植物病毒病的诊断与鉴定.pptx

植物病毒病诊疗与判定级3班 阳植物病毒病的诊断与鉴定第1页植物病毒病诊疗与判定植物病毒形态、结构与组分植物病毒形态、结构与组分 2植物病毒病概况植物病毒病概况 1植物病毒判定植物病毒判定 4植物病毒病症状特点植物病毒病症状特点 3植物病毒病综合防治植物病毒病综合防治 5植物病毒病的诊断与鉴定第2页1.植物病毒病概况病毒（病毒（Virus）是包被在蛋白或脂蛋白保护性衣壳中，只能在适是包被在蛋白或脂蛋白保护性衣壳中，只能在适合寄主细胞内完成本身复制一个或多个基因组核酸分子，又称合寄主细胞内完成本身复制一个或多个基因组核酸分子，又称分子寄生物分子寄生物。病毒区分于其它生物病毒区分于其它生物主要特征主要特征是：是：1.病毒是个体微小分子寄生物，其结构简单；病毒是个体微小分子寄生物，其结构简单；2.专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。按寄主性不一样，病毒分为寄生植物植物病毒按寄主性不一样，病毒分为寄生植物植物病毒(Plant Virus)、寄生动物动物病毒以及寄生细菌噬菌体等。寄生动物动物病毒以及寄生细菌噬菌体等。植物病毒病的诊断与鉴定第3页1.植物病毒病概述植物病毒病概述病毒引发病害在数量上占植物病害第二位。由植物病毒引发植物病害植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫芦科等。在辽宁省引发毁灭性植物病毒病有番茄蕨叶病毒病，辣椒花叶病毒病和烟草脉坏死病毒病等。生产上危害较大植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜花叶病、马铃薯病毒病、玉米矮花叶病等。植物病毒也有可利用价值，尤其在开发基因工程载体、转基因植物研究等方面，发挥了很大作用。植物病毒危害及作用植物病毒危害及作用植物病毒病的诊断与鉴定第4页1.植物病毒病概述植物病毒病概述 植物病毒学研究历史：植物病毒学研究历史：1886年梅耶尔(Mayer)证实了烟草花叶病害摩擦传染性;1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发觉了烟草花叶病病原能够经过细菌过滤器；1898年伯吉林克(Beijeincku)又发觉该病原不是微生物，而是一个传染性活液 (contagium vivum fluidum)，这就是Virus一词起源；1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）取得了烟草花叶病毒蛋白结晶,认为病毒是可在活细胞内增殖蛋白（1946年获Nobel Prize in Chemistry)。植物病毒病的诊断与鉴定第5页1.植物病毒病概述植物病毒病概述 植物病毒学研究历史：植物病毒学研究历史：1936年英国科学家鲍登(Bawden)证实提纯TMV中含有核酸；l939年Kausch经过电子显微镜观察到植物病毒形态；1956年Gierrer 证实去掉蛋白质RNA起主要侵染和繁殖作用；1971年Diener 发觉了很小RNA（250-400bps)称为类病毒（viroid);1982年发觉仅有蛋白质月元病毒 10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第6页1.植物病毒病概述植物病毒病概述植物病毒学研究历史：植物病毒学研究历史：1981年，A.Lwoff在巴黎举行第五届病毒学大会上，这一法国病毒研究所所长阿尔沃夫，认为病毒不是生物，他观点以下：生长和分裂 独立进化 独立生命体 活原 生 生 物 细 胞 线粒体和叶绿体 膜 染色体、质体含核酸 病 毒 总而言之，认为病毒是有机物，而不是生物病毒是有机物，而不是生物。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第7页1.植物病毒概述植物病毒概述植物病毒命名植物病毒命名植物病毒名称当前不采取拉丁文双名法，仍以寄主英文俗名加上症状来命名，如烟草花叶病毒为Tobacco mosaic virus，缩写为TMV；黄瓜花叶病毒为Cucumber mosaic virus，缩写为CMV。属名为专用国际名称，常由经典组员寄主名称(英文或拉丁文)缩写十主要特点描述(英文或拉丁文)缩写十virus拼组而成。如：黄瓜花叶病毒属学名为Cucumovirus；烟草花叶病毒属为Tobamovirus。即植物病毒属结尾是一virus，科、属名书写时应用斜体，而种和株系书写不采取斜体。类病毒(viroid)在命名时遵照相同于病毒规则，因缩写名易与病毒混同，新命名规则要求类病毒缩写为Vd，如马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)缩写为PSTVd。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第8页2.植物病毒形态、结构植物病毒形态、结构与组成2.1植物病毒形态植物病毒形态观察需要电子显微镜电子显微镜，度量尺度为纳米(nm)。植物病毒基本形态为球状、杆状球状、杆状和线条状线条状。球状病毒直径大多在20一一35nm，少数能够到达70-80nm，球状病毒也称为多面体病毒或二十面体(icosahedral particle)病毒。杆状病毒多为20-80nm100-250nm，两端平齐；少数两端钝圆，线状病毒多为1113nm 750nm，个别能够到达nm以上。还有少数病毒与以上形态不一样，它们有看上去是两个球状病毒联合在一起，被称为双联病毒(或双生病毒)；有像弹头，被称为弹状病毒；还有呈丝线状，柔软不定形。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第9页2.2植物病毒结构植物病毒结构中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多蛋白质亚基组成，核酸和蛋白质亚基均呈螺旋状排列。杆状或条状病毒粒体是空心。TMV为棒状，CMV球状。球状病毒：20面体，蛋白质亚基为60个或60倍数，蛋白质亚基在每个面上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒体中心也是空。核酸链排列还不清楚。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第10页2.3植物病毒组成植物病毒组成植物病毒主要成份是核酸核酸和蛋白质蛋白质，核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳，有病毒粒体中还含有少许糖蛋白或脂类。组成病毒成份：核酸5-40%，蛋白质60-95%，还有水分和矿物质等。类病毒和拟病毒无蛋白衣壳，无专化性血清学反应，真病毒有专化性血清反应。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第11页植物病毒主要类型植物病毒主要类型1.长而弯曲线状粒体长而弯曲线状粒体 2.僵直杆状粒体僵直杆状粒体 3.示杆状或线状病毒核酸与蛋白亚示杆状或线状病毒核酸与蛋白亚基排列基排列 4.杆菌状粒体杆菌状粒体 5.杆菌状粒体横切面杆菌状粒体横切面 6.多角体病毒粒体多角体病毒粒体 7.二十面体核酸与蛋白亚基排列二十面体核酸与蛋白亚基排列10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第12页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征 一、外部症状一、外部症状(Symptom)：病毒病害在症状表现上多为系统发病，表现为变色、畸形，少数引发坏死、腐烂，萎蔫极少发生。变色变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。坏死坏死(negrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏死枯斑，马铃薯病毒一些株系侵染烟草可产生脉坏死。畸形畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leafroll)，皱叶(rugose)，蕨叶 (fernleaf)。刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第13页10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第14页花叶（变色界限显著）10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第15页叶片卷曲10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第16页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征二、二、病组织内部和细胞改变：病组织内部和细胞改变：1.组织改变组织改变：组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引发薄壁组织坏死，有些引发茎部维管束和叶部坏死，烟草花叶病毒侵染大豆引发顶芽和侧枝坏死。普通引发黄化类型病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引发。组织增生：病毒侵染后，寄主植物体内代谢失调，产生激素，引发增生。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第17页10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第18页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征2.细胞改变：细胞改变：花叶花叶和斑驳斑驳是因为细胞内叶绿素遭到破坏所致。内含体(inclussion)：一些植物被病毒侵染后，在病组织中产生一个特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下能够观察到。分为不定型内含体体和结晶体。结晶体：有六角型、长条型、正四面体型等，个别还有皿状，无色透明，主要是由病毒粒体和寄主蛋白质有规则地排列形成。体：无一定形状，半透明，通常外有一层膜，也是由病毒粒体和寄主物质组成 内含体作用：植物患病毒病后才有，所以，可作为一个诊疗指标。但并不是全部病毒病都有内含体，有些必须发育到一定阶段才形成，同时一个病毒还可有各种形态内含体，所以，单靠内含体诊疗还有一定不足。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第19页10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第20页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征三、患病植物生理改变三、患病植物生理改变：表现为：病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。碳水化合物含量下降。淀粉在叶部积累引发黄化。多酚氧化酶和细胞色素氧化酶活性增强，使细胞中毒坏死。光合作用下降，破坏了寄主叶绿素。植物内源激素水平失去平衡，造成畸形。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第21页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征四、症状改变四、症状改变：一个病毒引发症状可因病毒病毒、寄主寄主和环境环境三方面原因而改变。1.病毒本身：病毒本身：病毒株系(Strain)：同一个病毒在致病性上也有差异，也称为病毒生理小种，为了便于与真菌生理小种区分，称为株系。有强株系(症状表现显著，危害较大)和弱株系(症状不太显著)。如：TMV(弱株系)番茄 花叶或斑驳 TMV番茄条斑株系(强株系)坏死，条斑 TMV弱株系侵染烟草引发轻微斑驳，强株系则引发严重花叶。TMV（烟草花叶病毒）10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第22页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征交互保护作用(cross protection)：同一个病毒弱株系先接种植物后，就能够保护寄主免受病毒强株系严重伤害，即先侵染病毒能够保护植物不再受亲缘关系较近另一个病毒侵染。假如两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。拮抗作用和协生作用：拮抗作用：一个病毒侵染寄主植物后，可抑制另一个病毒再对植物侵染。如烟草蚀纹病毒可抑制天仙子花叶病毒和马铃薯病毒对烟草侵染。协生作用：两种病毒侵染一个寄主植物后，可使症状比单独侵染时更为严重，加剧为害。如：番茄花叶病毒 轻微斑驳 番茄 坏死 马铃薯病毒 轻微斑驳 10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第23页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征2.寄主原因寄主原因：一个病毒在不一样寄主上可表现不一样症状。如：TMV 普通烟全株型花叶症状 心叶烟局部性坏死枯斑潜伏侵染：一个病毒感染一些植物后，能够侵染但不表现症状现象。如：小麦黄矮病毒在除小麦之外禾本科作物上不表现症状。同一个病毒侵染同种寄主不一样品种上表现不一样：a.抗病品种：产生局部枯斑反应。TMV心叶烟。b.高抗或免疫品种品种：病毒侵入后增殖量极少或不能增殖。c.耐病品种：侵染寄主后可大量繁殖，但表现症状很轻微，这与真菌耐病性不一样。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第24页3.植物病毒病症状特征植物病毒病症状特征3.环境原因环境原因：环境原因可抑制或改变症状表现。（1）温度：35或10病害症状轻微，尤其是对于花 叶病，如油菜花叶病和TMV。隐症：已经表现病毒病症状植株，因为环境条件改变，症状消失现象。这种隐症在条件适当时又可重新表现症状。隐症：条件不一样。潜伏侵染：寄主不一样。（2）光照：过强、过弱都会影响症状表现。多数在光弱时花叶病症状轻易表现，接种易成功10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第25页植物病毒分类是将已知病毒按一定标准、相同程度或相关性次序排列，拼成一个系统，即分类系统。植物病毒判定主要目标是确定一个病毒在分类系统中地位，因为植物病毒个体微小，结构简单，对寄主依赖性强，判定工作难度大，技术性强，对工作条件要求高。判定植物病毒过去大多采取病毒间生物学特征差异，如所致症状类型、传输方式、寄主范围等；现在则增加了病毒核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方面方法。惯用方法有生物学试验、血清学检测和电子显微镜观察等。4.植物病毒判定植物病毒判定10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第26页一、生物学试验生物学试验目标是确定病原侵染性，用试验方法证实病毒与病害直接相关性。生物学试验还能够确定病毒传输方式，明确病毒所致病害症状类型和寄主范围。在分子生物学技术尚欠发展过去，只有生物学方法能够区分在遗传信息上一个核苷酸或者蛋白质中一个氨基酸变异，所以生物学试验是其它试验方法所不可取代。生物学试验中应用最多是判别寄主，即用来判别病毒或其株系含有待定反应植物。凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并含有特征性症状植物都可作为判别寄主。组合使用几个或一套判别寄主称为判别寄主谱。判别寄主谱中普通包含可系统侵柒寄主、局部侵染寄主和不受侵染寄主。如若区分经常出现黄瓜花叶病毒属三个组员，采取表41判别寄主。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第27页表4-1 黄瓜花叶病毒属三种病毒在判别寄主植物上症状反应 判别寄主 黄瓜花叶病毒 花生矮化病毒 番茄不孕病毒 花生 无病症 褪绿，矮花叶 无症状 菊花 不侵染？侵染 黄瓜 花叶 花叶 无花叶10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第28页二、电子显微镜技术与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源波长更短(属于短波电子流)，所以分辨率也大大提升(9.9l 0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。不过电子束穿透力低，样品厚度必须在10100nm之间。所以电镜观察需要特殊载网和支持膜，需要复杂制样和切片过程。病毒观察最惯用是负染技术负染技术和免疫电镜技术免疫电镜技术。所谓负染，是指经过重金属盐在样品四面堆积而加强样品外围电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相比，负染不但快速简易，而且分辨率高，当前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离细胞器、蛋白晶体观察及免疫学和细胞化学研究工作中，尤其是病毒快速判定及其结构研究所必不可少一 项技术。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第29页三、血清学技术 抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白抗原(antigen)特征，能够制备病毒特异性抗血清(antiserum)。先将纯化植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，取得抗血清。血清制备关键是病毒纯化，纯度高病毒才能取得特异性强抗血清。血清反应植物病毒与其血清反应有好各种，但依据原理都是抗原与抗体特异性结合。最惯用两种方法是琼脂双扩散琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定法。法。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第30页琼脂双扩散法：在一定浓度琼脂凝胶中，抗体和抗原相互扩散，在适当位置形成沉淀；沉淀线形状说明抗原和抗体相互关系。酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)法：该方法利用了酶放大作用，使免疫检测灵敏度大大提升。与其它检测方法相比较，ELISA有突出优点：一是灵敏度高，检测浓度可达1-10ngm1;二是快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复性好；四是检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对完整和降解病毒粒体都可检测，普通不受抗原形态影响；五是适合用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低,且可较长久保留。含有自动化及试剂盒发展潜力。ELISA是实现“快速、准确、经济”检测最好伎俩之一10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第31页四、核酸杂交及PCR技术血清学技术利用是病毒衣壳蛋白抗原性，检测目标是蛋白。因为核酸才是有侵染性，仅仅检测到蛋白并不能必定病毒有没有生物活性。所以，核酸检测技术也是判定植物病毒更可靠方法，主要有核酸杂交核酸杂交和聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)方法比较惯用。核酸杂交核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补DNA之间存在着碱基互补关系。在一定条件下，RNA-DNA形成异质双链过程称为杂交杂交。其中预先分离纯化或合成已知核酸序列片段叫做杂杂交探针交探针(Probe)，因为大多数植物病毒核酸是RNA，其探针为互补DNA(complementary DNA，cDNA)，也称为cDNA探针探针。核酸检测不但能够检测到目标病毒核酸，而且还能够检测出相 近病毒(或核酸)间同源程度。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第32页聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间DNA 区段。从已知序列合成两段寡聚核苷酸作为反应引物，它们分别与模板DNA两条链上各一段序列互补且位于待扩增DNA区段两侧。反应时，首先在过量两种引物及4种dNTP参加下对模板DNA进行加热变性。随之将反应混合液冷却至某一温度使引物与其靶序列发生退火。今后退火引物在耐热洲A聚合酶作用下得以延伸。如此重复进行变性、退火和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目标DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经2530个循环扩增倍数可达百万。PCR扩增在检测标本中病原核酸序列、由少许RNA生成cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变分析等方向已经得到广泛应用。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第33页五、物理化学等特征 在植物病毒研究过程中，人们发觉不一样病毒对外界条件稳定性不一样，这便成为区分不一样病毒依据之一。伴随新病毒种类发觉和分子生物学研究深入，人们也逐步认识到这些物理特征在区分不一样病毒中不足。1.稀释限点稀释限点(Dilution End Point，DEP)保持病毒侵染力最高稀释度，用10-1，10-2，10-3表示，它反应了病毒体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度高低。2.钝化温度钝化温度(Thermal Inactivation Point,TIP)处理十分钟使病毒丧失活性最低温用摄氏温度表示。TIP最低病毒是番茄斑萎病毒，只有有45；最高是烟草花叶病毒，为97；而大多数植物病毒在5570之间；3.体外存活期体外存活期(Longevity in vitro，LIV)在室温(2022)下，病毒抽提液保持浸染力最长时间。大多数病毒存活期在数天到数月。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第34页4 沉降系数及分子量沉降系数及分子量 沉降系数S是指一个物质在20水中在1达因(1981g)引力场中沉降速度，单位是每秒若干厘米，因这一单位太大，多采取其千分之一，即Svedberg单位。植物病毒S20常在50S到数千S之间。沉降系数测定要用超速分析离心机，依据该病毒在一定离心力下沉降速度来计算。有了沉降系数还能够来计算分子量。5光谱吸收特征光谱吸收特征 因为蛋白质和核酸都能吸收紫外线，蛋白质吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。所以260280比值能够表示病毒核酸含量多少，用于区分不一样病毒，比值小多是线条病毒，比值高可能是球状病毒；对同一个纯化病毒，紫外吸收值能够表示病毒浓度，对未纯化病毒其260280比值偏离标准值情况，说明病毒纯度.文件中常有E0.1%1cm260nm值,表示该病毒在01浓度，光径为1cm比色杯中在260nm处吸收值。6植物病毒化学特征植物病毒化学特征 主要是指核酸类型、核酸链数以及核酸分子量、核酸在病毒粒体中百分含量等。病毒核酸这些特征用在病毒分科、分属之中。10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第35页10/23/2024园林植物保护精品课程建设选取无毒材料采取茎尖脱毒组织培养法繁殖无毒苗，但栽植后必须及时防除传毒昆虫。选取抗病品种 选取耐病和抗病优良品种是防治病毒病根本路径。严格挑选无毒繁殖材料，如块根、块茎、种子、幼苗、插条、接穗、砧木等，以降低传染起源。茎尖脱毒5、病毒病综合防治植物病毒病的诊断与鉴定第36页10/23/2024园林植物保护精品课程建设组组脱毒育苗脱毒育苗植物病毒病的诊断与鉴定第37页10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第38页10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第39页10/23/2024植物病毒病的诊断与鉴定第40页