桑黄养殖可行性研究报告.doc

技术研究报告 摘 要桑黄是产多糖的药用真菌。本文以来自长白山的桑黄菌作为出发菌种，采用PDA培养基进行菌种活化，先测出桑黄的生长曲线和桑黄胞内、外多糖的积累曲线，然后用单因素实验法分别对桑黄液体培养基的初始pH值、碳源以及氮源进行了研究。结果表明：优化的碳源为玉米粉，氮源为黄豆饼粉，初始pH为5.56.5。优化培养基的具体配方为：玉米粉3%、黄豆饼粉1%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、维生素B120g/100mL、维生素B230g/100mL、pH在5.56.5之间。经过验证实验，在温度为30、转速为130r/min的条件下培养桑黄，发酵7天后，优化培养基中发酵产生的桑黄菌丝体干重为7.089g/L，比PDA培养基中桑黄菌丝体产量提高了80.93%。关键词：桑黄 液体培养 菌丝体 多糖 AbstractPhellinus litenus is a medicinal fungus producing intracellular polysaccharide. In this article Phellinus litenus we used is from The Chang Bai Mountain. First， the Phellinus litenus was inoculumed on the PDA culture medium in order to active the fungus. Second， basing on the dates， the mycelia growth curve and production of intracellular and extracellular polysaccharide of Phellinus litenus was educed . Then ，by the method of the single factor experiment method to carry on a research about initial pH value、carbon source and nitrogen source .As a result ， the best carbon source of the media is corn flour， the most excellent nitrogen source is soybean powder and the fittest pH is ranged from 5.5 to 6.5.The optimized media is corn flour 3%，soybean powders1%， KH2PO4 0.3%， MgSO4 0.15%， vitamin B1 20g/100mL and vitamin B2 30g/100mL，besides， pH is 5.5 to 6.5. Under the condition of 30 ， 130 r/min ，after 7 days， 7.089g mycelia (dry wt) per L submerged culture of Phellinus linteus was obtained. That is ， the mycelium production by P.linteus has enhanced by 80.93%.Key words: Phellinus litenus liquid fermentative culture mycelia polysaccharide 67目录摘 要IABSTRACTII第1章 绪论11.1 前言11.2 简介桑黄21.2.1桑黄的名称及分类21.2.2桑黄的分布21.3 桑黄的研究进展21.3.1桑黄药用功能的研究进展21.3.2桑黄化学成分的研究进展41.3.3桑黄的人工培养5第2章 实验部分82.1桑黄菌丝液体培养工艺优化82.1.1桑黄培养条件的确定82.1.2测定方法102.1.3 试验材料10（1）菌种10（2）原料与药品10（3）实验仪器112.1.4试验过程12（1）活化菌种12（2）固体扩大培养实验13（3）液体种子摇瓶培养13（4）桑黄菌丝体生长曲线和多糖积累曲线实验13（5）液体培养基初始pH的筛选影响实验15（6）桑黄培养基碳源筛选实验15（7）桑黄培养基氮源筛选实验16（8）优化培养基验证实验162.2多糖提取工艺优化172.2.1乙醇浓度对多糖收率的影响172.2.2胞内多糖提取实验优化172.2.3超声波处理时间对多糖收率的影响18第3章 试验数据及分析193.1桑黄菌丝液体培养工艺数据及分析193.1.1桑黄生长曲线与桑黄多糖积累曲线的绘制193.1.2培养基初始pH值的筛选213.1.3培养基碳源的筛选223.1.4培养基氮源的筛选233.1.5验证培养基实验数据243.2 多糖提取工艺数据及分析243.2.1乙醇浓度对多糖得率的影响243.2.2桑黄胞内多糖提取实验253.2.3超声波处理时间对多糖收率的影响263.3桑黄菌丝生长形态27结论284.1桑黄菌丝液体培养工艺优化284.2多糖提取工艺优化28致谢30参考文献31第一篇 桑黄菌丝培养及多糖提取工艺优化第1章 绪论1.1 前言桑黄是目前国际公认的抗肿瘤效果最好的大型真菌之一，巴西蘑菇即姬松茸与其疗效相近。由于用于一般化学疗法的抗癌剂的毒性强，对癌症患者正常体细胞也具有杀伤作用，而桑黄多糖则几乎没有毒性，其通过提高机体免疫能力，杀伤癌细胞，这是真菌多糖抗癌的一大优点。桑黄多糖能明显提高患者的免疫能力，当与一般的抗癌化学疗法并行使用时，可以进一步提高治疗效果。因此桑黄的研究以及开发利用越来越热1。桑黄最早在日本及韩国得到开发利用，现已开始小批量人工栽培。由于天然的桑黄数量非常稀少，难以成为稳定的工业产品来源，韩国一制药公司已率先开发出桑黄菌丝体培养法新技术，人工生产桑黄活性物质，并将其提取物用冻干法加工成粉末。由于抗癌效果显著，桑黄提取物干粉在韩国市场的售价高达每克2000多美元。日本一家专门从事生药加工的医药企业“津村株式会社”将人工培植的桑黄子实体加工成“破壁细胞超微粉末”，生产的“桑黄”(超微)粉末胶囊每瓶(288粒)售价高达3万日元。据统计，仅日、韩两国市场2002年各种桑黄剂的销售额合计已逾100亿日元。美国在本世纪初开始从日本进口桑黄制剂作为膳食补充剂在本土销售。我国吉林省延吉市凭借独有的地域优势，现已开发出复合桑黄口服液，主要销往日本及韩国，在当地也有一定的消费市场。根据目前所掌握的资料，由于外商需求量大，价格高，致使国内各产地进行掠夺性开采，子实体孢子无法大量形成。结果造成该资源在东北地区已经难觅踪影，西北也即将枯竭。再加上我国天然的桑黄数量本来就非常稀少，子实体的人工栽培尚处于起步阶段，所以要想形成稳定的医药工业产品来源，就必须充分挖掘桑黄的自然资源，深入开展桑黄的人工栽培；另外还要进行菌种的分离培养，利用现代生物技术进行深层发酵。同时，应进一步测定桑黄提取物中的有效成分，探索其与菌种、菌龄以及培养条件的关系，确定桑黄有效成分在提高人体免疫机能、疾病的预防和治疗等方面的作用机制，使桑黄能够早日应用于人类的医疗保健事业2。1.2 简介桑黄1.2.1桑黄的名称及分类桑黄（Phellinus igniarius、Phellinus linteus和Phellinus baumi）别名：火木层孔菌、针裂蹄（裂蹄）和鲍氏层孔菌。桑黄菌是一种多年生珍稀药用真菌，属担子菌纲(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)，木层孔菌属(Phellinus)3。桑黄子实体中等至较大，无柄。菌盖半球形，剖面扁平至马蹄形，深烟色至黑色，有同心纹和环棱，初期有微细绒毛，后变光滑、稍龟裂，硬而木质化，212cm321cm，厚1.510cm，边缘锐或钝，其下侧无子实层。菌肉深咖啡色、锈褐色或浅咖啡色，厚27mm。桑黄生于杨、柳、桦、桃等阔叶树的枯立木及立木上及树干上4。固因其着生树种不同，分为桑树桑黄、杨树桑黄和桦树桑黄等品种。其中，桑树桑黄子实体入药最佳。1.2.2桑黄的分布桑黄主要分布于中国、日本、菲律宾、澳大利亚、北美、中南美等地。在国内，桑黄分布于河北、山西、内蒙古、黑龙江、吉林、台湾、河南、广东、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆、四川、云南等地，即集中分布区在黑龙江省东部乌苏里江与兴凯湖之间，西北地区陕西与甘肃交界的“子午岭”自然保护区，国外主要在日本、韩国、俄罗斯等国家分布。1.3 桑黄的研究进展1.3.1桑黄药用功能的研究进展（1）抗肿瘤作用桑黄的抗癌功能最早被日本学者等发现，研究表明桑黄野生子实体的提取物对小鼠肉瘤180的抑制率为96.7%。研究还表明具有抗癌作用的物质是桑黄子实体中的多糖。（2）提高免疫力Hwan-Mook KIM等用P.linteus的菌丝体胞外多糖（EPS）进行免疫学实验，发现EPS不仅能够使T细胞增殖，而且对不同同类抗原的T细胞也有增殖作用，并且毒性T淋巴细胞的毒性在加桑黄胞外多糖（EPS）后大大增强。Yun-HeeShon等发现桑黄提取物可以诱导相解毒酶包括苯醌氧化还原酶（QR）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）的活性，并且提高了谷胱甘肽的水平。张万国5等对桑黄子实体提取物对人外周血单个核细胞（PMNCs）产生C-干扰素（IFN-C）的研究表明桑黄具有诱生IFN-C的能力，能显著增高小鼠的血清IFN-C水平，有利于其发挥调节机体免疫力，抑制肿瘤细胞增殖的作用。（3）抗突变作用Shon6等用桑黄提取物的抗突变实验中发现，提取物可有效的抑制诱变剂对沙门氏菌的诱变作用。 （4）抗血管生成试验Yun-SeonSong等在小鸡胚胎绒膜尿囊膜（CAM）试验中，发现随桑黄提取物加量的增加抑制效果增加，说明提取物有较好的抗血管生成活性。（5）清除自由基的功能Yun-SeonSong等在清除自由基1-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)的试验和体外抑制脂类过氧化反应的试验中，发现提取物有较好的清除自由基DDPH活性。（6）抑制黄嘌呤氧化酶活性（治疗痛风）Yun-SeonSong等在黄嘌呤氧化酶抑制试验中，发现提取物能够完全抑制尿酸（尿酸盐微结晶沉积于关节而引起局部粒细胞浸润及炎症反应的生成），有效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性。（7）肝纤维化抑制作用张万国等发现桑黄子实体提取物能显著降低血浆粘度和红细胞聚集指数，并且能提高肝损伤大鼠的蛋白质合成能力，显著降低血清氨基酸转移酶水平和胶原成分含量，使桑黄组肝细胞变性减轻，肝纤维增生减少。（8）抗脂质过氧化作用用CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中，脂质过氧化是其主要的肝损伤机制。模型组大鼠血清活性氧显著升高，肝组织脂质过氧化产物MDA大量生成SOD活性受到明显抑制。桑黄虽然不能明显减少MDA的生成，但可以一定程度提高SOD活性，并且使血清中活性氧明显降低，表现出较好的清除氧自由基作用。（9）降血糖作用Kim7等用桑黄多糖喂用链脲霉素导致的糖尿病大鼠，结果显示：桑黄多糖能够降低血糖，同时减少总胆固醇、三酰甘油和天冬氨酸转氨酶。这个结果让我们相信桑黄多糖在治疗人类糖尿病上将有所作为。（10）抗肺炎作用Beon-Su Jang8等用桑黄提取物预处理大鼠的实验中，发现桑黄提取物能够抑制肺炎大鼠炎症细胞包括嗜中性粒细胞的数量及白介素(IL)-1的水平。这个结果表明：桑黄提取物在抑制人类急性肺炎方面可能会有很大的作用。1.3.2桑黄化学成分的研究进展研究发现桑黄的菌丝体多糖和胞外多糖的分子量及分子结构是不同的。（1）子实体中的化学成分有资料报道P.1igniarius的菌体内含落叶松蕈酸(菌丝体内不含该成分)、藜芦碱、蘑菇酸、间位二甲氧苯二甲酸等脂肪酸、麦角甾醇、过氧化物酶、氨基酸等成分，还有报道说P.1igniarius中木质纤维素的生物转化。莫顺燕等首次从P.1igniarius中分离得到5个黄酮和2个香豆素类化合物，分别为柚皮素(4，5，7-三羟基二氢黄酮)、樱花亭(4，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮)、二氢莰非素(4，5，7-三羟基二氢黄酮醇)、7-甲氧基二氢莰非素(4，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮醇)、北美圣草素(3，4，5，7-四羟基二氢黄酮醇)、香豆素(苯并吡喃-2-酮)及莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基苯并吡喃-2-酮)；后来又分离得到两个新的二氢黄酮衍生物，分别为5，7，4-三羟基-6-邻羟苄基二氢黄酮和5，7，4-2三羟基-8-邻羟苄基二氢黄酮。Gi-Young Kim等在桑黄子实体中通过DEAE纤维素阴离子交换和凝胶层析提取得到一种酸性蛋白多糖，在琼脂糖凝胶CL-4B层析色谱分析中可以测得该多糖分子量在150kDa左右。其氨基酸种类主要有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸。用高压气相色谱仪测得该蛋白杂多糖中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、树胶醛醣和木糖组成，其中碳链主链为己糖，戊糖为小部分构成侧链。用红外吸收光谱分析其官能团，并进行1H和13C核磁共振测定。得知该多糖同时存在-糖苷键和-糖苷键，多糖以B-(13)-D-葡萄糖为主链，以B-(16)-D-葡萄糖为侧链，是一种蛋白杂多糖。（2）菌丝体及发酵液中的化学成分据资料报道，液体培养P.1igniarius菌丝体中含有甾醇类物质、虫草酸等，其液体发酵培养菌丝体中经分析得到二丁基羟基甲苯、棕榈酸、9，12-十八碳二烯酸甲酯、二十碳烷、二十六碳烷5种化学物质。Lee等实验发现桑黄胞外多糖有四种组分，分子量范围为940015000，其单糖成分主要由甘露糖(3%12%)、半乳糖(2%10%)、葡萄糖(80%95%)组成，该多糖还存在少量由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸组成的蛋白质。Hye-Jin Hwang等对桑黄胞外多糖的组分及分子结构作了进一步的研究，实验中用体积排除色谱(SEC)和多角度激光散射仪(MALLS)联用测定桑黄菌丝体胞外多糖(EPS)。实验中发现EPS中有三种组分(Fr-，Fr-和Fr-)。用气相色谱测定EPS组成得出EPS的三种组分为不含蛋白质部分的多糖，主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。根据洗脱体积对组分分布量的图中得出Fr-，Fr-和Fr-的分子量分别为433400(7801)Da，31470(283)Da和12950(90)Da，并计算出各组分的分子量分布，得出Fr-为多分散组分，分子量分布跨度较大，Fr-和Fr-为单分散组分，分子量分布跨度较狭窄。根据每时刻的组分分布量可得出各组分分子的均方根半径(RMS，分子重心到分子边缘的距离)。根据各组分的RMS对分子量的图，可知Fr-分子结构为球形，Fr-分子结构为无规则线团形，Fr-无定形。1.3.3桑黄的人工培养由于自然条件和自身生长周期长等因素的限制，野生的桑黄菌数量极其稀少，而且难以采集，为进一步研究和开发好桑黄，很有必要进行人工培养方面的研究工作。（1）桑黄子实体的人工栽培野生桑黄多生于杨、柳、桦、桃等阔叶树的枯立木及立木树干上，多年生。我国大部分地区均有分布，但产量很少。国内外各大药厂最近几年纷纷投入巨资研制桑黄系列抗癌新药，对桑黄的需求越来越大，价格越来越高，人工栽培桑黄菌，已成为当务之急。目前桑黄人工栽培在国内刚刚起步，国内仅有一家研究所在吉林省延吉市已与外商合作，引进桑黄菌种，于1995年6月至1996年6月进行了菌种驯化及出菇试验。但只是进行小面积试验栽培，生长期在1.52年。国内外市场对桑黄的需求越来越大，野生桑黄资源逐渐枯竭，远远不能满足市场需求10。（2）桑黄多糖的固体培养固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养 基质 表面生长，所以又称为表面培养。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。桑黄是丝状真菌，可进行生产规模的固体发酵。但大规模的固体发酵桑黄还未见报道。（3）桑黄多糖的液体培养液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。具体包括（1）浅层液体培养：在好氧微生物静止培养中常常将培养液装成浅层以增大培养液与空气的接触面积，使氧不至于成为限制因子；（2）利用摇床作三角瓶的液体振荡培养； （4）深层培养大规模液体培养都是采用更先进的深层培养。从深层液体培养器底部通入加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀喷出。由于天然的桑黄子实体很少，目前子实体的工栽培仅小批量获得成功，满足不了市场需求，能借助于菌丝体发酵来大量获得桑黄多糖，因此桑黄的深层发酵目前占主流地位。杨全采用液体发酵技术，人工培养获得了具有一定生物活性的菌丝体。而日本及韩国开发利用桑黄最早，并已开始人工栽培，批量生产。韩国通过试验获取了桑黄人工栽培的基本资料。韩国坡尔玛制药公司已率先开发出桑黄菌丝体培养法新技术，人工生产桑黄活性物质产品桑黄元。将桑黄的PL2、PL5等菌丝体放在特制培养罐中进行发酵，最后将其提取物用冻干法加工成粉末11。第2章 实验部分2.1桑黄菌丝液体培养工艺优化2.1.1桑黄培养条件的确定查阅相关文献，除碳源、氮源和pH值外，其它影响液体培养桑黄的发酵条件有无机盐、生长因子、培养温度、培养转速、培养基的装液量等，本实验具体设定的值如下。（1）无机盐无机盐是微生物生长所不可缺少的物质。其主要功能是：构成细胞的组成成分；作为酶的组成成分；维持酶的活性；调节渗透压，氢离子浓度和氧化还原电位；作为某些自养菌的能源12。对于真菌来说，液体培养基中缺乏磷、硫、钾、镁，菌丝体生长发育不良，菌丝体产量低。其中磷是合成核酸、磷脂、一些重要的辅酶（NAD，NADP，辅酶A等）及高能磷酸化合物的重要原料。硫是蛋白质中某些氨基酸（如半胱氨酸和蛋氨酸）的组成成分，也是谷胱甘肽的组成成分。钾不参加细胞结构物质的组成，但它是细胞是重要的阳离子之一。它是许多酶的激活剂，也与原生质的胶体特性和细胞膜的透性有关。镁是一些酶（如已糖激酶，异柠檬酸脱氢酶，羧化酶等）的激活剂；镁还起到稳定核糖体、细胞膜和核酸的作用。但这四种元素对菌丝体生长作用大小不存在显著差异，同等重要。本实验选取常用的磷酸二氢钾和硫酸镁作为矿物质元素添加。少量微量元素往往也是与酶活性有关，或参与酶的组成，或是许多酶的调节因子。铁是过氧化氢酶、乳酸脱氢酶、细胞色素氧化酶的组成元素；钴参与维生素B12的组成；铜是多酚氧化锌酶和抗坏血酸氧化酶的成分；锌是肽酶和脱羧酶等的辅助因子等。在本实验中，用自来水配制成培养基，就可满足桑黄生长对铁、钴、铜、锌等微量元素的需要。所以，本实验的无机盐具体用量为：磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%，用自来水配制。（2）生长因子生长因子为某些微生物不能从普通的碳源、氮源合成，而需要另外少量加入来满足生长有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌 呤和嘧啶碱及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸及其他膜成分。必须指出的是各种微生物所需的生长因子互不相同。真菌是维生素B1、维生素B2的天然缺陷型，必须外界添加才能生长良好。维生素B1、维生素B2对真菌的生长相当重要，他们以一种辅酶的形式存在，对菌丝的生长起促进的作用。而他们的需要量甚少。根据杨全等13人的试验结果，在液体培养基中，当维生素B1的用量20g/100mL，维生素B2用量30g/100mL时，菌丝体的产量最高。因此在本实验中维生素B1的用量20g/100mL、维生素B2用量30g/100mL。（3）培养温度温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面，随着温度的升高，细胞内酶反应速度加快，代谢和生长也相应的加快；另一方面，随着温度进一步增高，生物活性物质（如蛋白质、核酸等）发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。而且，温度是保证酶活性的重要条件。微生物的生长和产物合成均需在其各自适合的温度下进行13。温度对桑黄菌丝产量的影响较大，对液体培养而言，桑黄菌丝体生长的最适温度是301，所以本实验在30下培养桑黄。（4）转速在摇瓶培养过程中，转速对菌丝体的生长也有很大的影响。转速太低，菌球形成数量少，导致单个菌球长势过大，菌球中间出现中空状态，而且出现菌丝体自溶现象，另一方面培养基内的溶解氧减少，则桑黄菌菌丝球内部生长不足，结果菌丝体产量降低。转速过高，桑黄的菌丝短，而且培养基容易飞溅到棉塞上引起污染，对设备和电能都有损耗，造成不必要的人力、物力等的浪费。根据胡文彬等人报道，130r/min是培养桑黄的合适转速。本实验采用的转速是130r/min。（5）培养基装量培养基的装量不仅影响着摇瓶中溶解氧的含量，还会影响微生物生长的营养。装液量过多会影响菌丝体的好氧需求，从而影响菌丝的产量，而装液量过少，菌丝体所能吸收利用的营养不足而影响菌丝的产量。陈瑞蕊等的实验表明250mL的锥形瓶装70mL时的菌丝体产量最高。本次实验采用250mL的锥形瓶，其中培养基的装量为70mL。2.1.2测定方法（1）菌丝体干重的测定发酵液用布氏漏斗过滤，蒸馏水冲洗菌丝体3次，冲洗干净后，转入已知重量的培养皿中，置60烘箱烘干至恒重，称量。（2）胞外粗多糖重量的测定过滤后滤液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95的酒精，4沉淀24h，离心后取沉淀，置60真空干燥箱至恒重，称重。（3）胞内粗多糖重量的测定取干燥的菌丝粉碎，置90热水中浸提2h，离心后取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95的酒精，4沉淀24h，离心后取沉淀，置60真空干燥箱至恒重，称重14。2.1.3 实验材料（1）菌种本实验采用的是由长白山桑黄子实体分离纯化得到的桑黄菌种。（2）原料与药品土豆、玉米粉、可溶性淀粉、蛋白胨、黄豆粉、酵母浸出汁、葡萄糖、蔗糖、乳糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、维生素B1、维生素B2、硫酸铵，具体规格见表2.1-1。表2.1-1主要药品名称级别、规格生产厂家氢氧化钠AR，500g/瓶山东省化工研究院磷酸二氢钾AR，500g/瓶沈阳市新西试剂厂七水硫酸镁AR，500g/瓶天津市化学试剂一厂葡萄糖AR，500g/瓶天津市化学试剂三厂蔗糖AR，500g/瓶天津市化学试剂三厂乳糖AR，500g/瓶天津市化学试剂一厂可溶性淀粉AR，500g/瓶沈阳市新西试剂厂黄豆饼粉AR，500g/瓶天津市北方化玻购销中心蛋白胨AR，500g/瓶天津市大茂化学仪器供应站琼脂粉AR，500g/瓶天津市珠江卫生材料厂酵母浸出汁500g/瓶上海冠生园添加剂制品有限公司维生素B1市售东北制药总厂维生素B2市售吉林省辽源亚东药业股份有限公司土豆市售吉林玉米粉市售吉林（3）实验仪器灭菌锅、无菌操作台、恒温生化培养箱、电热鼓风干燥箱、旋转式摇床、试管、锥形瓶、培养皿等，具体见表2.1-2。表2.1-2 主要仪器名称型号、规格生产厂家立式压力蒸汽灭菌锅LS-B50L上海华线医用核子仪器有限公司垂直净化工作台SP-DJ系列上海浦东物理光学仪器厂双人双面净化工作台SW-CJ-2F型苏州净化设备有限公司恒温生化培养箱LRH-250A广东省医疗器械厂电热鼓风干燥箱CS101-2AB重庆试验设备厂三角瓶250mL长春市玻璃仪器厂回转恒温调速摇瓶柜HYG-A余姚市金电仪表有限公司培养皿9、15cm天津市玻璃仪器厂烧杯25mL-500mL天津市玻璃仪器厂量筒100、500mL天津市玻璃仪器厂2.1.4试验过程（1）活化菌种将原种在无菌条件下接到PDA固体培养基上进行活化。配制PDA培养基（按表2.1-3的配方配制）。以配制500Ml PDA为例：将土豆去皮、去芽眼，切成丝后，称100g置于1000mL搪瓷缸中，加入200300mL自来水后，于电炉上煮沸30min。在此过程上，注意用玻璃棒搅拌以防止糊底。待土豆汁稍冷却后，用四层纱布过滤。取其滤液，并在滤液中加入1.5g磷酸二氢钾、0.75g硫酸镁、0.1g维生素B1、0.15g维生素B2，充分溶解后加自来水至500mL，加入5g琼脂粉，煮沸。注：本实验中所有的培养基都加入维生素B1和维生素B2，其配比分别为20g/100mL和30g/100mL。表2.1-3 PDA固体培养基配方品名葡萄糖土豆KH2PO4MgSO4琼脂pH配比(g/100mL)2200.30.150.5自然分装：煮沸后趁热分装于试管内，管口塞上棉塞并用牛皮纸包好。装入试管中的培养基量应为试管高度的1/5。注意，分装的时候，不要将培养基洒在试管口，棉塞上尤其不能沾有培养基，否则容易染菌。灭菌：本实验中采用高压蒸气灭菌法灭菌。制作斜面：趁热摆斜面，冷却凝固后即为斜面培养基。在无菌的环境下接种：将接完种的试管再次用牛皮纸包好，放入生化培养箱中，于32下培养。（2）固体扩大培养实验按照表2.1-3配制PDA固体培养基：步骤如（1）中步骤。分装：将培养基分装到250mL锥形瓶中，为了使灭菌的效果好，装入锥形瓶的培养基量最好不要超过培养基容积的一半。塞上棉塞，用牛皮纸包扎好。灭菌：在压力为0.1MPa、温度为121的情况下灭菌20min，与此同时，将70个培养皿和接种针也灭菌。具体步骤见2.3.1中步骤3。制作平板：在无菌操作台上将倒平板，冷却凝固。平板中倒入的培养基量要适当，培养基太少会导致所培养菌种营养不良，而太多则会造成营养的浪费。接种：在火焰旁完成接种。将接完种的培养皿用牛皮纸包好，放入生化培养箱中，于32下培养。（3）液体种子摇瓶培养按照表2.1-4配制2L液体种子培养基，分装于250mL的锥形瓶中，每个装液量为70mL，在压力为0.1MPa、温度为121的情况下灭菌20min。表2.1-4液体种子培养基配方品名葡萄糖酵母膏蛋白胨KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)20.20.20.20.1将灭好菌的物品放入无菌操作台中，并将酒精灯等用酒精棉擦拭后也放在无菌操作台上。点燃酒精灯，在无菌操作台中的火焰旁接种。接种完毕后，将锥形瓶放在摇床中培养，培养条件为：温度30、转速为130rpm。培养5天即得液体种子。（4）桑黄菌丝体生长曲线和多糖积累曲线实验按照表2.1-5配制5L PDA液体培养基，分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。灭菌，接种，于温度30、转速为130rpm下培养，并开始计时。表2.1-5 PDA液体培养基配方品名葡萄糖土豆KH2PO4MgSO4pH配比(g/100mL)2200.30.15自然桑黄培养3天（即72小时）时，取5瓶未染菌的桑黄培养液。a.菌丝体干重的测定：发酵液用布氏漏斗过滤，蒸馏水冲洗菌丝体3次，冲洗干净后，转入已知重量的培养皿中，置60烘箱烘干至恒重，称量。根据公式2-1可得出菌丝体干重。m菌丝体m菌丝体2m菌丝体11000705 公式2-1m菌丝体1：盛菌丝体的培养皿质量，g；m菌丝体2：干燥后的菌丝体和培养皿质量，g；m菌丝体：1L培养液中菌丝体的干重，g。b.胞外粗多糖重量的测定：过滤后滤液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95%的酒精，4沉淀24h，离心后将沉淀转入已知重量的培养皿中，置60真空干燥箱至恒重，称重。根据公式2-2可得出胞外粗多糖重量。m胞外多糖m胞外多糖2m胞外多糖11000705 公式2-2m胞外多糖1：盛胞外多糖的培养皿质量，g；m胞外多糖2：干燥后的胞外多糖和培养皿质量，g；m胞外多糖：1L培养液中胞外多糖的质量，g。c.胞内粗多糖重量的测定：取干燥的菌丝粉碎，置90热水中浸提2h，离心后取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95的酒精，4沉淀24h，离心后将沉淀转入已知重量的培养皿中，置60真空干燥箱至恒重，称重。根据公式2-3可得出胞外粗多糖重量。m胞内多糖m胞内多糖2m胞内多糖11000705 公式2-3m胞内多糖1：盛胞内多糖的培养皿质量，g；m胞内多糖2：干燥后的胞内多糖和培养皿质量，g；m胞内多糖：1L培养液中胞内多糖的质量，g。用同样的方法，每隔2天（48小时）测一次桑黄菌丝体的干重、胞外粗多糖及胞内粗多糖的质量。连续测13天（312小时）。5.此实验要进行三次重复实验，菌丝体干重、胞内、外多糖质量均为三次实验的平均值。（5）液体培养基初始pH的筛选影响实验对初始pH分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5进行筛选。按照表2-6，配制2L PDA液体培养基，然后平均分成五份，每份400mL，用稀盐酸或稀氢氧化钠分别调pH为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。将各培养基分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。在压力为0.1MPa、温度为121的情况下灭菌20min，冷却后接种，并于温度30、转速为130rpm下在摇床中培养。培养7天，按照2.3.4中步骤2的操作，计算出各种培养基中菌丝体的干重。此实验要进行三次重复实验。桑黄菌丝体的干重为三次重复实验的平均值。（6）桑黄培养基碳源筛选实验对葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、小麦粉和玉米粉五种碳源进行筛选。配制五种培养基，其碳源分别为葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉，配比都为3%，其余物质见表2.1-6。配制培养基时，首先要将碳源、蛋白胨以及各无机盐和维生素都溶于水中，最后将水定容至所需体积即可。表2.1-6不同碳源的培养基配方品名蛋白胨KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)10.30.15将各培养基分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。在压力为0.1MPa、温度为121的情况下灭菌20min后冷却接种，于温度30、转速为130rpm下在摇床中培养。培养7d，按照2.1.2中步骤操作，称出各种培养基中菌丝体的干重。此实验进行三次重复实验。菌丝体干重为三次实验的平均值。（7）桑黄培养基氮源筛选实验对土豆、蛋白胨、黄豆饼粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH4)2SO4进行筛选。配制四种培养基，其氮源及配比分别为土豆（20%）、蛋白胨（1%）、黄豆饼粉（1%）、牛肉膏（0.8%）+酵母浸出汁（0.2%）和(NH4)2SO4（1%），其余物质见表2.1-7。配制培养基时，首先要将碳源、蛋白胨以及各无机盐和维生素都溶于水中，最后将水定容至所需体积即可。表2.1-7不同碳源的培养基配方品名玉米粉KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)30.30.15将各培养基分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。灭菌后接种，于温度30、转速为130rpm下在摇床中培养。培养7天，按照2.1.2中步骤操作，计算出各种培养基中菌丝体的干重。此实验要进行三次重复实验。菌丝体干重为三次实验的平均值。（8）优化培养基验证实验由以上实验可知：最优碳源为玉米粉、最优氮源为黄豆饼粉、最适pH在5.56.5之间。利用优化得来的结果，按照表2.1-8配制培养基，分装，在压力为0.1MPa、温度为121的情况下灭菌20min，待冷却后接种，并在温度为30、转速为130r/min的条件下用摇床培养7天后，按照2.3.4中步骤操作测桑黄菌丝体的干重。重复三次实验，桑黄菌丝体干重为三次重复实验的平均值。与此同时，用PDA液体培养基作为对照组，并重复三次实验。表2.1-8 优化培养基的配方品名玉米粉黄豆饼粉KH2PO4MgSO4维生素B1维生素B2pH配比(g/100mL)310.30.150.020.035.56.52.2多糖提取工艺优化2.2.1乙醇浓度对多糖收率的影响（1）培养液浓缩 将培养液定量，用反渗透膜浓缩为原体积的1/2，浓缩压力0.5MPa。反渗透膜浓缩操作：接通电源，电源指示灯亮，打开工作泵，调节浓缩液调压阀将压力调节到0.5 Mpa，开始工作。（2）向浓缩后的培养液加入原体积3倍的乙醇，产生灰白色沉淀，将上述提取液放入冷藏柜，在4下静置一夜。以发酵液中多糖含量为依据，改变乙醇的浓度，以确定最佳提取工艺。见表2.2-1。表2.2-1 改变乙醇浓度组别123乙醇浓度（%）758595（3）将上述提取液用离心机分离，3000r/min，离心10min，得到桑黄多糖，离心得到上清液（乙醇）回收。（4）将离心所得沉淀（桑黄多糖）用冷冻干燥机中干燥，得到的产品用精密电子天平称量，记录数据。2.2.2胞内多糖提取实验优化采用单因素实验法，选择影响提取多糖含量的3个主要因素煎煮时间、固液比和水煮次数，其他因素不变，称取等量的干菌丝体粉末，每个因素3个水平，以提取多糖的质量为标准，对比分析，从而优化得到菌丝体提取多糖的最佳工艺。步骤 ：（1）将分离出来的菌丝体放入恒温干燥机中，在6065下干燥； 恒温干燥机的操作：首先插上电源，打开开关，设定干燥的温度，干燥菌丝体需要60，同时设定温度的上限65，将预备干燥的菌丝体用器皿装好，放入干燥箱中，关闭干燥箱门，按下接通按钮，开始干燥。（2）干燥结束，将菌丝体研磨成粉状，然后称取9份等量的菌丝体粉末4.0g，进行优化实验。分别按照表2.2-2、表2.2-3和表2.2-4的设计进行蒸煮实验。表2.2-2 改变水煮时间组别123水煮时间（h）11.52表2.2-3 改变水煮次数组别456水煮次数（次）123表2.2-4 改变固液比组别789固液比1:7.51:101:12.5将水煮液3000r/min离心10min，分离得到上清液。将上述上清液用反渗透膜浓缩为原体积的1/2，操作同上。下面用胞外多糖提取的方法提取菌丝体多糖并记录数据及结果。2.2.3超声波处理时间对多糖收率的影响本实验将除时间外的其他提取