DB43_T+2175-2021辣椒远缘杂交胚拯救技术操作规程.docx

ICS 67.080.20CCS B 3143湖南省地方标准DB43/T 21752021辣椒远缘杂交胚拯救技术操作规程Technical Regulation for embryo rescue of Distant Hybrid in Pepper2021- 08 - 29 发布2021- 10 - 29 实施湖南省市场监督管理局发 布目次前言 1 范 围 12 术语和定义 13 试剂和设备 14 胚拯救培养基制备25 胚拯救技术流程2附录 A（资料性） 辣椒胚拯救培养基配方 3前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件主要起草单位：湖南农业大学、湖南省蔬菜研究所。本文件主要起草人：杨博智、周书栋、郑井元、马艳青、戴雄泽、李雪峰、张竹青、陈文超、杨莎、梁成亮、李鑫、邹学校。辣椒远缘杂交胚拯救技术规程1 范围本文件规定了辣椒远缘杂交胚拯救的术语和定义、试剂和设备、培养基制备、胚拯救技术流程等操作规程。本文件适用于辣椒远缘杂交胚拯救。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1远缘杂交指不同种、属或亲缘关系更远的植物类型间进行的杂交。2.2胚拯救织培养技术，将合子胚转至适合的培养基中离体培养，使其能正常发育成完整植株的方式。3 试剂和设备3.1 试 剂所有试剂等级均为分析纯，见表 1。表 1 辣椒远缘杂交胚拯救技术所需试剂3.2 仪器设备超纯水仪、电子分析天平（精确度：0.0001 g）、pH 计（或 pH 试纸）、刻度容量瓶（量程分别为 100 mL、 500 mL）、移液枪（量程分别为 100 L、1 mL、10 mL）、低温冷藏冰箱（温度范围：010）、高压蒸汽灭菌锅植物远缘杂交获得的合子胚常在发育早起阶段就败育或退化，无法收获杂交种子。胚拯救指采用组试剂名称无机试剂次氯酸钠、氢氧化钠、盐酸、硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、氯化钴、硫酸亚铁、EDTA 二钠盐、有机试剂酒精、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、叶酸、生物素植物生长调节剂萘乙酸、激动素、赤霉素、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚-3-乙酸其他琼脂粉、蔗糖4 胚拯救培养基制备4.1 培养基类型培养基包括胚拯救培养基和幼胚分化成苗培养基，其配方见附录 A。4.2 消毒和灭菌培养基配制好后，调 pH 值为 5.8，置于高压蒸汽灭菌锅中 121，1.05 kg/cm2 条件下灭菌 15 min。5 胚拯救技术流程5.1 授粉收集父本花粉，选取母本植株上将开未开的花苞，去除雄蕊，对其进行人工授粉，授粉 24 h 后用75 mg/L 的 2,4-D 溶液涂抹母本植株上授粉花苞的花梗。5.2 幼胚培养5.3 幼胚分化成苗在超净工作台中，取出带胚根的辣椒胚，剥离种皮，接种于幼胚分化成苗培养基中培养至成苗。培养条件为光照阶段（281），黑暗阶段（201），光照时间 16 h/d，光照强度 2000 lx。5.4 炼苗与移栽待再生苗长至（47）片真叶时，打开培养瓶瓶盖，置光照培养室中适应外界环境 2 d3d 后。将组培苗取出，洗净根部的培养基，移栽至基质中黑暗条件下炼苗，温度为（281），湿度 90。炼苗 5 d 后，将室内环境逐步调整到与辣椒苗在外界生长的环境相近，继续培养 15 d，移栽幼苗至室外。选用辣椒为授粉后 18 d 获得的青果，流水下冲洗果实表面 30 s，在超净工作台中，用 75酒精棉球擦拭果实表面，用消毒后的解剖刀将果实竖切成两半，再用无菌镊子取出果实内未成熟种胚，接种至胚拯救培养基中，黑暗培养至胚根产生。培养温度为（281）。附 录 A（资料性）辣椒胚拯救培养基配方培养基名称配方成分胚拯救培养基825 mg/L 硝酸铵、950 mg/L 硝酸钾、220 mg/L 氯化钙、185 mg/L 七水硫酸镁、85 mg/L 磷酸二氢钾、0.5 mg/L 碘化钾、6.2 mg/L 硼酸、22.3 mg/L 四水硫酸锰、8.6 mg/L 七水硫酸锌、0.25 mg/L 钼酸钠、0.025 mg/L 氯化钴、27.8 mg/L 硫酸亚铁、37.8 mg/L EDTA 二钠盐、100 mg/L 肌醇、0.5 mg/L 烟酸、0.5 mg/L 盐酸吡哆醇、0.5 mg/L 盐酸硫胺素、2 mg/L 甘氨酸、0.5 mg/L 叶酸、0.05 mg/L 生物素、0.05 mg/L a-萘乙酸、0.25 mg/L 激动素、0.2 mg/L赤霉素、6 g/L 琼脂粉、30 g/L 蔗糖幼胚分化成苗培养基1650 mg/L 硝酸铵、1900 mg/L 硝酸钾、440 mg/L 氯化钙、370 mg/L 七水硫酸镁、170 mg/L 磷酸二氢钾、0.83 m/Lg 碘化钾、6.2 mg/L 硼酸、22.3 mg/L 四水硫酸锰、8.6 mg/L 七水硫酸锌、0.25 m/Lg 钼酸钠、0.025 mg/L 硫酸铜、0.025 mg/L 氯化钴、27.8 mg/L 硫酸亚铁、37.3 mg/L EDTA 二钠盐、100 mg/L 肌醇、0.5 mg/L 烟酸、0.5 mg/L 盐酸吡哆醇、0.1 mg/L 盐酸硫胺素、2.0 mg/L 甘氨酸、2 mg/L 6-氨基腺嘌呤、0.5 mg/L 吲哚乙酸、6 g/L 琼脂粉、30 g/L 蔗糖