酶的生物改造公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

酶生物改造酶生物改造 酶定向进化研究进展酶定向进化研究进展第1页第1页介介 绍绍 提提 纲纲1.定向进化技术概述定向进化技术概述2.定向进化技术应用定向进化技术应用3.定向进化办法定向进化办法第2页第2页 1 1、酶分子改造办法酶分子改造办法l基于序列理性设计：基于序列理性设计：化学修饰和定点突变化学修饰和定点突变 利用已知酶分子特性、空间结构、结构和功效之间利用已知酶分子特性、空间结构、结构和功效之间关系，以及氨基酸残基功效等信息，对酶分子进行改关系，以及氨基酸残基功效等信息，对酶分子进行改造；造；l利用基因操作模拟自然进化非理性设计：利用基因操作模拟自然进化非理性设计：定向进化定向进化 不需要准确酶分子结构信息而通过随机突变、基因不需要准确酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组等办法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并重组等办法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并定向筛选出所需突变酶；定向筛选出所需突变酶；一、定向进化概述一、定向进化概述第3页第3页实例：木糖异构酶定点突变改造实例：木糖异构酶定点突变改造第4页第4页实例：木糖异构酶定点突变改造实例：木糖异构酶定点突变改造突变前蛋白与木糖复合物模型突变前蛋白与木糖复合物模型 突变后蛋白与木糖复合物模型突变后蛋白与木糖复合物模型 氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积更大葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提升更大葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提升第5页第5页 2 2、生物自然进化不足、生物自然进化不足l自然进化过程：自然进化过程：突变突变自然选择自然选择遗传后代遗传后代l自然进化结果：自然进化结果：生物多样性生物多样性 基因多样性：为完毕同一功效所表现出基因多样性：为完毕同一功效所表现出 多个基因或同一个基因（同源性）多个基因或同一个基因（同源性）l不足：不足：周期长，效率低周期长，效率低 ；可控性差；可控性差；第6页第6页 基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成为也许，在几天和数月内即可完毕；还能够成为也许，在几天和数月内即可完毕；还能够让人类按照自己意愿和需要改造菌种，甚至能让人类按照自己意愿和需要改造菌种，甚至能够产生自然界中原本不存在全新酶，以适应大够产生自然界中原本不存在全新酶，以适应大工业生产需要。工业生产需要。-哲理上哲理上,认可了人类对蛋白质认知严重不足认可了人类对蛋白质认知严重不足;-技术上技术上,将大自然已经实践了几亿年达尔文进化原将大自然已经实践了几亿年达尔文进化原理应用于试管中理应用于试管中,以以随机突变与随机杂交随机突变与随机杂交办法来改变办法来改变蛋白质性能蛋白质性能,再辅以筛选来取得优秀变种。再辅以筛选来取得优秀变种。(Frances Arnold,Caltech,1993)(Frances Arnold,Caltech,1993)第7页第7页3 3、酶定向进化技术、酶定向进化技术l定义：定义：从一个或多个已经存在亲本酶（天然或人为从一个或多个已经存在亲本酶（天然或人为取得）出发，通过基因突变和重组，构建一个取得）出发，通过基因突变和重组，构建一个人工突变基因库，通过筛选最后取得预先盼望人工突变基因库，通过筛选最后取得预先盼望含有一些特性进化酶；含有一些特性进化酶；所谓酶体外定向进化，又称试验分子进化，属于所谓酶体外定向进化，又称试验分子进化，属于蛋白质非合理设计，它不需事先理解酶空间结构和催蛋白质非合理设计，它不需事先理解酶空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊条件，模拟自然进化机化机制，通过人为地创造特殊条件，模拟自然进化机制制(随机突变、重组和自然选择随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质突变酶。并定向选择出所需性质突变酶。第8页第8页4 4、定向进化原理、定向进化原理l在待进化酶基因在待进化酶基因PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶不含有不含有3-53-5校对功效性质，配适当当条件，以很校对功效性质，配适当当条件，以很低比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭低比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向选择办法，选出所需性质优化酶借定向选择办法，选出所需性质优化酶(或蛋白质或蛋白质)，从而排除其它突变体。从而排除其它突变体。l定向进化基本规则是定向进化基本规则是“获取你所筛选突变体获取你所筛选突变体获取你所筛选突变体获取你所筛选突变体”。l l定向进化定向进化定向进化定向进化=随机突变随机突变随机突变随机突变+选择选择选择选择。前者是人为引起，后者虽。前者是人为引起，后者虽相称于环境，但只作用于突变后分子群，起着选择某相称于环境，但只作用于突变后分子群，起着选择某一方向进化而排除其它方向突变作用，整个进化过程一方向进化而排除其它方向突变作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行完全是在人为控制下进行第9页第9页蛋白质蛋白质稳定性活性有机溶液中活性不同底物利用酸碱度蛋白质表示亲和性 专一性1234性能代数达到目随机突变随机突变随机杂交随机杂交筛选筛选目的蛋白酶定向进化过程和应用范围酶定向进化过程和应用范围第10页第10页二、酶定向进化应用二、酶定向进化应用第11页第11页酶定向进化典型例子酶定向进化典型例子枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E热稳定性分子进化热稳定性分子进化第12页第12页l内酰胺酶活性提升了内酰胺酶活性提升了32,00032,000倍；倍；l半乳糖苷酶底物特异性提升了半乳糖苷酶底物特异性提升了10001000倍，且倍，且活性提升活性提升6666倍；倍；l天冬氨酸转氨酶对天冬氨酸转氨酶对支链氧代氨基酸活性提支链氧代氨基酸活性提升升10105 5倍且对缬氨酸催化效率提升倍且对缬氨酸催化效率提升2.1102.1106 6倍等。倍等。定向进化成功例子定向进化成功例子第13页第13页成功例子成功例子lReetzReetz等等 (1997)(1997)将脂酶水解对硝基将脂酶水解对硝基-2-2-甲基癸酯甲基癸酯对映体选择性提升了对映体选择性提升了4040倍倍lYouYou和和Arnold(1996)Arnold(1996)提升了枯草杆菌蛋白酶提升了枯草杆菌蛋白酶E E表表示水平和在有机溶剂中活性，使酶总活力提升了示水平和在有机溶剂中活性，使酶总活力提升了500500倍倍lZhaoZhao和和ArnoldArnold（19981998）在保持酶活力不变条件下）在保持酶活力不变条件下将枯草杆菌蛋白酶将枯草杆菌蛋白酶E E作用温度提升了作用温度提升了1717度度第14页第14页三、酶定向进化基本过程三、酶定向进化基本过程l随机突变l 不同定向进化方法l构建突变基因文库l 载体选择，基因重组，组建基因文库l突变基因筛选 l 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法 l 第15页第15页1、定向进化办法、定向进化办法l无性进化办法：易错无性进化办法：易错PCRPCR法，盒式诱变法，盒式诱变l有性进化办法有性进化办法 1 1）DNADNA改组法（改组法（DNA Shuffling)DNA Shuffling)2 2）体外随机重组法（）体外随机重组法（RPR)RPR)3 3）交错延伸法）交错延伸法(StEP)(StEP)l基因家族同源重组基因家族同源重组l外显子改组外显子改组l杂合进化杂合进化第16页第16页无性进化：易错无性进化：易错PCRPCR办法办法 第17页第17页无性进化：易错无性进化：易错PCRPCR办法办法 l l办法：向办法：向办法：向办法：向单一酶分子基因内单一酶分子基因内单一酶分子基因内单一酶分子基因内随机引入突变随机引入突变随机引入突变随机引入突变(在在在在PCRPCR扩增扩增扩增扩增过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；l l特点：特点：特点：特点：遗传改变仅发生在单一分子内部遗传改变仅发生在单一分子内部遗传改变仅发生在单一分子内部遗传改变仅发生在单一分子内部，属于无性进化属于无性进化属于无性进化属于无性进化v 改变改变4种底物浓度比，或减少一个种底物浓度比，或减少一个dNTP量（降至量（降至5-10）,加入加入dITP来代替被减少来代替被减少dNTP.缓冲液中另加缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+v 提升镁离子浓度（常规提升镁离子浓度（常规提升镁离子浓度（常规提升镁离子浓度（常规PCRPCR时浓度为时浓度为时浓度为时浓度为0.5-2.5mmol/L0.5-2.5mmol/L）；）；）；）；v 添加一定浓度锰离子；添加一定浓度锰离子；第18页第18页易错易错PCRPCR办法实例办法实例 l l1993199319931993年，年，年，年，Chen and ArnoldChen and ArnoldChen and ArnoldChen and Arnold在非水相在非水相在非水相在非水相DMFDMFDMFDMF中，定中，定中，定中，定向进化枯草杆菌蛋白酶向进化枯草杆菌蛋白酶向进化枯草杆菌蛋白酶向进化枯草杆菌蛋白酶E E E E活力取得成功，在活力取得成功，在活力取得成功，在活力取得成功，在60606060和和和和85858585DMFDMFDMFDMF中，活力分别提升中，活力分别提升中，活力分别提升中，活力分别提升256256256256和和和和131131131131倍；倍；倍；倍；l l长处长处长处长处：操作简便，随机突变丰富操作简便，随机突变丰富操作简便，随机突变丰富操作简便，随机突变丰富；l l缺点缺点缺点缺点：正突变概率低，突变基因文库较大，文：正突变概率低，突变基因文库较大，文：正突变概率低，突变基因文库较大，文：正突变概率低，突变基因文库较大，文库筛选工作量大；库筛选工作量大；库筛选工作量大；库筛选工作量大；l l合用范围合用范围合用范围合用范围：适合用于较小基因定向进化：适合用于较小基因定向进化：适合用于较小基因定向进化：适合用于较小基因定向进化第19页第19页有性进化：有性进化：DNADNA改组办法（改组办法（19941994，Stemmer)第20页第20页有性进化：有性进化：DNADNA改组办法改组办法方法：从正突变基因库中分离得到DNA序列用酶随机切割，得到随机片断经不加引物多次PCR循环，取得全长基因，实现优势突变组合；特点：遗传改变仅发生在来自不同基因片断之间 重组，因此称为有性进化；实例：对内酰胺酶进行DNA改组，3次循环得到进 化酶反抗生物素头孢噻呜抗性增加3倍；优点：将已经有正突变基因结合，正突变效率高；缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除洁净，以 防突变基因被切割；第21页第21页有性进化：体外随机重组法（有性进化：体外随机重组法（19981998，Arnold)能以单链能以单链能以单链能以单链DNADNADNADNA为模板，以随机序列引物进行为模板，以随机序列引物进行为模板，以随机序列引物进行为模板，以随机序列引物进行PCRPCRPCRPCR反应，反应，反应，反应，再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增第22页第22页有性进化有性进化:交错延伸法交错延伸法（19971997，Arnold)Arnold)将常规退火和延伸合并成一步，缩短反应时间将常规退火和延伸合并成一步，缩短反应时间将常规退火和延伸合并成一步，缩短反应时间将常规退火和延伸合并成一步，缩短反应时间第23页第23页基因家族同源重组基因家族同源重组l l办法办法办法办法：单一酶分子基因进化过程中集中有利突：单一酶分子基因进化过程中集中有利突：单一酶分子基因进化过程中集中有利突：单一酶分子基因进化过程中集中有利突变速度较慢，从自然存在基因家族出发，由于变速度较慢，从自然存在基因家族出发，由于变速度较慢，从自然存在基因家族出发，由于变速度较慢，从自然存在基因家族出发，由于基因之间存在明显差别，所得突变库表达了基基因之间存在明显差别，所得突变库表达了基基因之间存在明显差别，所得突变库表达了基基因之间存在明显差别，所得突变库表达了基因多样性和增长了有利突变概率；因多样性和增长了有利突变概率；因多样性和增长了有利突变概率；因多样性和增长了有利突变概率；l l实例实例实例实例：StemmerStemmerStemmerStemmer等从等从等从等从4 4 4 4种微生物中选择编码头孢种微生物中选择编码头孢种微生物中选择编码头孢种微生物中选择编码头孢菌素菌素菌素菌素4 4 4 4个同源基因，分别进行单独进化和同源个同源基因，分别进行单独进化和同源个同源基因，分别进行单独进化和同源个同源基因，分别进行单独进化和同源重组，结果单独进化抗性提升重组，结果单独进化抗性提升重组，结果单独进化抗性提升重组，结果单独进化抗性提升8 8 8 8倍、而同源重倍、而同源重倍、而同源重倍、而同源重组比其中组比其中组比其中组比其中2 2 2 2种微生物分别提升种微生物分别提升种微生物分别提升种微生物分别提升270270270270和和和和540540540540倍；倍；倍；倍；国内海藻糖酶法制备即采用该办法；国内海藻糖酶法制备即采用该办法；国内海藻糖酶法制备即采用该办法；国内海藻糖酶法制备即采用该办法；l l特点特点特点特点：由于定向进化高效性，被认为是：由于定向进化高效性，被认为是：由于定向进化高效性，被认为是：由于定向进化高效性，被认为是DNADNADNADNA改改改改组发展方向；组发展方向；组发展方向；组发展方向；第24页第24页The Molecular Breeding directed The Molecular Breeding directed molecular evolution processmolecular evolution process第25页第25页v 对一组同源蛋白质氨基酸序列进行比较，以一 定原则程序计算出各氨基酸序列共有序列；v 人工合成同序基因后重组表示。Martin Lehmann等（）把这种办法应用在真菌植酸酶家族设计合成了同源植酸酶基因，并表示出具热稳定性同源植酸酶。第26页第26页外显子改组外显子改组真核基因中外显子编码一个折叠结构域，故内含子（转录后被剪切剩下外显子）间重组，可使独立外显子组装成编码新蛋白质基因，可造成蛋白质快速进化；在自然界中，不同分子内含子间发生同源重组，造成不同外显子结合，是产生新蛋白质有效路径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一个分子间内含子同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上；第27页第27页杂合进化杂合进化把来自不同酶分子中结构单元或是整个酶分子进行组合或互换，以产生含有所需性质酶杂合体。纤维素酶定向进化第28页第28页2.2.基因文库构建基因文库构建定义定义定义定义：通过：通过：通过：通过DNADNADNADNA重组技术将随机突变取得各种突变基因重组技术将随机突变取得各种突变基因重组技术将随机突变取得各种突变基因重组技术将随机突变取得各种突变基因与适宜载体进行重组，取得重组载体；再通过细胞与适宜载体进行重组，取得重组载体；再通过细胞与适宜载体进行重组，取得重组载体；再通过细胞与适宜载体进行重组，取得重组载体；再通过细胞转化等办法将重组载体转入适当细胞或进行体外包转化等办法将重组载体转入适当细胞或进行体外包转化等办法将重组载体转入适当细胞或进行体外包转化等办法将重组载体转入适当细胞或进行体外包装成为有感染活性重组装成为有感染活性重组装成为有感染活性重组装成为有感染活性重组噬菌体，形成突变基因文库。噬菌体，形成突变基因文库。噬菌体，形成突变基因文库。噬菌体，形成突变基因文库。uu载体选择载体选择载体选择载体选择：质粒载体：质粒载体：质粒载体：质粒载体 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNADNADNA载体载体载体载体:噬菌体、噬菌体、噬菌体、噬菌体、M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 黏粒载体：黏粒载体：黏粒载体：黏粒载体：人工构建载体人工构建载体人工构建载体人工构建载体 噬菌粒载体噬菌粒载体噬菌粒载体噬菌粒载体第29页第29页uu基因重组基因重组基因重组基因重组：体外通过体外通过体外通过体外通过DNADNADNADNA连接酶作用，将基因与载体连接酶作用，将基因与载体连接酶作用，将基因与载体连接酶作用，将基因与载体DNADNADNADNA连接连接连接连接在一起形成重组在一起形成重组在一起形成重组在一起形成重组DNADNADNADNA过程。过程。过程。过程。重组办法重组办法重组办法重组办法：黏性末端连接：黏性末端连接：黏性末端连接：黏性末端连接 平头末端连接平头末端连接平头末端连接平头末端连接 修饰末端连接修饰末端连接修饰末端连接修饰末端连接uu组装突变基因文库组装突变基因文库组装突变基因文库组装突变基因文库 将重组将重组将重组将重组DNADNADNADNA转入受体细胞或包装成为有感染活性重转入受体细胞或包装成为有感染活性重转入受体细胞或包装成为有感染活性重转入受体细胞或包装成为有感染活性重组噬菌体过程。组噬菌体过程。组噬菌体过程。组噬菌体过程。组装办法：组装办法：组装办法：组装办法：重组质粒载体重组质粒载体重组质粒载体重组质粒载体-转化（原核和真核）转化（原核和真核）转化（原核和真核）转化（原核和真核）重组噬菌体载体重组噬菌体载体重组噬菌体载体重组噬菌体载体-包装包装包装包装 第30页第30页3、基因突变库筛选办法、基因突变库筛选办法u目的目的 依据定向进化要求，在一定环境要求下进行筛选，从突依据定向进化要求，在一定环境要求下进行筛选，从突变基因文库中得到所需突变基因。变基因文库中得到所需突变基因。u难点难点 突变库容量大，普通达到突变库容量大，普通达到10106 6，工作量巨大，工作量巨大u关键关键 高通量筛选：通量大，效率高高通量筛选：通量大，效率高u办法办法 平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法面展示法第31页第31页平板筛选办法平板筛选办法u依据细胞生长情况筛选依据细胞生长情况筛选热稳定性：温度梯度和高温环境热稳定性：温度梯度和高温环境抗生素耐受性：抗生素浓度梯度抗生素耐受性：抗生素浓度梯度pHpH稳定性：稳定性：pHpH梯度梯度极端环境：高盐、低温、高浓毒物质极端环境：高盐、低温、高浓毒物质第32页第32页平板筛选办法平板筛选办法u依据颜色改变筛选依据颜色改变筛选大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷半乳糖苷酶酶基因基因显显色：噬菌体色：噬菌体DNA载载体（体（蓝蓝色）色）反反应产应产物物显显色：磷酸色：磷酸酯酯酶酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚脂肪酶筛选脂肪酶筛选海因酶筛选海因酶筛选第33页第33页平板筛选办法平板筛选办法u依据透明圈大小筛选依据透明圈大小筛选淀粉酶进化：淀粉平板培养基淀粉酶进化：淀粉平板培养基豆鼓纤溶酶进化：血纤维蛋白培养基豆鼓纤溶酶进化：血纤维蛋白培养基第34页第34页荧光筛选办法荧光筛选办法l利用本身荧光激发特性l 生成产物本身是含有荧光激发特性物质l利用荧光汇报基因l辣根过氧化合物酶和单加氧酶融合基因：l 原理：萘萘酚醌类化合物（能激发荧光）l绿色荧光蛋白基因：获诺贝尔化学奖l 第35页第35页诺贝尔化学奖简介l获奖l 诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人由于在绿色荧光蛋白（）研究和应用方面做出突出奉献将各分得13诺贝尔化学奖奖金。l 第36页第36页诺贝尔化学奖简介u评论评论 生物学有些现象只能在打坏细胞以后才干做，因此事实生物学有些现象只能在打坏细胞以后才干做，因此事实上是从上是从“死物死物”上来推测生物情况。而下村修、钱永健和上来推测生物情况。而下村修、钱永健和马丁马丁沙尔菲创造用荧光分子标识其它分子办法，使科学家沙尔菲创造用荧光分子标识其它分子办法，使科学家们能在活细胞、活生物上直接观测一些生物现象。因此，们能在活细胞、活生物上直接观测一些生物现象。因此，能够说是把一些能够说是把一些“死物学死物学”变成了真正变成了真正“生物学生物学（北大饶毅）绿荧光水母通过体内绿色荧光蛋白发光科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质第37页第37页绿色荧光蛋白应用绿色荧光蛋白应用分子标识：分子标识：GFP标识微管结构标识微管结构第38页第38页绿色荧光蛋白应用绿色荧光蛋白应用 分子标识：分子标识：FISH分析菌株（a）未加探针；（）未加探针；（b）DAPI染色（染色（c）-探针杂交探针杂交（d）Msint-1268探针杂交菌株探针杂交菌株Y1；（；（e）Msint-1268探针杂交探针杂交M.trichosporium OB3b第39页第39页绿色荧光蛋白应用绿色荧光蛋白应用药物筛选药物筛选第40页第40页绿色荧光蛋白应用绿色荧光蛋白应用融合表示：融合表示：线粒体中表示GFP第41页第41页绿色荧光蛋白应用绿色荧光蛋白应用生物传感器：生物传感器：GFP在植物研究中应用第42页第42页噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法u 内涵内涵 利用丝状噬菌体外膜结构蛋白与一些特定外利用丝状噬菌体外膜结构蛋白与一些特定外源蛋白或多肽分子形成稳定复合物，使外源蛋源蛋白或多肽分子形成稳定复合物，使外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面一个分子展示技术白或多肽富集在噬菌体表面一个分子展示技术u 特点特点 有效性高，是前景辽阔筛选办法有效性高，是前景辽阔筛选办法第43页第43页噬菌体显示筛选模式噬菌体显示筛选模式第44页第44页噬菌体显示几种类型噬菌体显示几种类型第45页第45页M13噬菌体噬菌体pIII和和pVIII显示显示第46页第46页酵母细胞表面展示法酵母细胞表面展示法 通过锚定在酵母细胞表面特点蛋白质与一些通过锚定在酵母细胞表面特点蛋白质与一些外源蛋白质或多肽形成稳定化合物，使外源蛋外源蛋白质或多肽形成稳定化合物，使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面一个分子展示技白或多肽富集在酵母细胞表面一个分子展示技术。术。第47页第47页核糖体显示技术核糖体显示技术第48页第48页RNA-RNA-蛋白质融合技术蛋白质融合技术第49页第49页RNA-RNA-蛋白质融合蛋白质融合第50页第50页寡霉素与核苷酸连接寡霉素与核苷酸连接第51页第51页Myc ds-DNA富集富集第52页第52页实例：天冬氨酸转氨酶热稳定性实例：天冬氨酸转氨酶热稳定性定向进化定向进化第53页第53页n高通量筛选办法建立高通量筛选办法建立n生物信息学技术手段建立生物信息学技术手段建立n天冬氨酸转氨酶热稳定性改造天冬氨酸转氨酶热稳定性改造研究内容及执行情况研究内容及执行情况第54页第54页 高通量筛选办法建立高通量筛选办法建立 基基于于酶酶联联免免疫疫分分析析办办法法，选选取取医医用用检检测测试试剂剂盒盒作作为为检检测测试试剂剂，建建立立了了快快速速高高效效酶酶活活性性检检测测办办法法，结结合合使使用用9696孔酶标板，形成了酶高通量筛选办法孔酶标板，形成了酶高通量筛选办法。建立了改进可高通量操作质粒快速检测办法，改进建立了改进可高通量操作质粒快速检测办法，改进后质粒快检工作量为原办法后质粒快检工作量为原办法1/31/3左右，可用于高通量左右，可用于高通量筛选和鉴定所构建基因工程菌。筛选和鉴定所构建基因工程菌。第55页第55页生物催化数据整合和信息分析生物催化数据整合和信息分析峰值运算速度达峰值运算速度达30003000亿次亿次/秒集群系统秒集群系统 基因表示 蛋白质表示 蛋白质-DNA互相作用 蛋白质-蛋白质互相作用 基因和其它功效互相作用 蛋白质定位 网络调整 功效注解 生物信息学技术手段建立生物信息学技术手段建立第56页第56页天冬氨酸转氨酶热稳定性改造天冬氨酸转氨酶热稳定性改造第57页第57页天冬氨酸转氨酶作用天冬氨酸转氨酶作用酶法制备酶法制备L L苯丙氨酸关键酶苯丙氨酸关键酶 ；u L-苯丙氨酸主要用途 氨基酸输液 L-苯丙氨酸是人体八大必须氨基酸之一，是氨基酸输液主要成份；甜味剂合成 由L-苯丙氨酸和L天冬氨酸合成阿斯巴甜是二十世纪九十年代以来最受关注非糖型肽类甜味剂，形成了对L-苯丙氨酸强烈需求；第58页第58页肉桂酸酶法肉桂酸酶法苯丙酮酸酶法苯丙酮酸酶法第59页第59页结构分析软件结构分析软件结构分析软件结构分析软件Rasmol Rasmol Rasmol Rasmol 分析酶三维结构分析酶三维结构分析酶三维结构分析酶三维结构序列分析软件序列分析软件序列分析软件序列分析软件Clustal WClustal WClustal WClustal W分析酶一维结构分析酶一维结构分析酶一维结构分析酶一维结构利用生物信息学技术进行酶结构分析利用生物信息学技术进行酶结构分析第60页第60页应用应用DeepViewDeepView（蛋白质结构预测软件）（蛋白质结构预测软件）确立天冬氨酸转氨酶热稳定性相关功效区域确立天冬氨酸转氨酶热稳定性相关功效区域第61页第61页引入随机引物，建立突变基因文库引入随机引物，建立突变基因文库第62页第62页Compound LibraryUnique Compound in Each WellAssayTargetPlate ReaderSame Assay and Target in Each WellMother PlateDaughter PlateAssay Plate采用高通量筛选技术采用高通量筛选技术对构建突变菌库进行筛选对构建突变菌库进行筛选第63页第63页筛选筛选得到酶热稳定性提升得到酶热稳定性提升1212株菌株株菌株天冬氨酸转氨酶热稳定性进化天冬氨酸转氨酶热稳定性进化未突变前酶热稳定性未突变前酶热稳定性*热稳定性定义为热稳定性定义为5555下放置下放置10min10min后酶活性与放置前酶活性比值后酶活性与放置前酶活性比值第64页第64页