生物技术制药专家讲座.pptx

第一章 绪论 第一节 生物技术制药概念和内容一、生物技术制药概念 1、生物技术制药：是指利用生物系统或经过生物反应过程生产药品技术。生物技术制药第1页2、生物技术制药学：是一门说明生物药品研制原理、生产工艺及其分离纯化技术应用学科。当代生物技术制药学是医学、药学、生物学、化学、工程学与当代生物技术等相结合而形成综合学科。当代生物技术包含：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程，生化分离工程。生物技术制药第2页3、生物药品：是指以生物资源为原料或以生物技术为伎俩开发生产用作疾病预防、诊疗和治疗医药品。4、生物新技术药品：是指采取基因工程技术、细胞工程技术、抗体工程技术以及其它生物新技术开发生产重组蛋白质类、抗体类和核酸类药品。生物技术制药第3页二、生物技术制药研究内容和包括技术领域 1、发酵工程制药 是指利用微生物代谢过程生产药品技术。利用发酵工程生产药品有：抗生素、维生素、氨基酸、核酸、有机酸、蛋白质和肽类、酶类、激素类和免疫调整剂类等。主要研究微生物优良菌种选育、发酵工艺优化和产品分离纯化等问题。生物技术制药第4页2、基因工程制药 是指利用重组DNA技术改造生物物种遗传物质结构，借助重组生物细胞以生产药品或预防、治疗疾病综合技术。主要研究对应目标基因分离、判定和克隆，基因重组载体构建与导入，目标产物表示及其分离纯化等问题。生物技术制药第5页3、细胞工程制药 在细胞和细胞器水平上对生物遗传物质改造基础上，利用动、植物细胞大规模培养来生产药品技术。可生产天然动、植物药品，疫苗，人类生理活性因子等重组DNA产品。主要研究动、植物细胞高产株系选育、培养条件优化、新型生物反应器设计和应用以及产物分离纯化等问题。生物技术制药第6页4、酶工程制药 是指利用游离或固定化酶为催化剂生产药品技术。作用：除能全程合成药品分子外，还能用于药品分子转化。特点：生产工艺结构紧凑、专一性强，目标产物产量高、轻易回收，酶可重复利用等特点。任务：主要研究酶起源，酶分离制备，酶固定化，酶反应器及对应操作条件优化等。生物技术制药第7页5、生化工程制药 是指利用生化分离技术从生物反应液或天然生物资源中提取分离制备药品技术。主要研究药用生物资源选择，药用成份种类、含量及其分布，药品结构、性质及其提取纯化工艺优化。生物技术制药第8页作业：1、名词解释 生物技术制药，生物药品，生物新技术药品2、生物技术制药包括技术领域 生物技术制药第9页第二节 生物药品性质与分类 一、生物药品性质1、药理学特征（1）治疗针对性强，疗效可靠。治疗生理、生化机制合理，如胰岛素治疗糖尿病。（2）药理活性高。是从大量原料中精制出高活性物质。生物技术制药第10页（3）毒副作用小，营养价值高。主要有蛋白质、核酸、糖类和脂类等。（4）生理副作用常有发生。生物间存在种属和个体差异，不一样生物中活性物质结构有很大差异，常出现免疫反应、过敏反应。生物技术制药第11页2、在生产、制备中特征（1）有效物质含量低，杂质种类多且含量高。如：胰腺中胰岛素含量仅为0.002%，生长激素抑制素（Somatostatin）在十万只羊下丘脑中仅含有1mg。（2）稳定性差，易变性、易失活。生物药品以其严格空间构象来维持其生物活性功效，含有特定活性部位，一旦遭到破坏，就失去其药理作用。生物技术制药第12页（3）易腐败。均为营养价值高物质，极易染菌、腐败，从而造成有效物质被破坏、失去活性。（4）对环境条件敏感，生产条件改变对产品质量影响较大。（5）相对分子量较大（几千至几百万），组成份复杂，常以多组分存在，大多是复杂蛋白质混合物。生物技术制药第13页（6）用量少，价值高。（7）注射用药有特殊要求。生物药品易被肠道中酶所分解，给药路径主要是注射用药。对药品制剂均一性、安全性、稳定性、有效性等都有严格要求。生物技术制药第14页3、检验上特殊性 因为生物药品含有特殊生理功效，所以生物药品不但要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标，这是生物药品生产开发关键。生物技术制药第15页二、生物药品质量确保许多生物药品（细胞因子药品）都参加人体机能精细调整，任何性质或数量上偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害，所以必须进行严格质量控制。生物药品质量控制包含以下几项关键点：产品结构和性质判别，纯度、活性、安全性、稳定性和抑制性检验或试验。生物技术制药第16页任何单一分析方法都无法满足对该类产品检测要求，需综合化学、生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科相关理论和技术。生物技术制药第17页1、判定方法（1）化学方法：生物药品结构、性质和纯度判别常采取化学方法，包含元素分析、红外、紫外、核磁共振和质谱等方法。（2）生化和生物学方法 欲确定生物大分子分子质量、特定空间立体结构和特定生理功效还需要结合生化和生物学方法加以确定。包含电泳方法、受体结合试验、免疫学分析方法等。生物技术制药第18页2、安全性评价 经过动物试验来判定其安全性。（1）普通安全性要求：无菌、无病毒、无热原、无致敏原等。（2）药代动力学和毒理学研究。（3）致突变、致癌和致畸等遗传毒理性质考查。生物技术制药第19页三、生物药品分类可按其原料起源、或按其生理功效和临床用途、或按其生物化学性质来分类。通常按其生物化学性质来分类。生物技术制药第20页（一）按所采取技术伎俩来分1、生物技术药品 指采取DNA重组技术、蛋白质工程技术、单克隆抗体技术等当代生物技术研制重组蛋白质类、抗体类和核酸类药品。生物技术制药第21页（1）重组蛋白质类细胞因子类：包含干扰素（INF）类、白细胞介素(IL)类、集落刺激因子(CSF)类、生长因子(GF)类、肿瘤坏死因子（TNF）类。激素类：生长激素、胰岛素等。治疗心脑血管病活性蛋白质类：包含溶解血栓类、血凝因子类。生物技术制药第22页治疗和营养神经活性蛋白质类：包含神经生长因子、神经营养因子、神经营养素等。可溶性细胞因子受体类：包含IL1受体、IL4受体、TNF受体等。导向毒素类：包含IL2导向毒素、IL4导向毒素、单克隆抗体导向毒素等。生物技术制药第23页（2）抗体药品 由分化B淋巴细胞产生能与抗原特异性结合免疫球蛋白。（3）核酸药品（基因药品）分为反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸和基因疫苗与基因药品。多用于有害基因诊疗与治疗，阻断有害基因表示。生物技术制药第24页2、天然生化药品采取生化分离技术直接从动物、植物、微生物和海洋生物中分离提取制备天然药品。生物技术制药第25页3、微生物药品 利用微生物发酵工程技术生产药品。4、合成与部分合成生物药品 依据天然药品结构，采取化学合成技术开发生产药品。生物技术制药第26页（二）按功效和用途来分1、治疗药品 用于疾病治疗（疑难病、多发病），如糖尿病、免疫缺点病、心脑血管病、肿瘤等。2、预防药品 用于传染病预防，包含各种疫苗、菌苗和类毒素等。生物技术制药第27页3、诊疗药品 用于疾病临床诊疗。包含免疫诊疗试剂、酶诊疗试剂、抗体诊疗试剂、基因诊疗药品和放射性诊疗药品等。生物技术制药第28页（三）按药品化学本质和生物化学性质来分类1、氨基酸及其衍生物类 谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、N-乙酰半胱氨酸、L-二羟基苯丙氨酸等20各种氨基酸及其衍生物，全世界总产量达数百万吨。2、有机酸类 乙酸、乳酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸、葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、D-异抗坏血酸、丙酮酸等。生物技术制药第29页3、酮醇类 乙醇、丙醇、丁醇、甘油等。4、维生素类 维生素B2、维生素B12、-胡萝卜素、维生素C和维生素D前体麦角醇等。生物技术制药第30页5、酶及辅酶类（1）酶类药品消化酶类：胰酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。消炎酶类：溶菌酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等。心血管疾病治疗酶：弹性蛋白酶、激肽释放酶（扩张血管、降血压）、尿激酶、纤溶酶、溶栓酶等。抗肿瘤酶：L-天冬氨酸酶（治疗淋巴瘤和白血病）、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶等。生物技术制药第31页其它酶类SOD：去除自由基、抗衰老，治疗类风湿关节炎和放射病。PEG-腺苷脱氨酶：治疗联合免疫缺点症。RNA酶：用于抗RNA病毒。青霉素酶：治疗青霉素过敏。生物技术制药第32页（2）辅酶类 NAD，NADP（辅酶），FMN（黄素单核苷酸），FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸），辅酶Q10，辅酶A等。生物技术制药第33页6、脂类（1）磷脂类：卵磷脂、脑磷脂，用于治疗肝病、冠心病和神经衰弱。（2）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素（PGI2）PUFA：有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，用于降血脂、降血压和抗脂肪肝。PGI2：抗血栓、抗动脉粥样硬化。生物技术制药第34页（3）胆酸类：去氧胆酸（治疗胆囊炎），鹅去氧胆酸（溶胆结石、降低血胆固醇）。（4）固醇类：胆固醇（用于生产人工牛黄），麦角固醇，-谷固醇（降低血胆固醇）（5）卟啉类：血红素，胆红素等（用于治疗肝炎和肿瘤诊疗）生物技术制药第35页7、多肽和蛋白质类 该类药品多是人体内生理活性因子，包含激素、免疫调整剂和细胞生长因子等。该类药品分子量不一样、性质差异较大。当前已用于临床有19种，即将上市有20各种。生物技术制药第36页（1）蛋白质类：有血清白蛋白、丙种球蛋白和胰岛素等。（2）多肽类：有激素和免疫调整剂等。生物技术制药第37页（3）细胞生长因子类：动物细胞分泌含有各种生物活性因子，对人类和动物细胞生长与分化有主要调整作用。有干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等四大类系列数十种细胞因子。如白细胞介素-2（IL-2）用于治疗肾细胞癌，即将上市有IL-3、IL-6等。-2a干扰素、-2b干扰素用于治疗毛细胞性白血病，即将上市有-干扰素N3、-1b干扰素、-干扰素和-1b干扰素等。生物技术制药第38页8、核酸类及其降解物和衍生物类（1）核酸类：从牛、猪肝脏中提取RNA用于肝癌、肝硬化治疗。免疫RNA（iRNA）用于肿瘤免疫治疗。（2）多聚核苷酸：聚肌苷酸和巯基聚胞苷酸用于抗病毒、抗肿瘤。（3）核苷、核苷酸及其衍生物：ATP、CTP、cAMP、CDP-胆碱等，可将它们经化学修饰后用于治疗肿瘤和抗病毒。生物技术制药第39页9、糖类活性多糖有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功效、升高白细胞和抗炎等作用。有银耳多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、肝素、透明质酸、壳聚糖、刺参多糖等。生物技术制药第40页10、生物制品类指从微生物、原虫、动物或人体材料直接制备或用当代生物技术、化学方法制成作为预防、治疗和诊疗特定传染病或其它疾病制剂。生物制品用于各种传染病诊疗、预防和治疗，包含各种疫苗、菌苗和类毒素。生物技术制药第41页作业：1、阐述生物药品特征。2、阐述生物药品质量确保办法。生物技术制药第42页第二章 基因工程制药第一节 基因工程制药概述 一、基因工程概念基因工程（Gene engineering）又称DNA重组技术（DNA recombination technology）：是指按人意志，将某一生物体（供体）遗传信息（目标基因）在体外经人工与载体DNA重组，组成重组DNA，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引入外源DNA片段（目标基因）在受体细胞内得以表示和遗传。基因工程是能人工定向改造生物遗传性状育种新技术。生物技术制药第43页二、基因工程技术优点1、它能从极其复杂各种生物细胞内取得所需目标基因，并将此目标基因在体外进行剪切、拼接、重组，并转入到受体细胞中，从而合成出人们所需新产物。2、它能使带有各种各样遗传信息DNA 片段越过不一样生物物种间特异细胞壁而转入到完全不一样生物体内，定向地控制、修饰和改变受体遗传和变异，从而创造出自然界所未有含有新遗传性状生物新种，并增产出数百数千倍人们所需生物新药。生物技术制药第44页三、在生物技术体系中作用基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程是组成生物技术主体，它们是相互依赖、相辅相成。在这些技术体系中基因工程起着主导作用，因为只有用基因工程改造过生物细胞，才能赋予其它技术以新生命力。生物药品1997年在国际市场销售额有260亿美元，有50各种投放市场，正在临床试验有200各种，其中有100各种很快上市。生物技术制药第45页第二节 基因工程惯用工具酶和克隆载体 一、基因工程制药中惯用工具酶基因工程主要特点之一是在体外实施DNA分子切割和重新连接。比如：要取得所需药品目标基因并要将此特定目标基因与载体DNA连接在一起，在很大程度上依赖于一些工具酶。所以，基因工程要得以实施，首先要为体外操作DNA分子提供一系列工具酶。生物技术制药第46页其中最主要是能接一定核苷酸序列切断DNA分子限制酶，并能把两种DNA片段连接起来DNA连接酶。伴随越来越多酶分子被人们发觉，这类工具酶数量和用途不停增加，许多厂商已能生产并广泛供给各种优质工具酶，这不但大大简化了分子克隆操作，而且拓宽了基因工程研究领域。生物技术制药第47页（一）限制酶（Restriction enzymes）限制性核酸内切酶，是一类专一性很强核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定核苷酸序列，切断DNA双链。对DNA分子上特定核苷酸序列和碱基作用专一性，以及对磷酸二酯键断裂方式上特殊性。生物技术制药第48页1、限制酶种类（1）型酶：早期提取酶类，是一类复杂多功效酶，在基因工程上应用价值不大。生物技术制药第49页（2）型酶：相对分子量较小，2万10万，是简单单功效酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2+。特点：能识别双链DNA上特异核苷酸序列，底物作用专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。自20世纪70年代以来，从几乎全部细菌属、种中都发觉最少一个型限制酶，同一品系菌株中也常有识别不一样序列两种酶。至今已发觉和分离成功型酶大约有500种，其中有些已商品化。生物技术制药第50页2、限制酶命名是以寄主微生物属名第一个字母（大写）和种名前两个字母（小写）写成斜体字3个字母缩写，菌株名第一个字母以非斜体加在这三个字母后面。若同一菌株里有几个不一样限制酶时，则以罗马数字加以区分。例：Hind限制酶是从流感嗜血杆菌菌株Haemophilus influenzae d中分离出来第三种限制酶。EcoR表示从大肠埃氏菌菌株RYB中分离出来第一个限制酶。生物技术制药第51页属名属名属名属名 种名种名种名种名 菌株名菌株名菌株名菌株名 H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae 嗜血流感杆菌株嗜血流感杆菌株嗜血流感杆菌株嗜血流感杆菌株d d H i nH i n d III d III同一菌株中分离出第三个限制性核酸内切酶同一菌株中分离出第三个限制性核酸内切酶同一菌株中分离出第三个限制性核酸内切酶同一菌株中分离出第三个限制性核酸内切酶生物技术制药第52页3、限制酶特征（1）不一样限制酶能专一地识别不一样特异核苷酸序列（核苷酸序列不一样，序列大小不一样）EcoR：5-GAATTC-3Hae:5-(A/T)GGCC(A/T)-3Asu:5-GGNCC-3EcoR：5-CC(A/T)GG-3Mbo：5-GATC-3生物技术制药第53页（2）各种限制酶识别序列都含有回文结构限制酶所识别序列两条核苷酸链中碱基排列次序是完全相同，即正读与反读都相同，这种结构称回文结构（Palidromic structure）。例：BamH识别序列：5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5生物技术制药第54页EcoEcoR R 识别序列：识别序列：识别序列：识别序列：(Eco(EcoR R 切割位点切割位点切割位点切割位点)5-G C T 5-G C T G A A T T CG A A T T C G A G-3G A G-3 3-C G A 3-C G A C T T A A GC T T A A G C T C-5C T C-5(Eco(EcoR R 切割位点切割位点切割位点切割位点)生物技术制药第55页（3）各种限制酶切割类型是各式各样，切后形成各种粘性或平整末端。一个是限制酶错位切断DNA双链而形成彼此互补单链末端，称粘性末端（Cohesive ends）如限制酶EcoR（大多限制酶都是这种切割方式）：5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5这种含有粘性末端DNA片段很轻易经过单链区碱基配对而连接在一起，产生线状或环状DNA分子。生物技术制药第56页Eco Eco R R 产生产生产生产生55粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 5-G 5-G-C C-T T-GG-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G-3G-33-C3-C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C-5C-5 Eco Eco R I 37 R I 37 5-G 5-G-C C-T T-GG-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-GG-33 3-C 3-C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-GG-C C-T T-C C -5-5 生物技术制药第57页PstPst 产生产生产生产生33粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 5-G 5-G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A-GG-GG-A A-G-3G-3 3-C 3-C-GG-A A-GG-A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C-5C-5PstPst 37 37 5-G 5-G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A-OHOH PP-GG-GG-A A-G-3G-3 3-C 3-C-GG-A A-GG-PP OHOH-A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C C-55 生物技术制药第58页另一个是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成双链末端，称为平整末端（Flush ends）。如限制酶Alu：5-AGCT-3 5-AG CT-3 3-TCGA-5 3-TC GA-5生物技术制药第59页 Pvu Pvu II II 产生平整末端产生平整末端产生平整末端产生平整末端5-5-GG-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-G-3G-33-C3-C-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-T T-C-5C-5PvuPvuII 37 II 37 5-G 5-G-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-G-3G-3 3-C 3-C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C-5C-5 生物技术制药第60页依据限制酶识别序列和切点位置，还能够发觉下面两种情况：识别序列不一样限制酶，切割后有可能产生相同粘性末端：BamH:5-GGATCC-3 5-G 5-GATCC-3 3-C CTAGG-5 3-CCTAG-5 G-5Bgl：5-AGATC T-3 5-A 5-GATCT-3 3-T CTAGA-5 3-TCTAG-5 A-5Mbo：5-GATC-3 5-GATC-3 3-CTAG-5 3-CTAG-5生物技术制药第61页以上三种限制酶识别不一样核苷酸序列，但切割后产生相同5-GATC粘性末端。像这么一类限制酶称同切口限制酶或同裂酶。这类酶DNA酶解片段都可在体外相互重组，在DNA连接酶作用下，能够得到嵌合重组DNA，称为异源二聚体。这种二聚体不再能被原来两种限制酶所识别，有利于得到大量重组DNA分子。生物技术制药第62页起源不一样限制酶其识别序列相同，但因为其切点位置不一样，因而产生切割末端不一样。例：Xmz:5-CCCGGG-3 5-C 5-CCGGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGGCC C-5 Sma:5-CCCGGG-3 5-CCC-3 5-GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG-5 3-CCC-5 生物技术制药第63页（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格识别序列。一些限制酶在非标准反应条件下，可能造成酶识别序列特异性发生改变，会严重干扰限制酶在DNA重组中正常应用。所以，全部限制酶反应都应在标准条件下进行。尤其要控制pH值、离子强度、二价离子浓度等反应条件。生物技术制药第64页在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子浓度、酶与DNA百分比等参数单独或同时发生改变非标准条件下，会造成限制酶识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶第2活性或星活性。产生第2活性酶常在酶名称右上角加星号“*”。例：EcoR:5-GAATTC-3 EcoR*:5-AATT-3生物技术制药第65页（二）DNA连接酶能将两段DNA拼接起来酶叫DNA连接酶。这类酶发觉和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。生物技术制药第66页DNADNA连接酶作用连接酶作用 催化催化DNA 5DNA 5磷酸和磷酸和33羟基之间形成磷酸二脂键羟基之间形成磷酸二脂键 5 G 5 G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A-GG-GG-A A-G 3G 3 3 3 C C-GG-A A-GG-A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 55 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A GA G-GG-A A-G 3G 33 C3 C-GG-A A-GG A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C-C 5 5OHOHPPnicknickPPOHOHnicknickDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶生物技术制药第67页1、T4噬菌体DNA连接酶起源于T4噬菌体感染大肠杆菌，分子量68000u，催化DNA 5磷酸和3羟基之间形成磷酸二脂键。（1）连接带有匹配粘性末端双链DNA分子，也可连接带切口DNA。在PEG低浓度下可促进DNA分子间连接。（2）连接平整末端双链DNA分子，反应速率要比上述粘性末端连接慢得多。但在单价阳离子和低浓度PEG存在条件下可大大提升平整末端连接速率。生物技术制药第68页 T T T T4 4 4 4-DNA-DNA-DNA-DNA连接酶催化连接酶催化连接酶催化连接酶催化粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接 5-G 5-G-C C-T T-GG-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G-3G-33-C3-C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C-5C-5T TT T4 44 4-DNA-DNA-DNA-DNA连接酶连接酶连接酶连接酶 5-G 5-G-C C-T T-GG-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-GG-33 3-C 3-C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-GG-C C-T T-C C -5-5 生物技术制药第69页T T T T4 4 4 4-DNA-DNA-DNA-DNA连接酶催化连接酶催化连接酶催化连接酶催化平整末端连接平整末端连接平整末端连接平整末端连接5-5-GG-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-G-3G-33-C3-C-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-T T-C-5C-5T TT T4 44 4-DNA-DNA-DNA-DNA连接酶连接酶连接酶连接酶 5-G 5-G-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-G-3G-3 3-C 3-C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C-5C-5 PEGPEG生物技术制药第70页2、大肠杆菌DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶可催化相互匹配粘性末端5突出端与3 末端双链DNA之间形成磷酸二酯键，但需NAD作辅助因子。该酶普通不能催化平整末端双链DNA间连接，但在PEG或Ficoll(聚蔗糖)存在下也能催化平整末端连接。生物技术制药第71页（三）DNA聚合酶（DNA polymerase）是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤一类酶。在基因工程操作中用于DNA体外合成反应。这类酶作用时大多需要DNA模板并优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。另有一个聚合酶，即反转录酶，是依赖于RNADNA聚合酶，可优先拷贝RNA。生物技术制药第72页1、大肠杆菌DNA聚合酶分子量109000u，由一条多肽链组成，约有1000个氨基酸，酶分子中含有一个双硫键和一个巯基，还含锌离子，基本是一个椭圆形结构，是一个多功效酶。生物技术制药第73页（1）该酶含有三种活力：53聚合酶活力：底物为单链DNA模板及带3羟基DNA引物，聚合脱氧核苷酸，使之逐一接到引物上。53外切酶活力：底物是双链DNA或RNADNA杂交体，从5端降解DNA或RNA。35外切核酸酶活力：底物是带有3羟基端双链DNA或单链DNA，从3羟基端逐一切除核苷酸降解DNA。5GATTCGTAACGGTA-OH-3 3CTAAGCATTGCCAT5 生物技术制药第74页大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 作用作用作用作用5353DNADNA聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性3 G3 G-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-GG-A 5A 55 C5 C-GG-A A-GG-T T-OHOHDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 5 ppp dN Mg5 ppp dN Mg2+2+3 G3 G-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-GG-A 5A 55 5 C C-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-OHOH生物技术制药第75页（2）该酶主要用途是采取切口平移法，以放射性脱氧核苷酸置换原来dNTP标识DNA，从而制作DNA探针。另外，用于修补DNA缺损部位空隙。5-GATT-3 5-CGTAACGCCA-3 3-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5 5-GATTCGTAACTCG-35-CA-3 3-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5生物技术制药第76页2 2、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 大片段（大片段（大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶：酶：酶：酶：大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理，经枯草杆菌蛋白酶处理，经枯草杆菌蛋白酶处理，经枯草杆菌蛋白酶处理，取得取得取得取得N N端三分之二大肽段，即为端三分之二大肽段，即为端三分之二大肽段，即为端三分之二大肽段，即为KlenowKlenow酶。酶。酶。酶。KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有酶仍拥有酶仍拥有5353DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和3535核酸外切酶活性，但失去了核酸外切酶活性，但失去了核酸外切酶活性，但失去了核酸外切酶活性，但失去了5353核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。生物技术制药第77页 KlenowKlenow酶基本作用：酶基本作用：酶基本作用：酶基本作用：补平由核酸内切酶产生补平由核酸内切酶产生补平由核酸内切酶产生补平由核酸内切酶产生5555粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 DNADNA片段同位素末端标识片段同位素末端标识片段同位素末端标识片段同位素末端标识 cDNAcDNA第二链合成第二链合成第二链合成第二链合成 双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列序列序列生物技术制药第78页 KlenowKlenow酶作用一酶作用一酶作用一酶作用一 补平由核酸内切酶产生补平由核酸内切酶产生补平由核酸内切酶产生补平由核酸内切酶产生5555粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 5 G-C-T-G-5 G-C-T-G-OHOH PP-A-A-T-T-C-G-A-G 3-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-3 C-G-A-C-T-T-A-A-PP OHOH-G-G-C-T-C 5C-T-C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 G-C-T-G5 G-C-T-G-A-A-T-T-A-A-T-T-OHOH PP-A-A-T-T-C-G-A-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 33 C-G-A-C-T-T-A-A-3 C-G-A-C-T-T-A-A-PP OH-OH-T-T-A-AT-T-A-A-G-C-T-C-G-C-T-C 5 5 生物技术制药第79页 KlenowKlenow酶作用二酶作用二酶作用二酶作用二 DNA DNA片段同位素末端标识片段同位素末端标识片段同位素末端标识片段同位素末端标识5 G-C-T-G-5 G-C-T-G-OHOH P P-A-A-T-T-C-G-A-G 3-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-3 C-G-A-C-T-T-A-A-PP OHOH-G-C-T-C-G-C-T-C 5 5 KlenowKlenowa a a a-3232P-ppP-ppp pdNdN5 5 G-C-T-GG-C-T-G-A-A-T-T-A-A-T-T-OHOH PP-A-A-T-T-C-G-A-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 33 3 C-G-A-C-T-T-A-A-C-G-A-C-T-T-A-A-PP OH-OH-T-T-A-A-T-T-A-A-G-C-T-C 5G-C-T-C 5 生物技术制药第80页3、Taq DNA聚合酶是从极度嗜热水生栖热菌（Thermas aquaticus）中分离纯化而来，是一个耐热聚合酶，分子量6500u。当前生产并出售是Ampli TaqTM DNA聚合酶。该酶含有53聚合酶活力和依赖于聚合作用53外切酶活力。该酶最正确作用温度7580，为防止引物在模板上解离，往往要在低于最适温度条件下起始聚合反应。该酶可用于对DNA进行测序，但主要用于PCR（聚合酶链式反应），对DNA分子特定序列（目标基因）进行体外扩增。生物技术制药第81页4、T4噬菌体DNA聚合酶起源于T4噬菌体感染大肠杆菌，含有53聚合酶活力和35外切酶活力。作用：补平和标识限制酶消化DNA后产生3凹端。5-G-3 5-GGATC-3 3-CCTAG-5 3-CCTAG-5 对带有3突出端DNA分子进行末端标识。标识用作探针DNA片段。将双链DNA末端转化成平端。生物技术制药第82页 T4-DNAT4-DNA聚合酶作用一聚合酶作用一聚合酶作用一聚合酶作用一 切平由核酸内切酶产生切平由核酸内切酶产生切平由核酸内切酶产生切平由核酸内切酶产生3 3 3 3 粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 5 G-C-T 5 G-C-T-C-T-G-C-A-C-T-G-C-A-OHOH P P-G-G-G-A-GG-A-G 3 3 3 3 C-G-AC-G-A-G-G-P P HOHO-A-C-G-T-C-A-C-G-T-C-C-T-CC-T-C 5 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 5 5 G-C-T G-C-T-C C-OHOH PP-G-G-G-A-G 3G-A-G 3 3 3 C-G-A C-G-A-G-G-PP HOHO-C-C-C-T-CC-T-C 5 5生物技术制药第83页 T4-DNAT4-DNA聚合酶作用二聚合酶作用二聚合酶作用二聚合酶作用二 DNA DNA片段同位素末端标识片段同位素末端标识片段同位素末端标识片段同位素末端标识5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 35 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 T4-DNA polT4-DNA pol 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OHOH HOHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 T4-DNA polT4-DNA polMgMg2+2+a aa a-3232P-dNTPP-dNTP55 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3G-A-G-T 333 C-G-A-GC-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 生物技术制药第84页5、经修饰T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）起源于T7噬菌体感染大肠杆菌，含有较强连续53聚合酶活力和35外切酶活力。它所催化合成DNA平均长度要比其它DNA聚合酶大得多，可用于长段模板上引物延伸反应。经化学修饰T7噬菌体DNA聚合酶商品名为测序酶，去除了35外切酶活力，保持了53聚合酶活力，它连续合成能力很强。主要用于Sanger双脱氧末端终止法对长段DNA分子测序。现又用基因工程伎俩生产出一个改进测序酶2.0版，完全丧失了外切酶活力。生物技术制药第85页6、反转录酶该酶为依赖于RNADNA聚合酶，起源于鼠或禽反转录病毒。该酶主要以mRNA为模板转录合成互补双链cDNA，也可用于制备杂交用探针和标识带5突出端DNA片段。生物技术制药第86页 反转录酶作用一反转录酶作用一反转录酶作用一反转录酶作用一 以以以以mRNAmRNA为模板反转录合成为模板反转录合成为模板反转录合成为模板反转录合成cDNAcDNA链链链链3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-18反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNA生物技术制药第87页 反转录酶作用二反转录酶作用二反转录酶作用二反转录酶作用二 双向外切双向外切双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中杂合链中杂合链中杂合链中RNARNA链链链链3 RNA3 RNA5 DNA5 DNA3355反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA5 DNA5 DNA3355反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶5 DNA5 DNA33生物技术制药第88页（四）核酸酶（四）核酸酶（四）核酸酶（四）核酸酶 1 1、单链核酸外切酶：核酸外切酶、单链核酸外切酶：核酸外切酶、单链核酸外切酶：核酸外切酶、单链核酸外切酶：核酸外切酶VIIVII（ExoVIIExoVII）核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶VIIVII双向外切双向外切双向外切双向外切DNADNA单链单链单链单链55335533ExoVIIExoVII55553333生物技术制药第89页 2 2、双链核酸外切酶：核酸外切酶、双链核酸外切酶：核酸外切酶、双链核酸外切酶：核酸外切酶、双链核酸外切酶：核酸外切酶 III III（ExoIIIExoIII）核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶 III III 特异性地从特异性地从特异性地从特异性地从3 3 端外切双链端外切双链端外切双链端外切双链DNADNA55333355ExoIIIExoIIIMgMg2+2+55553333生物技术制药第90页 3 3、双链核酸外切酶：、双链核酸外切酶：、双链核酸外切酶：、双链核酸外切酶：l l l l 核酸外切酶（核酸外切酶（核酸外切酶（核酸外切酶（l l l lExoExo）l l l l核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从核酸