂交。段进行杂交。最最终终洗洗去去未未杂杂交交游游离离探探针针分分子子，经经过过放放射射自自显显影影等等检检测测方方法法显显示示标标识识探探针针位位置置及及量量多多少。少。膜上印迹杂交基本操作流程膜上印迹杂交基本操作流程核酸分子杂交技术第12页1.印迹技术印迹技术 印迹技术是指将待测印迹技术是指将待测核酸分子转移并结核酸分子转移并结合合到一定固相支持物上方法。到一定固相支持物上方法。印迹技术主要包含两个关键原因：印迹技术主要包含两个关键原因：选择良好选择良好固相支持物固相支持物；有效有效转移方法转移方法。核酸分子杂交技术第13页 固相支持物选择固相支持物选择 含有含有良好机械性能良好机械性能，如柔软性好，韧性强，如柔软性好，韧性强，方便操作时不易损坏；方便操作时不易损坏；含有含有较强结合核酸分子能力较强结合核酸分子能力；结合稳定、；结合稳定、牢靠，能经受杂交、洗膜等操作过程，而不牢靠，能经受杂交、洗膜等操作过程，而不会脱落或脱落极少；会脱落或脱落极少；结合后应结合后应不影响核酸分子与探针分子杂交不影响核酸分子与探针分子杂交反应；反应；非特异性吸附较少，非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也即使有，在洗膜时也易被洗脱掉。易被洗脱掉。核酸分子杂交技术第14页n硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜n尼龙膜尼龙膜n化学活化膜化学活化膜n滤纸滤纸当前惯用固相支持物当前惯用固相支持物核酸分子杂交技术第15页硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 含有含有较强吸附结合较强吸附结合单链单链DNA和和RNA能力能力尤尤其其是是在在高高盐盐浓浓度度，其其结结协协力力可可达达80g/cm2100g/cm2。这种结合主要靠这种结合主要靠疏水作用疏水作用。非非特特异异性性吸吸附附核核酸酸（探探针针）能能力力较较弱弱，所所以以杂交信号本底值较低。杂交信号本底值较低。核酸分子杂交技术第16页缺点：缺点：与与核核酸酸结结协协力力较较弱弱（因因为为是是靠靠疏疏水水作作用用），在在杂杂交交及及洗洗脱脱进进程程中中，核核酸酸会会慢慢慢慢脱脱落落，尤尤其是在高温情况下，更轻易脱落。其是在高温情况下，更轻易脱落。对对于于小小分分子子量量DNA片片段段结结协协力力更更弱弱，所所以以不不太适合小分子太适合小分子DNA片段杂交。片段杂交。硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜质质地地较较脆脆，尤尤其其是是经经烘烘烤烤后后更易破损，所以操作不方便，须尤其小心。更易破损，所以操作不方便，须尤其小心。硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜与与核核酸酸结结合合，有有赖赖于于高高盐盐浓浓度度，而高盐溶液又不适合于电转印迹法而高盐溶液又不适合于电转印迹法核酸分子杂交技术第17页尼龙膜尼龙膜 未未经经特特殊殊处处理理尼尼龙龙膜膜，叫叫普普通通尼尼龙龙膜膜。经经过过了了正电荷基团修饰，又叫正电荷基团修饰，又叫特殊尼龙膜特殊尼龙膜。特特殊殊尼尼龙龙膜膜带带有有正正电电荷荷，对对核核酸酸结结协协力力要要比比硝硝酸纤维素膜强好多倍。酸纤维素膜强好多倍。经经短短波波紫紫外外线线照照射射后后，核核酸酸中中部部分分嘧嘧啶啶碱碱基基可可与与膜膜上上带带正正电电荷荷氨氨基基相相互互交交联联。所所以以尤尤其其适适合合用于小分子核酸片段杂交用于小分子核酸片段杂交。碱碱处处理理也也可可使使核核酸酸牢牢靠靠地地结结合合在在尼尼龙龙膜膜上上，尤尤其适合用于菌落原位印迹法其适合用于菌落原位印迹法。核酸分子杂交技术第18页p尼尼龙龙膜膜质质地地坚坚韧韧，不不易易损损坏坏，操操作作方方便便，可可 进行屡次重复杂交。进行屡次重复杂交。p在在低低离离子子强强度度条条件件下下，也也可可与与核核酸酸牢牢靠靠结合，所以结合，所以适合用于电转印迹法适合用于电转印迹法。p缺缺点点：因因为为结结协协力力强强，非非特特异异性性吸吸附附较较多，多，杂交信号本底较高杂交信号本底较高，应注意封闭。，应注意封闭。核酸分子杂交技术第19页 印迹方法印迹方法 斑点或狭缝印迹斑点或狭缝印迹 虹吸印迹法虹吸印迹法 电转印迹法电转印迹法 真空转移法真空转移法Southern印迹法印迹法Northern印迹法印迹法核酸分子杂交技术第20页a.DNAa.DNA分分子子经经限限制制内内切切酶酶酶酶切切。酶酶切切变变成成适适当当长长度度DNADNA片片段段。普普通通理理想想是是0.50.510Kb10Kb，因片段大小直接影响转移效率。，因片段大小直接影响转移效率。b.b.在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中进进行行电电泳泳。分分离离DNADNA片片段段，与与 DNADNA分分 子子 量量 标标 准准 参参 考考 物物 比比 较较（MarkerMarker）,EB,EB染色后观察染色后观察DNADNA片段大小片段大小SouthernSouthern印迹法印迹法核酸分子杂交技术第21页 c.c.将将凝凝胶胶浸浸泡泡于于适适量量变变性性液液中中(1.5mol/L(1.5mol/L NaclNacl和和0.5mol/L 0.5mol/L NaOH)NaOH)室室温温1h1h，其其目目标标使使DNADNA变变性性，即即将将双双链链DNADNA变变成成单单链链DNADNA。假假如如DNADNA片片段段较较大大(大大 于于 15kb)15kb)，可可 在在 变变 性性 前前，用用 稀稀 盐盐 酸酸（0.2mol/L0.2mol/L）处处理理10min,10min,因因为为片片段段大大小小直直接接影影响转移率速。小于响转移率速。小于15Kb15Kb，转移，转移1h1h。d.d.印印迹迹(转转移移)方方法法：虹虹吸吸印印迹迹法法，电电转转印印迹迹法法和和真真空空印印迹迹法法。不不论论采采取取哪哪种种方方法法，均均是是将将DNADNA从凝胶转移到固相支持物上从凝胶转移到固相支持物上e.e.固固定定，对对于于硝硝酸酸纤纤维维膜膜，可可真真空空下下8080烘烘烤烤2h2h(亦亦可可无无真真空空)，对对尼尼龙龙膜膜还还可可用用短短波波紫紫外外线线（波长（波长254nm254nm）照射几分钟进行固定。）照射几分钟进行固定。核酸分子杂交技术第22页基本原理基本原理与与SouthernSouthern印迹相同印迹相同但但RNARNA变变性性方方法法与与DNADNA不不一一样样:不不能能用用碱碱变变性性，因为碱造成因为碱造成RNARNA水解。水解。RNARNA变性常与电泳同时进行，常有变性常与电泳同时进行，常有3 3种方法种方法:聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳 甲醛变性凝胶电泳甲醛变性凝胶电泳 甲基氧化汞电泳甲基氧化汞电泳 NorthernNorthern印迹法印迹法核酸分子杂交技术第23页nRNARNA经变性电泳后，普通可进行转移经变性电泳后，普通可进行转移（印迹），其（印迹），其印迹方法与印迹方法与SouthernSouthern方法方法相同相同。n对含甲醛凝胶，可用对含甲醛凝胶，可用DEPCDEPC预处理水漂预处理水漂洗，以去除甲醛洗，以去除甲醛。n固定方法，惯用固定方法，惯用真空烘烤（真空烘烤（8080）2h2h核酸分子杂交技术第24页2杂交（固液相杂交）技术杂交（固液相杂交）技术 DNA分分子子杂杂交交实实际际上上是是双双链链DNA变变性性和和含有同源序列两条单链复性过程含有同源序列两条单链复性过程。RNA分分子子杂杂交交也也包包括括变变性性和和复复性性过过程程（这这种种变变性性是是单单链链RNA分分子子内内部部发发夹夹结结构打开过程）。构打开过程）。所以以所以以DNA分子杂交为例进行介绍。分子杂交为例进行介绍。核酸分子杂交技术第25页（1）变变性性 即即打打开开DNA双双螺螺旋旋结结构构，变变成成单链单链DNA过程。过程。方法有：加热变性方法有：加热变性 有机溶剂变性有机溶剂变性 高浓度盐变性高浓度盐变性 碱变性等碱变性等 惯用方法是惯用方法是加热变性和碱变性加热变性和碱变性。核酸分子杂交技术第26页 uDNA变性时，在变性时，在260nm处紫外吸光度增处紫外吸光度增加，这种现象又称加，这种现象又称增色效应增色效应。u熔解温度（熔解温度（melting temperature Tm值）值）当增色效应当增色效应到达最大值到达最大值50%时温度时温度uTm值表明值表明DNA溶液中溶液中二分之一二分之一DNA双双链已解离为单链链已解离为单链uTm值反应了值反应了DNA变性程度和难易变性程度和难易，Tm值越大，变性越难值越大，变性越难u大多数大多数DNATm值在值在8590左右。左右。核酸分子杂交技术第27页TmTm值影响原因：值影响原因：DNADNA碱碱基基组组成成，TmTm值值主主要要受受G G：C C碱碱基基对对数量多少影响，有一个经验公式为：数量多少影响，有一个经验公式为：Tm Tm(G+C)%0.41(G+C)%0.4169.3 69.3 溶液离子强度溶液离子强度，DNADNA链上磷酸基团带负链上磷酸基团带负电荷，在无盐水中，电荷，在无盐水中，DNADNA在室温条件下就在室温条件下就会变性，而会变性，而加入盐后加入盐后，正电荷离子能够封，正电荷离子能够封闭磷酸基团负电荷，使闭磷酸基团负电荷，使DNADNA双链稳定性增双链稳定性增加，加，TmTm值亦会升高。值亦会升高。核酸分子杂交技术第28页 pHpH值值，pHpH值值在在5 59 9之之间间范范围围内内，TmTm值值改改变变不不显显著著，当当pHpH值值大大于于11.311.3时时，全全部部氢氢键键均均被被破破坏坏，DNADNA完完全全变变性性。这这就就是是碱变性原理。碱变性原理。变性剂：变性剂能够干扰碱堆积力和变性剂：变性剂能够干扰碱堆积力和氢键形成，所以氢键形成，所以能够降低能够降低TmTm值值。惯用变。惯用变性剂是甲酰胺和脲。性剂是甲酰胺和脲。通惯用通惯用5050甲酰胺使甲酰胺使TmTm值降低值降低3030 核酸分子杂交技术第29页（2）复性）复性 单链核酸重新缔合成双链过程。单链核酸重新缔合成双链过程。l复性过程是复性过程是相当复杂相当复杂。l复性则需要相对复性则需要相对较长时间较长时间才能完成。才能完成。分子碰撞机分子碰撞机率越大率越大，复性速度越快，一开始往往错误碰撞，复性速度越快，一开始往往错误碰撞，只只有正确配对才是复性开始有正确配对才是复性开始。l使变性使变性DNADNA完全恢复天然双链结构，则要在完全恢复天然双链结构，则要在低于低于TmTm值值2525温度下维持相当长时间温度下维持相当长时间才能完成。才能完成。核酸分子杂交技术第30页复性（速度）过程影响原因复性（速度）过程影响原因：DNADNA浓浓度度：DNADNA浓浓度度越越大大、碰碰撞撞机机率率越越大，复性速度越快。大，复性速度越快。DNADNA分分子子量量：大大分分子子量量DNADNA扩扩散散速速度度较较慢慢，碰碰撞撞机机率率较较少少，同同时时又又极极难难形形成成正正确配对，所以复性速度较慢。确配对，所以复性速度较慢。温温度度：温温度度过过高高，有有利利于于DNADNA变变性性而而不不利利于于复复性性；而而温温度度过过低低，碰碰撞撞机机率率降降低低，易易形形成成局局部部错错误误配配对对，适适宜宜温温度度是是较较TmTm值低值低15152525。核酸分子杂交技术第31页离子强度：离子强度：离子强度过低，不利于复性离子强度过低，不利于复性 pHpH值值：pHpH值值在在5 59 9范范围围内内，不不影影响响复复性性速度，过低或过高则影响。速度，过低或过高则影响。DNADNA分分子子复复杂杂性性：DNADNA总总量量一一定定时时，基基因因组组越越复复杂杂，其其中中特特定定次次序序拷拷贝贝数数就就越越少少，互互补补次次序序浓浓度度就就越越低低，因因而而复复性性反反应应速速度度越慢。越慢。核酸分子杂交技术第32页（3 3）杂交体系建立要考虑以下几原因）杂交体系建立要考虑以下几原因 DNADNA浓浓度度：DNADNA浓浓度度越越高高，复复性性速速度度越越快快。加加入入足足够够DNADNA并并尽尽可可能能降降低低杂杂交交体体积积，普普通通以以每每平平方方厘厘米米滤滤膜膜面面积积加加5050100l100l杂杂交液为宜。交液为宜。DNADNA探探针针长长度度：在在杂杂交交过过程程中中，待待测测DNADNA固固定定在在膜膜上上，只只有有探探针针能能够够自自由由扩扩散散，探探针针越越长长，扩扩散散越越慢慢，变变性性越越慢慢。所所以以探探针针长度不宜过长，长度不宜过长，普通以普通以101050bp50bp。核酸分子杂交技术第33页离离子子强强度度：离离子子强强度度对对变变性性影影响响较较大大。普普 通通 惯惯 用用 55或或 6SSC6SSC（1SSC1SSC为为0.15mol/L Nacl0.15mol/L Nacl和和0.015mol0.015mol柠檬酸钠）。柠檬酸钠）。温温度度：温温度度对对于于杂杂交交（复复性性）反反应应快快慢慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关主要原因。和洗膜时去掉非特异杂交是至关主要原因。核酸分子杂交技术第34页普普通通认认为为杂杂交交温温度度为为：6868（不不含含甲甲酰酰胺胺）；当当含含5050甲甲酰酰胺胺时时，在在4242进进行行杂交。杂交。洗膜温度普通认为洗膜温度普通认为55556565。对对于于寡寡核核苷苷酸酸探探针针杂杂交交温温度度，应应依依据据以以下公式推算：下公式推算：Tm=4GC Tm=4GC2AT2AT 杂杂 交交 温温 度度 普普 通通 比比TmTm值值 低低 55，5555（20bp)20bp)核酸分子杂交技术第35页 杂交时间：普通应为杂交时间：普通应为Cot1/213倍。倍。Yz 小时小时/Cot1/2 2 510X Co单链单链DNA浓度，浓度，t1/2反应二分之一时间反应二分之一时间 Y为探针为探针DNA复杂性，即片段大小（复杂性，即片段大小（Kb）Z为杂交体系体积为杂交体系体积(ml)。经验杂交时间经验杂交时间816h，过夜。，过夜。核酸分子杂交技术第36页 降降低低或或抑抑制制非非特特征征杂杂交交。普普通通在在杂杂交交前前先先进进行行预预杂杂交交，方方便便将将非非特特异异性性DNADNA位位点点封封闭闭，同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。促促进进 杂杂 交交反反 应应速速度度：硫硫酸酸 葡葡 聚聚糖糖(dextran(dextran sulfate,Mw sulfate,Mw 500000)500000)能能促促进进DNADNA链链间间缔缔合合，其其微微粒粒表表面面可可吸吸附附DNADNA探探针针分分子子，从从而而使使DNADNA接接触触面面积积增增大大，有有利利于于杂杂交交反反应应，促促进杂交反应速度。进杂交反应速度。如如1010硫硫酸酸葡葡聚聚糖糖可可使使杂杂交交反反应应速速度度提提升升1010100100倍。倍。核酸分子杂交技术第37页预预杂杂交交：将将膜膜放放在在预预杂杂液液中中，即即不不放放探探针针，预预杂杂交交液液中中主主要要含含DehardtDehardt液液和和鲑鲑鱼鱼精精DNADNA，主主要要是是封封闭闭膜膜上上非非特特异异性性杂杂交交位点位点。杂杂交交：杂杂交交液液中中除除含含封封闭闭物物质质外外，还还含含有有1010硫硫酸酸葡葡聚聚糖糖和和探探针针。探探针针假假如如是是双双链链DNADNA，则则需需要要进进行行变变性性处处理理。温温度度68（不不含含甲甲酰酰胺胺），42（含含50甲甲酰胺），杂交时间：酰胺），杂交时间：816h过夜。过夜。（4 4）杂交操作步骤）杂交操作步骤核酸分子杂交技术第38页洗洗液液：将将膜膜上上未未与与DNADNA杂杂交交及及非非特特异异性性杂杂交交探探针针从从膜膜上上洗洗去去过过程程。因因为为非非特特异异性性杂杂交交杂杂交交体体稳稳定定性性较较低低，解解链链温温度度较较低低，而特异性杂交体因为稳定而保留在滤膜上。而特异性杂交体因为稳定而保留在滤膜上。注意，注意，洗膜液要换几次，洗膜液要换几次，要用几个不一样要用几个不一样洗膜液。洗膜液。离子强度逐步降低，离子强度逐步降低，而而洗膜温度洗膜温度逐步上升（逐步上升（室温室温37376565）。即逐步）。即逐步增加洗膜强度。逐步降低离子强度，为下增加洗膜强度。逐步降低离子强度，为下一步反应（检测）做好准备。一步反应（检测）做好准备。核酸分子杂交技术第39页3杂交信号检测杂交信号检测 放放射射自自显显影影：探探针针标标识识了了放放射射性性核核素，如素，如32P、35S、125I或或131I。其其详详细细方方法法是是：在在暗暗盒盒里里将将杂杂交交后后滤滤膜膜放放在在暗暗盒盒里里X光光片片上上，盖盖上上暗暗盒盒，置置70曝光一定时间。曝光一定时间。经经显显影影、定定影影后后，可可出出现现黑黑色色曝曝光光斑斑点点，依依据据斑斑点点密密度度及及大大小小，判判断断被被检检测测核核酸酸是否有与探针对应序列及大小。是否有与探针对应序列及大小。核酸分子杂交技术第40页 显色反应：显色反应：探针直接标识酶或间接探针直接标识酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在情况结合酶，酶在有特异性底物存在情况下，可发生显色反应。下，可发生显色反应。依据显色反应依据显色反应斑点大小判断结果。斑点大小判断结果。A B C 酶酶+底物底物 显色显色探针探针标识物标识物(地高辛地高辛)抗体抗体核酸分子杂交技术第41页惯用酶惯用酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶：作用底物：作用底物：BCIP（5-溴溴-4-氯氯-4-吲哚磷酸）吲哚磷酸）NBT(硝基蓝四氮唑硝基蓝四氮唑)。显显色色过过程程：碱碱性性磷磷酸酸酶酶 BCIP 脱脱磷磷，产产生生H+NBT还原还原 紫色化合物。紫色化合物。辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）：惯用底物：惯用底物：DAB（二二氨氨基基联联苯苯胺胺），红红棕棕色色，有有致致癌癌性性。TMB（四甲基联苯胺），产生蓝色，无致癌性。（四甲基联苯胺），产生蓝色，无致癌性。核酸分子杂交技术第42页化学发光反应化学发光反应 与与显显色色反反应应基基本本一一致致，只只是是酶酶（HRP碱碱性性磷磷酸酸酶酶）催催化化一一个个特特殊殊底底物物如如luminol、CSPD等，产生发光等，产生发光，而不显色。，而不显色。该该化化学学光光可可使使X光光片片曝曝光光，经经显显影影、定定影影后，可取得杂交斑点。后，可取得杂交斑点。化化学学发发光光是是一一个个有有发发展展前前途途检检测测方方法法。如如需需准准确确定定性性和和定定量量，可可用用数数字字成成像像系系统统进进行检测。行检测。核酸分子杂交技术第43页第四节 蛋白质杂交技术蛋白质杂交技术 核酸分子杂交技术第44页u检测检测DNA可用可用Southern印迹法印迹法u检测检测RNA可用可用Northern印迹法印迹法u检检测测蛋蛋白白质质一一样样有有蛋蛋白白质质印印迹迹法法（Western印迹法印迹法）u蛋蛋白白质质印印迹迹是是将将蛋蛋白白质质转转移移到到固固相相支支持持物物上上，然然后后利利用用抗抗体体与与附附着着于于固固相相支支持持物物上上靶靶蛋蛋白白发发生生特特异异性性抗抗原原抗抗体体结结合合反应反应核酸分子杂交技术第45页待待测测样样品品经经过过SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（SDS-PAGE）被被转转移移到到固固相相支支持持物物上上，固固相相支支持持物物以以非非共价键形式吸附蛋白质共价键形式吸附蛋白质以以固固相相支支持持物物上上蛋蛋白白质质为为抗抗原原，与与对对应应抗抗体体发生特异性抗原抗体结合反应发生特异性抗原抗体结合反应与与酶或同位素标识第二抗体酶或同位素标识第二抗体发生反应发生反应经经过过底底物物显显色色或或放放射射自自显显影影，以以检检测测电电泳泳分离靶蛋白。分离靶蛋白。一、原理一、原理核酸分子杂交技术第46页uWestern印迹有印迹有SDS-PAGE高分辨力高分辨力u固固相相免免疫疫测测定定高高特特异异性性和和敏敏感感性性，可可测测出出1ng5ng中等大小蛋白质。中等大小蛋白质。u因因为为蛋蛋白白质质电电泳泳分分离离几几乎乎总总是是在在变变性性条条件件下下进进行行，所所以以，不不存存在在溶溶解解、聚聚集集以以及及靶蛋白与外来蛋白共沉淀等问题。靶蛋白与外来蛋白共沉淀等问题。u还还含含有有简简便便、标标本本可可长长久久保保留留、结结果果便便于比较等优点。于比较等优点。核酸分子杂交技术第47页（一）蛋白提取试剂（一）蛋白提取试剂 1细胞裂解液细胞裂解液 20mmol/L Tris(pH 7.5)150mmol/L NaCl 1%Triton X-100焦磷酸钠，焦磷酸钠，-磷酸甘油，磷酸甘油，EDTA，正钒酸钠，正钒酸钠(Na3VO4)亮抑肽素等亮抑肽素等各种蛋白酶抑制剂各种蛋白酶抑制剂二、试剂二、试剂核酸分子杂交技术第48页2蛋白蛋白上样缓冲液上样缓冲液100mmol/L TrisCl(pH 6.8)200mmol/L二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）4%SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)0.2%溴酚蓝溴酚蓝20%甘油甘油核酸分子杂交技术第49页（二）（二）SDS-PAGE试剂试剂130%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺丙烯酰胺30g、双丙、双丙烯酰胺烯酰胺0.8g，溶于，溶于100ml水中，过滤后贮于水中，过滤后贮于褐色瓶中低温保留，可用一个月。褐色瓶中低温保留，可用一个月。2Tris缓冲液缓冲液（1）1.5mol/L Tris(pH8.8)/积层胶缓冲液：积层胶缓冲液：Tris碱碱 18.17g，用，用HCl调调pH8.8，加水至，加水至100ml。（2）1.0mol/L Tris(pH6.8)分离胶缓冲液：分离胶缓冲液：Tris碱碱 12.11g，用，用HCl调调pH6.8，加水至，加水至100ml。核酸分子杂交技术第50页310%SDS 可用去离子水配成贮存液可用去离子水配成贮存液保留于室温。保留于室温。410%过硫酸胺过硫酸胺 过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需合所必需自由基自由基。可用去离子水配制小量贮存液并保留于可用去离子水配制小量贮存液并保留于4冰箱中冰箱中。因为过硫酸胺会迟缓分解，故应因为过硫酸胺会迟缓分解，故应隔周重隔周重新配制新配制。核酸分子杂交技术第51页5TEMED（N,N,N,N四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）经过经过催化过硫酸胺形成自由基催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合。酰胺与双丙烯酰胺聚合。6Tris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 l配成配成10贮存液备用，在贮存液备用，在900ml去离子水去离子水中溶解中溶解30g Tris碱和碱和144g甘氨酸，然后加入甘氨酸，然后加入10g SDS，用，用HCl调调pH至至8.3，用去离子水，用去离子水补至补至1000ml。l使用前用使用前用去离子水稀释成去离子水稀释成1应用液应用液。核酸分子杂交技术第52页（三）转膜缓冲液（三）转膜缓冲液 39mmol/L 甘氨酸甘氨酸 48mmol/L Tris碱碱 0.037%SDS 20%甲醇甲醇核酸分子杂交技术第53页（四）染色液与脱色液（四）染色液与脱色液1考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染液染液 100mg考马斯亮考马斯亮蓝蓝R250溶于溶于40ml 乙醇，加乙醇，加10ml冰醋酸，补冰醋酸，补水至水至100ml。2考马斯亮蓝脱色液考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加乙醇，加10ml冰醋酸，补水至冰醋酸，补水至100ml。3丽春红丽春红S贮存液贮存液 2g丽春红丽春红S，30g三氯乙三氯乙酸，酸，30g磺基水杨酸，加水至磺基水杨酸，加水至100ml。使用时，将使用时，将1份上述贮存液加份上述贮存液加9份去离子份去离子水即为丽春红水即为丽春红S应用液，使用后应废弃。应用液，使用后应废弃。核酸分子杂交技术第54页（五）封闭液（五）封闭液5脱脂奶粉脱脂奶粉0.01%防沫剂防沫剂A0.02%叠氮钠叠氮钠溶于磷酸盐缓冲液（溶于磷酸盐缓冲液（PBS）核酸分子杂交技术第55页（一）样品前处理（一）样品前处理n细菌细菌普通直接用蛋白上样缓冲液裂解；普通直接用蛋白上样缓冲液裂解；n真核细胞或哺乳动物组织通常真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解加细胞裂解液，机械或超声波液，机械或超声波室温匀浆室温匀浆0.5min1min。n4 10,000g13,000g离心离心5min，取上清取上清n按照每按照每4l蛋白样品加入蛋白样品加入1l 5蛋白上样缓蛋白上样缓冲液百分比混合。冲液百分比混合。100水浴加热水浴加热3min5min，以充分，以充分变性蛋白变性蛋白。n冷却到室温，冷却到室温，上样到上样到SDS-PAGE胶加样孔胶加样孔三、试验方法三、试验方法核酸分子杂交技术第56页原原理理是是依依据据大大多多数数蛋蛋白白质质都都能能与与阳阳离离子子表面活性剂表面活性剂SDS按重量比结合成复合物按重量比结合成复合物使使蛋蛋白白质质复复合合物物所所带带负负电电荷荷远远远远超超出出天天然然蛋蛋白白质质分分子子所所带带负负电电荷荷，消消除除了了不不一一样蛋白质分子电荷效应样蛋白质分子电荷效应蛋蛋白白质质分分子子迁迁移移速速率率完完全全取取决决于于分分子子量量大大小小，从从而而到到达达了了分分离离不不一一样样分分子子量量大大小蛋白质目标小蛋白质目标（二）（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸分子杂交技术第57页u胶胶有有效效分分离离范范围围取取决决于于用用于于灌灌胶胶聚聚丙丙烯酰胺烯酰胺浓度和交联度浓度和交联度。u经经双双丙丙烯烯酰酰胺胺交交联联后后丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶刚刚性性和和抗抗张张强强度度都都有有所所增增加加，形形成成小小孔孔必必须能够允许须能够允许SDS蛋白复合物经过蛋白复合物经过u这这些些小小孔孔孔孔径径随随双双丙丙烯烯酰酰胺胺、丙丙烯烯酰酰胺胺比比率率增增加加而而变变小小，比比率率靠靠近近1:20时时孔孔径径到到达达最最小小值值。普普通通按按双双丙丙稀稀酰酰胺胺、丙丙烯酰胺为烯酰胺为1:29配制配制核酸分子杂交技术第58页表表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶有效分离范围聚丙烯酰胺凝胶有效分离范围 丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（）（）线性分离范围线性分离范围（kD）1512431016687.53694557212核酸分子杂交技术第59页1SDS聚丙烯酰胺凝胶灌制聚丙烯酰胺凝胶灌制（1）安装玻璃板安装玻璃板（2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积分离胶溶液胺浓度配制一定体积分离胶溶液。依次混合各成份（见下表）一旦加入一旦加入TEMED，马上开始聚合，马上开始聚合，故应马上快速旋动混合物并进入下步操作 核酸分子杂交技术第60页表表2 积层胶、分离胶所需溶液成份配比积层胶、分离胶所需溶液成份配比溶液成份（ml）5%积积层胶层胶不一样浓度分离胶6%8%10%12%15%水水3.45.34.64.03.32.330%丙稀酰胺丙稀酰胺0.832.02.73.34.05.01.5mol/L Tris(pH8.8)2.52.52.52.52.51.0mol/L Tris(pH6.8)0.6310%SDS0.050.10.10.10.10.110%过硫酸胺过硫酸胺0.050.10.10.10.10.1TEMED0.0050.0080.0060.0040.0040.004总体积总体积（ml）51010101010核酸分子杂交技术第61页（3）快速在两板间隙）快速在两板间隙灌注丙烯酰胺溶液，灌注丙烯酰胺溶液，留出积层胶所需空间留出积层胶所需空间（梳子齿长再加（梳子齿长再加1cm）。然后小心在丙烯酰胺溶液上）。然后小心在丙烯酰胺溶液上加一加一层去离子水层去离子水。凝胶垂直放置于室温下。凝胶垂直放置于室温下。（4）分离胶聚合完全后（约）分离胶聚合完全后（约30min），），倾斜倒出覆盖去离子水。倾斜倒出覆盖去离子水。（5）配制）配制5%积层胶积层胶。核酸分子杂交技术第62页（6）在已聚合分离胶上直接）在已聚合分离胶上直接灌注积层胶灌注积层胶，马上在积层胶溶液中马上在积层胶溶液中插入洁净梳子。小心插入洁净梳子。小心防止混入气泡。防止混入气泡。（7）积层胶聚合完全后（约）积层胶聚合完全后（约30min），小），小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间气泡。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间气泡。核酸分子杂交技术第63页2上样和电泳上样和电泳p 取取一一定定量量样样品品与与上上样样缓缓冲冲液液混混合合后后，加加入入上样孔。上样孔。p将将电电泳泳槽槽与与电电源源连连接接（正正极极应应接接下下槽槽），凝凝胶胶上上所所加加电电压压为为8伏伏/cm。当当上上样样缓缓冲冲液液中中染染料料前前沿沿进进入入分分离离胶胶后后，把把电电压压提提升升到到15伏伏/cm，继继续续电电泳泳直直至至溴溴酚酚蓝蓝抵抵达达分分离离胶胶底底部部（约（约4h），然后关闭电源。），然后关闭电源。p从从电电泳泳装装置置上上卸卸下下玻玻璃璃板板，用用刮刮勺勺撬撬开开玻玻璃板，璃板，取下凝胶取下凝胶。核酸分子杂交技术第64页3考马斯亮蓝对考马斯亮蓝对SDS凝胶进行染色凝胶进行染色 考马斯亮蓝染色主要目标包含：考马斯亮蓝染色主要目标包含：显显示示靶靶蛋蛋白白在在凝凝胶胶中中粗粗略略位位置置，从从而而切切去去不不含含靶靶蛋蛋白白凝凝胶胶，这这么么能能够够节节约约硝硝酸酸纤纤维维素素膜；膜；转转膜膜后后，凝凝胶胶染染色色可可判判断断蛋蛋白白质质转转膜膜是是否否完全完全。核酸分子杂交技术第65页Western印迹固相支持体有各种：印迹固相支持体有各种：重氮苯硫醚重氮苯硫醚（diazophenylthio,DPT）纸纸重氮苄氧甲基重氮苄氧甲基（diazobenzyloxymethyl,DBM）纸纸溴化氰活化纸溴化氰活化纸氰尿酰氯纸氰尿酰氯纸活化尼龙膜活化尼龙膜当前最惯用是当前最惯用是硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜（三）蛋白质从凝胶转移至固相支持体（三）蛋白质从凝胶转移至固相支持体核酸分子杂交技术第66页蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上：蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上：u凝凝胶胶及及与与之之相相贴贴硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜夹夹于于事事先先用用转转膜膜缓缓冲冲液液浸浸泡泡过过Whatman 3MM滤滤纸纸之之间间u然然后后把把结结合合体体夹夹在在石石墨墨电电极极板板之之间间，硝硝酸酸纤维素滤膜朝阳极纤维素滤膜朝阳极一侧一侧u蛋蛋白白质质转转移移可可用用于于室室温温进进行行，1.5h2h便便可完成。可完成。核酸分子杂交技术第67页对硝酸纤维素膜上蛋白进行染色对硝酸纤维素膜上蛋白进行染色判断转膜是否完全判断转膜是否完全可可供供硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜上上蛋蛋白白质质进进行行染染色色方方法法有有很很各各种种，但但只只有有丽丽春春红红S染染色色法法可可与与免免疫疫学学检检测测方方法法兼兼容容，这这是是因因为为该该染染料料只只会会短短暂暂显显色色而而且且在在进进行行Western印印迹迹时时被被洗去。洗去。核酸分子杂交技术第68页1封闭滤膜蛋白结合位点：在加入一抗之封闭滤膜蛋白结合位点：在加入一抗之前，前，必须封闭可能结合位点必须封闭可能结合位点以降低这类非以降低这类非特异性结合背景。特异性