酶的化学本质结构和特性公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

酶主要简介酶化学本质、结构和特性；酶作用动力学；酶作用机理；酶应用；还简介了别构酶、共价调整酶、同工酶等概念、性质、生物学意义。第1页第1页一、酶概念（一）酶生物学意义 6CO2+6H2O+能量 C6H12O6+6O2 植物动物N2+3H2 500,300大气压Fe2NH3N2+3H2 2NH3一些微生物第2页第2页（二）酶是生物催化剂 1酶与普通催化剂共同点（1）用量少而催化效率高（2）能加快化学反应速度，但不改变平衡点，反 应前后本身不发生改变 如 CO2+H2O H2CO3 第3页第3页（3）减少反应所需活化能 第4页第4页例 2H2O22H2O+O2 反 应活化能非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol第5页第5页2酶作为生物催化剂特殊点（1）高催化效率 以摩尔为单位进行比较，酶催化效率比化学催化剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。例 2H2O22H2O+O2 1mole H2O2酶 能催化 5106mole H2O2分解 1mole Fe3+只能催化610-4mole H2O2分解 第6页第6页转换数（turnover number,TN or kcat）:每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物摩尔数。第7页第7页（2）高专一性（3）温和反应条件（4）酶在体内受到严风格控 如酶浓度调整、激素调整、反馈调整、克制剂和激活剂调整、别构调整、酶共价修饰调整、酶原活化等。（5）酶催化活力与辅酶、辅基和金属离子相关 第8页第8页（三）酶化学本质 1大多数酶是蛋白质（Most enzymes are proteins）1926年美国Sumner 脲酶结晶，并指出酶是蛋白质 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶，并进一步证实了酶是蛋白质。J.B.SumnerJ.H.Northrop第9页第9页 20世纪80年代发觉一些RNA有催化活性，尚有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质老式概念受到很大冲击。第10页第10页2一些RNA有催化活性 1982年美国T.Cech等人发觉四膜虫rRNA前体能在完全没有蛋白质情况下进行自我加工，发觉RNA有催化活性 Thomas Cech University of Colorado at Boulder,USA 第11页第11页第12页第12页 1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%RNA构成），发觉RNaseP中RNA可催化E.coli tRNA前体加工。Sidney Altman Yale University New Haven,CT,USA 第13页第13页第14页第14页 Cech和Altman各自独立地发觉了RNA催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。1Cell vol 31,147157，1982年。2Sci.Amer.Vol 255,6475，1986。第15页第15页3抗体酶（abzyme）抗体：与抗原特异结合免疫球蛋白。抗体酶：指含有催化功效抗体分子，在抗体分子可变区 （即肽链N端）是辨认抗原活性区域，这部分区 域被赋予了酶属性。1986年美国Schultz和Lerner两个试验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了含有催化活性抗体。抗体酶性质 抗体酶用途 第16页第16页4有些DNA也有催化活性 1995年Cuenoud等发觉有些DNA分子亦含有催化活性。第17页第17页（四）酶构成 1单纯蛋白质酶类 2缀合蛋白质酶类 全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子）辅酶（coenzyme）辅基（prosthetic group）第18页第18页（五）依据酶蛋白分子特点将酶分成三类 1单体酶（monomeric enzyme）2寡聚酶（oligomeric enzyme）3多酶复合物（multienzyme complex）第19页第19页二、酶命名和分类 1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提出酶命名和分类办法。第20页第20页（一）命名 1系统名称（systematic name）（1）标明底物，催化反应性质 G-6-PF-6-P G-6-P异构酶 例:第21页第21页（2）两个底物参与反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。例1：丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶 例2：脂肪+H2O 脂酸+甘油 脂肪水解酶 第22页第22页2习惯名称（recommended name）（1）底物（2）反应性质（3）底物，反应性质（4）起源或其它特点 第23页第23页（二）系统分类法及编号 1分类:6大类酶，氧转水 裂异连2编号:用4个阿拉伯数字编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1 Enzyme Handbook，Thomas E Barman编，Vol I,Vol II 1969年。Enzyme Handbook，Thomas E.Barman编 Supplement I,1974年。第24页第24页（三）六大类酶催化反应性质 1氧化还原酶类（oxido-reductases）催化氧化还原反应酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。第25页第25页（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2。2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 第26页第26页邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）邻苯二酚邻苯醌例：第27页第27页（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢 A2H+B A+B2H 例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）乳酸丙酮酸第28页第28页2转移酶类（transferases）催化基团转移 例：谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：酮戊二酸氨基转移酶）第29页第29页3水解酶类（hydrolases）AB+H2O AOH+BH 第30页第30页4裂合酶类（lyases）从底物移去一个基团而形成双键或逆反应 AB A+B 例1：第31页第31页例例2：第32页第32页5异构酶类（isomerase）催化异构化反应 例：第33页第33页6连接酶类（ligases,也称synthetases合成酶类）将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。例：第34页第34页（连接酶）（异构）（裂合）（水解）第35页第35页三、酶分离、提纯及活力测定（一）酶分离提纯 1选材 2破碎细胞 3抽提 4去核酸、去多糖 5提纯 6保留 第36页第36页由于酶特殊性，在提纯过程中要注意:1所有操作在低温04。2在分离提纯过程中，不能猛烈搅拌。3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少许EDTA、少许-巯基乙醇。4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓 度，从而求得比活力，还要计算总活力。第37页第37页环节酶活力蛋白质浓度比活力总活力(NH4)2SO4 沉淀乙醇沉淀总活力单位体积酶活力(U/ml)分离溶液总体积(ml)比活力酶活力蛋白质浓度第38页第38页第39页第39页（二）酶活力测定 酶活力（enzyme activity,也称酶活性）酶活力测定 第40页第40页1测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed）（2）酶反应速度普通用单位时间 内产物增长量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子 强度和底物浓度等原因保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使SE。产 物 浓 度 P(t)第41页第41页2酶活力和比活力表示方式（1）酶活力（enzyme activity）酶活力定义 酶活力大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit,U）酶单位定义 1961年国际酶单位（IU）1972年Katal（简称Kat）单位 第42页第42页习惯上沿用单位如:乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶活力可用丙酮酸增长量表示，也可用340nm光吸取增长量来表示。第43页第43页（2）酶比活力（specific activity，也称比活性）比活力：指每mg蛋白质所含有酶活力，普通用 U/mg蛋白质来表示，比活力阐明酶纯度。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。第44页第44页（4）分子活性（molecular activity）（5）催化中心活性（catalytic center activity）在最适底物浓度时，每分钟或每秒钟每分子酶 转换底物分子数。（3）转换数（TN or kcat)在最适底物浓度时，每分钟每分子酶转换底物分子数。每分钟每一个催化中心所转换底物分子数。第45页第45页3.酶活力测定办法（1）分光光度法（spectrophotometry）该法要求酶底物和产物在紫外或可见光部分光吸取不同。简便、快速、准确。一个样品可多次测定，有助于动力学研究。可检测到10-9mol/L水平改变。长处：例:人血清乳酸脱氢酶活力测定 L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶第46页第46页（2）荧光法（fluorometry）该法要求酶反应底物或产物有荧光改变。主要长处：灵敏度很高，能够检测10-12mol/L样品。酶蛋白分子中Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。例：乙醇+NAD+乙醛+NADH+H+乙醇脱氢酶第47页第47页（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay)第一个酶产物为第二个酶底物，这两个酶系统在一起反应。P1无光吸取或荧光改变，偶联后,P2有光吸取或荧光改变。第48页第48页例：测己糖激酶活性 葡萄糖+ATP 葡糖-6-磷酸+ADP 己糖激酶葡糖-6-磷酸+NADP 葡糖酸-6-磷酸+NADPH+H+G-6-P脱氢酶第49页第49页（4）电化学法（electrochemical method）有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度改变或气体改变（如O2、CO2、NH3等）。例:葡萄糖氧化酶活性测定 葡萄糖+O2+H2O 葡糖酸+H2O2 葡萄糖氧化酶第50页第50页四、酶作用动力学（kinetics）什么是动力学？什么是酶作用动力学？第51页第51页（一）底物浓度对酶反应速度影响 1米氏方程提出 第52页第52页第一步:E+S ES 中间复合物学说：第二步:ESE+P VES 19Michaelis和Menten推导了米氏方程 第53页第53页2米氏方程推导 基本前提：反应方程式:在米氏方程推导中引入3个假设:（1）P0 忽略 这步反应（2）SES ESS（3）E+SES平衡，要求k3k3，Km=Ks。在Km=Ks 时，Km可表示酶 和底物亲和力。第62页第62页5米氏常数求法（1）v对S作图 第63页第63页（2）双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）将米氏方程改写成 第64页第64页（3）v对 作图（Eadie-Hofstee法）第65页第65页（4）S/v 对S作图（Hanes-Woolf法）第66页第66页（5）直接线性作图法 （Eisenthal和Cornish-Bowden法）Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图第67页第67页（二）双底物双产物反应 A+BP+Q 双底物双产物反应按动力学机制可分为两大类:双底物 双产物反应 序列反应（sequential reactions）乒乓反应（ping pong reactions）有序反应（orderd reactions）随机反应（random reactions）第68页第68页1序列有序反应（ordered reactions 写作 ordered Bi Bi）第69页第69页2序列随机反应（random reactions，写作Random Bi Bi）第70页第70页3乒乓反应（ping pong reactions，写作uni uni uni uni ping pong or Ping Pong Bi Bi）第71页第71页（三）酶浓度对酶反应速度影响 1反应速度与酶浓度成正比 SEVE 第72页第72页2V与E 关系几点讨论 第73页第73页（四）pH对酶反应速度影响 1酶反应最适pH（optimum pH）第74页第74页第75页第75页 酶最适pH不是一个固定常数，它受到底物种类、浓度;缓冲液种类、浓度;酶纯度;反应温度、时间等影响。例:碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0 第76页第76页2pH影响反应速度原因 (1)pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物 解离状态。(2)过高、过低pH造成酶蛋白变性。第77页第77页（五）温度对酶反应速度影响 1最适温度（optimum temperature）第78页第78页 最适温度与最适pH同样，也不是一个固定常数，它随底物种类、浓度,溶液离子强度,pH,反应时间等影响。例:反应时间短，最适温度高。反应时间长，最适温度低。2低温酶学 第79页第79页（六）激活剂对酶反应速度影响 什么是激活剂（activator）?酶激活剂1.无机离子（1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。专一性 有金属离子能够互相替换 有离子间有拮抗作用（2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等（3）氢离子 第80页第80页2.有机分子3.含有蛋白质性质大分子，如酶原可被一些 蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。（2）EDTA（1）一些还原剂如Cys、GSH等第81页第81页（七）酶克制作用和克制作用动力学 什么是克制作用（inhibition）?研究克制作用意义 1、不可逆克制作用（irreversible inhibition）E+IEI例:DFP（DIFP）对胰凝乳蛋白酶克制 第82页第82页2、可逆克制作用(reversible inhibition)及其动力学（1）竞争性克制作用（competitive inhibition）E+I EI 第83页第83页例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶克制作用 第84页第84页 竞争性克制作用动力学方程推导 竞争性克制作用可用下式表示:EI+S no reaction 推导要点 推导出方程 第85页第85页 竞争性克制作用动力学方程讨论 A、与原则米氏方程比较 B、当 I 0时，方程还原成米氏方程。I 时，第86页第86页C、取方程倒数，进行双倒数作图 D、克制程度:第87页第87页当S 很大很大 0 第88页第88页（2）非竞争性克制作用（noncompetitive inhibition）E+S ES ESI E+I EI ESI 第89页第89页 非竞争性克制作用动力学公式推导 非竞争性克制作用可用下式表示:经推导后得方程:第90页第90页 非竞争性克制作用动力学方程讨论 A、与米氏方程比较 B、当I0 I 第91页第91页C、取方程倒数，进行双倒数作图 D、克制程度:第92页第92页（3）反竞争性克制作用（uncompetitive inhibition）动力学方程:第93页第93页动力学方程讨论 A、与米氏方程比较 B、双倒数作图 第94页第94页三种可逆克制作用总结 第95页第95页3、一些主要克制剂及其实际意义（1）不可逆克制剂：E+IEI 或 有机磷化合物 化学结构通式:R1、R2:烷基;X:-F,-CN等第96页第96页 这些有机磷化合物能克制一些蛋白酶及酯酶活力，尤其是强烈克制胆碱酯酶。胆碱 乙酸乙酰胆碱乙酰胆碱酶胆碱酯酶 有机磷化合物中惯用是DFP以及有机磷杀虫剂，如1605、敌百虫、敌敌畏、乐果等。第97页第97页 巯基酶克制剂 什么是巯基酶？A、烷化剂：例 ICH2COOH，ICH2CONH2等 B、有机汞、有机砷化合物 C、巯基氧化剂 2E-SH+GSSGE-S-S-E+2GSH E-S H +I CH2COOHE-S-CH2COOH +HI第98页第98页 金属酶克制剂 什么是金属酶？金属酶克制剂如氰化物、硫化物和一氧化碳等。重金属克制剂 如含Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等金属盐能使大多数酶失活。第99页第99页（2）可逆克制剂 最常见是竞争性克制剂 例1：磺胺药中对一氨基苯磺酰胺 第100页第100页对氨基苯磺酰胺与对氨基苯磺酰胺与PABA两者竞争两者竞争FH2合成酶合成酶 例例2：抗癌药物抗癌药物5一氟尿嘧啶一氟尿嘧啶（PABA）人：人：叶酸叶酸（食物）（食物）FH2FH4叶酸还原酶叶酸还原酶细菌：细菌：PABAFH2合成酶合成酶FH2FH4第101页第101页五、酶专一性及活性中心（一）酶专一性（特异性，specificity）1、绝对专一性（absolute specificity）例:第102页第102页（1）族专一性（基团专一性，group specificity）2、相对专一性（relative specificity）A B 或 A B如-D-葡萄糖苷酶 第103页第103页（2）键专一性 A B第104页第104页3、立体专一性（stereospecificity）（1）D-，L-立体异构专一性（2）几何异构专一性 第105页第105页（3）酶能区别从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等 同基团，只催化其中一个基团，而不催化另一个。例1：若甘油激酶不能区别两个CH2OH基团，则会生成:和第106页第106页例2：第107页第107页（二）关于酶作用专一性几种假说 1、锁钥学说（lock and Key theory）1894年 Fischer 提出第108页第108页2、三点附着学说 第109页第109页3、诱导契合学说（induced-fit theory）1958年 Koshland提出第110页第110页第111页第111页（三）酶活性中心（active center）1、活性中心概念 酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接相关，这个部位称酶活性中心。第112页第112页 构成酶活性中心氨基酸侧链基团主要有Glu和ASP-COOH，Lys-NH2，His咪唑基，Ser-OH，Cys-SH，Tyr侧链基团。第113页第113页酶活性中心 结合部位（结合位）催化部位（催化位）第114页第114页2、活性中心与必需基团 第115页第115页（四）判断和拟定活性中心主要办法 1、化学修饰法（共价标识法）（1）DFP或DIFP（二异丙基氟磷酸）第116页第116页（2）TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙酰氯甲基酮）TPCK修饰His，使His烷基化 第117页第117页（3）碘乙酸、对氯汞苯甲酸修饰巯基 2、X-光衍射分析 3、基因定位突变法 第118页第118页六、酶作用机理（一）与酶高效率相关原因 1、邻近效应与定向效应 （proximity and orientation effect）第119页第119页第120页第120页邻近效应：指两个反应分子，它们反应基团需要互相靠近，才干反应。定向效应:指酶催化基团与底物反应基团之间正确向。第121页第121页第122页第122页2、张力效应和底物形变（strain and distortion）第123页第123页3、酸碱催化（acid-base catalysis）第124页第124页酚吡啶羟基吡啶第125页第125页第126页第126页4、共价催化（covalent catalysis）什么是共价催化？共价催化 亲电子催化 亲核催化第127页第127页第128页第128页5、酶活性中心疏水环境效应、酶活性中心疏水环境效应 第129页第129页（二）一些酶活性中心及其作用机理 1、溶菌酶（Lysozyme）第130页第130页第131页第131页第132页第132页第133页第133页第134页第134页2、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）第135页第135页第136页第136页形成酰化中间物 第137页第137页第138页第138页第139页第139页第140页第140页3、羧肽酶A（carboxypeptidase A，CpA）第141页第141页第142页第142页第143页第143页第144页第144页Glu 270Arg 145Tyr 248酶单独存在时:第145页第145页Arg 145Tyr 248Glu 270酶底物复合物:第146页第146页七、别构酶（也称变构酶，allosteric enzyme）（一）别构酶结构上特点（二）别构酶性质上特点（三）别构酶别构效应（allosteric effect）1、什么是别构效应 2、同促效应与异促效应 第147页第147页（四）别构酶作用动力学 1、正协同效应（positive cooperative effect）2、负协同效应（negative cooperative effect）第148页第148页3、正协同效应别构酶与米氏酶动力学比较 第149页第149页4、负协同效应别构酶与米氏酶动力学比较 第150页第150页怎么区别米氏酶与别构酶？Koshland提议用饱和比值（saturation ratio,Rs）典型米氏酶 RS=81 含有正协同效应别构酶 RS81 第151页第151页当前常使用Hill系数区别米氏酶与别构酶 Hill方程:将Hill方程中相关参数换成别构酶中相关参数 n为Hill系数，米氏酶Hill系数 n=1正协同效应别构酶 n1负协同效应别构酶 n1第152页第152页（五）别构酶举例 1、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶（E.coli aspartate transcarbamylase,ATCase）第153页第153页（1）ATCase催化化学反应和ATCase动力学曲线 第154页第154页第155页第155页（2）ATCase活性调整机理 有催化活性构象 无催化活性构象 第156页第156页2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（1）甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化反应 第157页第157页（2）甘油醛-3-磷酸脱氢酶调整机理 第158页第158页（六）别构酶调整酶活性机理 1、对称或协同模型（symmetry or concerted model,也称齐变模型、MWC模型）1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。该模型要点:第159页第159页2、序变模型（sequential model，也称KNF模型）1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。该模型要点:第160页第160页八、共价调整酶（covalently modulated enzymes）什么是共价调整酶？常见是磷酸化/脱磷酸化，腺苷酰化/脱腺苷酰化，乙酰化/脱乙酰化，尿苷酰化/脱尿苷酰化，甲基化/脱甲基化，S-S/SH互相转变，共6种类型。第161页第161页共价调整酶最典型例子是动物组织糖原磷酸化酶 1.糖原磷酸化酶催化反应 催化糖原磷酸解，生成G-1-P。糖原 G-1-P+糖原+H3PO4糖原磷酸化酶（n-1个Glc基）（n个Glc基）第162页第162页2、结构特性 3、调整机理 第163页第163页九、同工酶（isoenzyme or isozyme）（一）同工酶概念 同工酶概念 同工酶性质 第164页第164页（二）乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）1、构成和电泳行为 HHHH(LDH1)HHHM(LDH2)HHMM(LDH3)HMMM(LDH4)MMMM(LDH5)第165页第165页2、功效 催化反应 乳酸 丙酮酸 LDH5骨骼肌:乳酸 丙酮酸 心肌:LDH1第166页第166页3、同工酶研究意义 第167页第167页十、酶原激活 第168页第168页1、胃蛋白酶原（pepsinogen）激活 第169页第169页2、胰蛋白酶原（trypsinogen）激活 第170页第170页第171页第171页3、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）激活 第172页第172页十一、固定化酶（immobilized enzyme）固定化酶是将水溶性酶连接到固相载体上，使它以固相状态作用于底物，因此也称固相酶。固定化酶长处 固定化酶理化性质第173页第173页固定化酶制备 吸附法 第174页第174页 偶联法 第175页第175页 交联法 第176页第176页 包埋法 固定化酶应用第177页第177页